海軍潛艇官兵代謝指標(biāo)與腸道菌群關(guān)聯(lián)研究

郭妍，滿艷茹，劉超乾

隨著我海軍艦艇編隊走向“深藍”逐漸形成常態(tài)化，海軍官兵平戰(zhàn)時任務(wù)增加。潛艇官兵更是由于長時間作業(yè)環(huán)境特殊，如長期處于狹小和密閉的空間中，活動量少、飲食種類較少、缺乏新鮮蔬果、暴露于高溫高濕以及搖擺、有噪音和有害氣體、空氣流通不暢等不良因素對官兵健康產(chǎn)生一定影響。近期研究發(fā)現(xiàn)海勤官兵高尿酸血癥、高脂血癥等代謝性疾病患病率有增高趨勢，高于正常健康人群比例［1-2］。腸道菌群參與機體代謝和能量平衡的調(diào)節(jié)，包括與糖脂代謝、嘌呤和尿酸代謝相關(guān)的能量攝取、利用和消耗，在某些因素致腸道微生態(tài)失衡的情況下，對各種代謝性疾病的發(fā)生等具有潛在致病作用［3］。深入研究腸道微生物與代謝性疾病的關(guān)系，有望使其成為防治高尿酸和高血脂等海軍常見代謝性疾病的作用靶點。本研究初步隨機抽取某部潛艇官兵（任務(wù)時長3個月以上者）和相匹配的健康人群作對比，進行血清生化檢測及腸道菌群多樣性分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機抽樣選擇某部潛艇官兵（任務(wù)時長3月以上）共30人作為研究組，均為男性，年齡（28.13 ±6.02）歲，體重指數(shù)（BMI）23.84 ± 1.95，并隨機選取同期健康體檢男性30人作為對照組，年齡（29.03 ±12.26）歲，BMI 23.43 ± 2.99。

1.2 研究方法

1.2.1 血清生化指標(biāo)的檢測 采集2組清晨空腹靜脈血，其中研究組在任務(wù)結(jié)束后第2～3天統(tǒng)一采集血清樣本，測定血常規(guī)及血生化指標(biāo)，對指標(biāo)異常者按發(fā)生率進行分組統(tǒng)計。血清樣本生化指標(biāo)通過生化自動分析儀（Hitachi 7600A）進行檢測，包括血尿酸（SUA）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.2.2 糞便標(biāo)本的收集 2組均于清晨早餐前采集糞便樣本，其中研究組在任務(wù)結(jié)束后第2～3天統(tǒng)一采集糞便樣本，樣本裝入無菌的塑料管中，并置于-80℃冷凍儲存，用E.Z.N.A Bacteria DNA kit提取微生物樣本基因組DNA。

1.2.3 腸道菌群基因組提取和測序 根據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA kit （Omega Bio-tek， Norcross，GA， U.S.）說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；對16S rRNA基因V3～4可變區(qū)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增（PCR儀，ABI GeneAmp? 9700 型）。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City， CA， USA）進行回收產(chǎn)物純化，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus? Fluorometer（Promega， USA）對回收產(chǎn)物進行檢測定量。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.4 腸道細(xì)菌微生物多樣性數(shù)據(jù)分析及組間比較 測序結(jié)果用美吉云平臺分析軟件分析，重點比較2組腸道細(xì)菌微生物多樣性差異、產(chǎn)SCFAs的菌種、前期公認(rèn)的益生菌的豐度及多樣性變化，尋找特殊差異性菌屬。將2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌屬與血清代謝成份作Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)性。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和%表示，組間比較采用χ2檢驗。熱點圖用R（version 3.3.1）繪制。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 代謝性疾病患病情況

