楊志陽 熊超超 喬奇 林潤瑞 葉光斌

摘 要：以雞冠刺桐（Erythrina crista-galli）花瓣為研究材料，通過單因素及正交試驗優(yōu)化色素提取條件;通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC）技術(shù)對色素粗提物的黃酮類物質(zhì)組成進(jìn)行相關(guān)定性、定量研究。結(jié)果表明：雞冠刺桐花色素提取的最佳條件為：以pH為6的50%乙醇為浸提劑，在70℃中水浴60min，輔以100%（40KHz）超聲功率處理40min時，色素中總黃酮（以蘆丁計）的提取率最高;提取率最高可達(dá)71.2mg/g干花，比初始提取條件提高了3.34倍。雞冠刺桐花色素內(nèi)至少含有37種黃酮類化合物（相對含量低于0.1%的色素成分不計），它們分別是黃酮類（占82.16%）、黃酮醇類（占6.15%）、黃烷酮類（占6.07%）和花青素類（占3.08%），其中芹菜素衍生物類的黃酮是雞冠刺桐花色素的主要成分，占比達(dá)到71.6%，表明雞冠刺桐花色素有著重要的藥用開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞：雞冠刺桐;花色素;提取條件;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;黃酮成分

中圖分類號 S681.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）02-0027-06

Abstract： The petals of Erythrina crista-galli were used as research materials， the pigment extract condition was optimized by single factor test and orthogonal test. The qualitative and quantitative research of components of flavonoids in the crude pigment extract were studied by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS）. The results showed that the optimum extraction condition of flower pigment of Erythrina crista-galli was as follows： the extraction rate of total flavonoids （calculated by rutin） was the highest when 50% ethanol with pH 6 was used as the extractant， water bath at 70 ℃ for 60 min and ultrasonic power at 100% （40KHz） for 40 min; The highest extraction rate was 71.2mg/g dry flower， which was 3.34 times higher than the initial extraction conditions. The results of pigment composition showed that there were at least 37 flavonoids （pigment components with relative content less than 0.1% were not calculated） in the flower pigment of Erythrina crista-galli， which were flavonoids （82.16%）， flavonols （6.15%）， flavanones （6.07%） and anthocyanins （3.08%）. Among them， apigenin-derived flavonoids were the main component of the flower pigment， accounting for 71.6%. The results show that the flower pigment of Erythrina crista-galli have important medicinal development value.

Key words： Erythrina crista-galli; Flower pigment; extract condition; UPLC-MS-MS; Flavonoids component

1 前言

刺桐屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）植物，刺桐屬約有200種，多分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。刺桐屬植物不僅具有觀賞性，還具有重要的藥用價值[2]。國內(nèi)外學(xué)者在刺桐屬植物中分離得到了上百個生物堿成分[3-6]，為該類生物堿的結(jié)構(gòu)研究及藥物開發(fā)利用提供了物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。唐崢嶸等[7]總結(jié)了刺桐屬植物的生物堿類成分在藥理方面的研究，其中主要是抗焦慮，促進(jìn)睡眠，抗痙攣，殺蟲和抗乙酰膽堿酯酶等作用。除生物堿外，刺桐屬植物還含有大量的黃酮類化合物[8-10]。

近年來，隨著人們對健康生活的不斷追求，植物來源天然色素的提取與應(yīng)用開發(fā)研究越來越多[11-13]。廣義的黃酮類化合物是指2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，基本母核為2-苯基色原酮;黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基和異戊烯基等官能團，所以根據(jù)連接位置、氧化程度、是否成環(huán)等的不同，將黃酮類化合物分為黃酮（即狹義的黃酮）、黃酮醇、異黃酮、查耳酮、黃烷酮、花青素和橙酮等七個亞類[14]。丁利君等[12]對刺桐花色素的提取條件及色素穩(wěn)定性開展了相關(guān)研究。Nouran M. Fahmy等人[13]對從刺桐屬植物中分離出的370多種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性進(jìn)行了研究總結(jié)，闡明了刺桐屬植物的黃酮類成分，可作為治療各種疾病的先導(dǎo)化合物，包括氧化應(yīng)激、炎癥、糖尿病和癌癥等。