研究組與對照組的代謝指標(biāo)見表1。其中研究組舒張壓低于對照組（P＜0.05），而血尿酸、血紅蛋白及TC等代謝指標(biāo)平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究組超重人數(shù)為15例，占總?cè)藬?shù)的50%；肥胖人數(shù)為0例；未檢出高血壓及血糖異常者；高尿酸血癥5例，占總?cè)藬?shù)的16.7%；高TC血癥3例，占總?cè)藬?shù)的10%；高TG血癥5例，占總?cè)藬?shù)的16.7%。與對照組相比，上述代謝異常的患病比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 研究組與對照組相關(guān)代謝指標(biāo)比較（±s，每組n=30）

表1 研究組與對照組相關(guān)代謝指標(biāo)比較（±s，每組n=30）

注：TC為血清總膽固醇，TG為血清總?cè)８视?，BMI為體重指數(shù)；1 mmHg=0.133 kPa

組別對照組研究組P值BMI 23.43 ± 2.99 23.84 ± 1.95 0.527 TG（mmol/L）1.62 ± 1.03 1.40 ± 0.46 0.292收縮壓（mmHg）122.03 ± 8.22 118.83 ± 7.56 0.122舒張壓（mmHg）72.35 ± 6.23 68.30 ± 5.32 0.006 UA（μmol/L）297.47 ± 76.48 378.07 ± 71.08＜0.001 Hb（g/L）146.70 ± 10.33 154.77 ± 10.80 0.005 TC（mmol/L）4.30 ± 0.84 4.79 ± 0.61 0.012

表2 研究組與對照組官兵代謝相關(guān)患病情況比較［例（%）］

2.2 腸道菌群多樣性差異

2.2.1 2組糞便腸道菌群Beta多樣性分析 Beta多樣性分析通過對不同生境或微生物群落間的物種多樣性進行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。非度量多維尺度（NMDS）分析是常用的一種。分別分析門水平和種水平的NMDS，基于NMDS的分析的2組樣本的聚類圖可知組內(nèi)人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，但是2組間呈現(xiàn)出高度的聚類現(xiàn)象，且2組分別在門水平（圖1A）和屬水平（圖1B）上均體現(xiàn)了差異性（P＜0.01）。見圖1。

圖1 研究組與對照組腸道菌群多樣性NMDS分析比較

2.2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 2組測序結(jié)果絕大部分reads分屬下列5個門：擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），其中厚壁菌門在2組中豐度均為最高（圖2A）。進一步細(xì)分至門以下水平比較可見2組的菌群分種也有一定差異（圖2B）。研究組腸道菌群中的厚壁菌門豐度則明顯高于對照組（64.88%vs.53.33%，P＜0.05），擬桿菌門和變形菌門在對照組中的豐度高于研究組（29.87%vs. 10.46%，P＜0.05）。門以下水平中研究組以棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）（17.78%vs.5.35%，P＜0.05）和普氏棲糞桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）所占比重最大（17.61%vs.5.26%，P＜0.05），其次是大腸桿菌志賀菌（Escherichia-Shigella）在研究組中也有優(yōu)勢豐度（8.93%vs.5.21%，P＜0.05）。見表3。

表3 研究組組腸道菌群臨床指標(biāo)與屬水平關(guān)聯(lián)分析比較

圖2 研究組與對照組腸道菌群門結(jié)構(gòu)和屬結(jié)構(gòu)組成比較

表3 研究組與對照組腸道菌群組成差異比較（±s）

表3 研究組與對照組腸道菌群組成差異比較（±s）

菌名厚壁菌門擬桿菌門擬桿菌屬棲糞桿菌屬普氏棲糞桿菌大腸桿菌志賀菌對照組（n=30）53.33 ± 20.15 29.87 ± 24.65 19.71 ± 20.88 5.35 ± 5.86 5.26 ± 5.80 5.21 ± 11.24研究組（n=30）64.88 ± 15.70 10.46 ± 9.11 7.67 ± 7.88 17.78 ± 11.05 17.61 ± 10.96 8.93 ± 11.13 P值0.034＜0.01 0.015 0.002＜0.01 0.001

2.2.3 臨床代謝指標(biāo)與腸道菌群變化的關(guān)聯(lián)分析 為進一步探索研究組相關(guān)臨床代謝指標(biāo)與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化關(guān)聯(lián)，通過計算臨床因子與所選物種之間的相關(guān)性系數(shù)（Spearman等級相關(guān)系數(shù)），將獲得的數(shù)值矩陣通過熱點圖直觀展示。見圖3。可以看出，菌屬豐度前3位的菌與大多數(shù)指標(biāo)均有顯著關(guān)聯(lián)，擬桿菌屬與BMI和TC水平均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.32和r=-0.33，P＜0.05），棲糞桿菌與舒張壓、血尿酸及TC水平呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.26，r=0.30和r=0.28，P＜0.05），布勞特氏菌（Blautia）也與BMI及TC水平呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.28和r=0.32，P＜0.05）。

圖3 研究組腸道菌群臨床指標(biāo)與屬水平關(guān)聯(lián)分析熱點圖

3 討論

海軍官兵代謝紊亂發(fā)生情況備受關(guān)注，近期針對海勤官兵大規(guī)模的研究發(fā)現(xiàn)，血液生化指標(biāo)異常發(fā)生率前3位分別為血常規(guī)（34.7%）、高尿酸血癥（28.7%）、高脂血癥（24.2%）［1］，2014-2018年度某部長航船員3 731例次體檢報告［2］顯示，高尿酸血癥457例（12.2%）、高脂血癥631例（16.9%），均遠遠高于正常健康人群比例。同時高尿酸血癥和高脂血癥短期內(nèi)增加長航官兵罹患膽道結(jié)石、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、痛風(fēng)等疾病的風(fēng)險，這也與近期長遠航海勤人員中結(jié)石發(fā)病率增高是一致的［2,4］，是短期致戰(zhàn)斗力和作業(yè)能力下降的原因之一。長期效應(yīng)看，高尿酸和高血脂都是心腦血管疾病的重要危險因素，也是加重慢性腎臟病高危因子，一定程度降低戰(zhàn)斗力的同時也增加了部隊長期醫(yī)療投入負(fù)擔(dān)。國內(nèi)探討潛艇官兵代謝性疾病的研究不多，徐帥等［5］分別從2017與2018年在臨潼康復(fù)療養(yǎng)中心進行特勤療養(yǎng)的969名潛艇官兵中隨機抽樣調(diào)查顯示，連續(xù)2年海軍潛艇官兵高膽固醇血癥和血尿酸異常的發(fā)病率依然高于中國成年男性總發(fā)病率。

本研究為初步探索腸道菌群與代謝患病的關(guān)聯(lián)，隨機抽取病例數(shù)較上述研究都少，重點關(guān)注統(tǒng)計了超重肥胖、高血壓、高血糖、高尿酸及血脂異常等代謝紊亂，雖然患病率與健康對照者比未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但仍可看到血尿酸、血紅蛋白及TC等代謝指標(biāo)水平均高于對照組。

近年來發(fā)現(xiàn)，腸道菌群參與機體代謝和能量平衡的調(diào)節(jié)，以腸道菌群作為切入點來探索相關(guān)疾病的發(fā)病機制已成為目前國際上的新熱點，尤其是代謝性疾病等的發(fā)病機制。目前有研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥、高脂血癥患者體內(nèi)存在腸道菌群失調(diào)［6-8］。此外，降尿酸、降脂治療后腸道菌群可發(fā)生改變，并且益生菌可能具有降尿酸作用［9］。目前降尿酸的主要藥物是黃嘌呤氧化酶抑制劑和促尿酸排泄藥，降血脂主要為他汀和貝特類藥物，然而這些藥物都存在一定不良作用。在我軍的醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)目前一定程度上存在“重醫(yī)療、輕預(yù)防”“重體檢、輕管理”的現(xiàn)狀下，深入研究腸道微生物與代謝性疾病的關(guān)系，有望使其成為防治高尿酸和高血脂等部隊常見代謝性疾病的新的作用靶點。

潛艇中特殊生活環(huán)境因素會影響腸道菌群的代謝產(chǎn)物從而影響腸道菌群的構(gòu)成和功能變化。呂偉［9］使用高通量測序技術(shù)對長遠航任務(wù)官兵腸道菌群進行測序發(fā)現(xiàn)，任務(wù)官兵腸道菌群多樣性不斷降低，致病菌數(shù)量多于健康人群，而擬桿菌類有益菌低于健康人群等特點。周典蓉等［10］研究發(fā)現(xiàn)長遠航作業(yè)人員作業(yè)前后口腔頰黏膜共生菌群改變；鄭巍薇等［11］采集長遠航作業(yè)人員作業(yè)前后臍周微生物樣本，經(jīng)測序分析也發(fā)現(xiàn)菌群多樣性減小及厚壁菌門相對豐度升高、變形菌門相對豐度降低等結(jié)構(gòu)改變，對長遠航作業(yè)者的健康狀況有一定反映。以上研究均探索了任務(wù)人員不同部位微生物生態(tài)環(huán)境的結(jié)構(gòu)改變，目前尚沒有專門針對潛艇官兵腸道菌群與代謝性疾病關(guān)聯(lián)的相關(guān)研究。

本研究以隨機抽取潛艇人員（任務(wù)時長3月以上者）和相匹配的健康人群作對比，腸道菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn)2組腸道菌群分別在不同的細(xì)菌結(jié)構(gòu)分類水平均體現(xiàn)了差異性（P＜0.01）。任務(wù)官兵腸道菌群中的厚壁菌門豐度則高于對照組，而擬桿菌門和變形菌門的豐度則低于對照組，早在2006年國外就有研究發(fā)現(xiàn)與肥胖、胰島素抵抗等代謝紊亂相關(guān)的腸道菌群特征，即厚壁菌門與擬桿菌門的比例升高［12］。本研究中研究組超重、血脂異常等指標(biāo)較對照組是有一定增高的表現(xiàn)，也符合了菌群的這一改變。另外可以看出，研究組另一富集的棲糞桿菌屬及其下屬的普氏棲糞桿菌種近年來逐漸被重視，被報道為人體腸道的優(yōu)勢健康菌群，可代謝產(chǎn)生丁酸鹽從而促進上皮生長，同時與人體肥胖、糖尿病及宿主的消化道疾病如炎癥性疾病、結(jié)腸癌等疾病等均有關(guān)聯(lián)。普氏棲糞桿菌已被作為一種潛在益生菌被作為預(yù)防或治療肥胖、糖尿病及腸道疾病的靶點。該研究觀察到某部潛艇官兵該類細(xì)菌的豐度增加與國家和軍隊近幾年對于海勤人員的關(guān)心，包括飲食調(diào)整、保健干預(yù)措施的加強相關(guān)，且各級醫(yī)療部門對基層官兵的健康問題愈加重視，經(jīng)常開展普查體檢與健康知識講座，使官兵的健康意識得到提高，更注重合理膳食。然而目前尚沒有明確證據(jù)表明任務(wù)官兵腸道內(nèi)丁酸豐度的變化情況，因而這一部分有待于代謝組學(xué)的進一步研究。

本研究進一步將潛艇官兵腸道菌群結(jié)構(gòu)特征改變與相關(guān)臨床代謝指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)豐度較大的主要菌群改變與多個臨床因子之間是有顯著關(guān)聯(lián)的，此次雙歧桿菌屬（Bifidobacterrium）等明星益生菌雖然未在2組間觀察到差異，但其所在的擬桿菌屬則檢出與BMI和TC水平均呈現(xiàn)負(fù)向關(guān)聯(lián)，預(yù)示著其中有某種益生菌的成份在起作用，有待后續(xù)進一步宏基因組學(xué)研究來尋找菌群差異所引起的關(guān)鍵代謝通路的改變，為進一步尋找特殊海戰(zhàn)環(huán)境下官兵代謝健康干預(yù)的靶點提供理論依據(jù)，保障官兵健康。