雞冠刺桐（Erythrina crista-galli）原產(chǎn)于巴西，在中國臺灣、云南（西雙版納）、廣東、四川等均有栽培?；ㄉ珵槌燃t色，花形獨特，花期長，可達(dá)3個月[1]，是一種良好的天然紅色素。目前未見雞冠刺桐花色素提取條件優(yōu)化及花色素成分特別是黃酮類成分的相關(guān)研究。本試驗選取在四川地區(qū)行道樹、校園、公園等地具有廣泛分布的雞冠刺桐為研究對象，通過單因素和正交試驗，優(yōu)化刺桐花色素的提取條件，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，對其紅色素提取液的組成成分進(jìn)行定性和定量分析，為進(jìn)一步推進(jìn)珊瑚刺桐花色素的開發(fā)與利用提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗樣本及前處理方法 雞冠刺桐花鮮花與干燥花對比如圖1，a為采摘前，b為烘干前，c為烘干后。雞冠刺桐的花瓣采集自四川輕化工大學(xué)宜賓校區(qū)校園內(nèi)。根據(jù)《中國植物志》[1]的描述，尤其是通過其花瓣特征進(jìn)行鑒定，確認(rèn)所研究的植物為雞冠刺桐。

刺桐花的預(yù)處理：摘取新鮮花瓣，洗凈后在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60℃烘干72h至花瓣恒重，再利用粉碎機將干花瓣粉碎至粉末狀備用。由于不同植株、不同生理期的花瓣色素分布及含量存在差異，不用濕花瓣提取色素;預(yù)實驗結(jié)果表明，花瓣在80℃下烘干，色素提取率明顯下降，結(jié)合色素提取優(yōu)化實驗結(jié)果，在60℃以下烘干花瓣。

2.2 試劑與設(shè)備 主要試劑：鹽酸、氫氧化鈉、九水硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、甲醇和苯等均為分析純，購買自成都市科隆化學(xué)品有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%），購自天津希恩思生化科技有限公司。

主要儀器：色素提取所需設(shè)備數(shù)控超聲波清洗機KQ-700DE（昆山市超聲儀器有限公司）、高速多功能粉碎機800Y（永康市鉑歐五金制品有限公司）、電熱恒溫水浴鍋HWS-12（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、離心機5430（德國艾本德股份有限公司）、MSS全波長酶標(biāo)儀（芬蘭費希爾科技有限公司）、紫外可見光分光光度計UV2100（尤尼柯儀器有限公司）等，色素成分檢測所需超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺由武漢邁特維爾生物科技有限公司提供。

2.3 色素提取方法

2.3.1 色素提取得率的評估方法 早期的試驗結(jié)果已經(jīng)證明刺桐花色素的主要成分為黃酮[8-9]，蘆丁常用于檢測色素中總黃酮含量，常見的蘆丁有兩種最大吸收波長370nm和510nm[15-17]。本試驗通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算色素中總黃酮的提取得率。

色素原液制備：本試驗初始色素提取條件參考文獻(xiàn)[12]的方法，具體步驟為：準(zhǔn)確稱取0.5g的干花粉末，以1/40的物料比加入20mL浸提液（0.1%HCL 50%乙醇），在60℃水浴鍋中恒溫浸提60min。分裝到離心管中，12000r/min離心20min，吸取上清液，用微孔濾膜過濾，并保存于試樣瓶中，保存?zhèn)浞荨?/p>

最佳吸收波長確定：對蘆丁溶液和刺桐花色素提取液做一定倍數(shù)的稀釋（具體的稀釋倍數(shù)依賴于實際檢測的OD值，當(dāng)OD值在0.1～1的有效范圍內(nèi)時，稀釋倍數(shù)合理），以50%乙醇為空白對照，在370～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行了全波段掃描，每個濃度平行測3次。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的制備參照文獻(xiàn)[15]的NaNO2-Al（NO3）3顯色法制備，但具體的處理措施略有不同，具體制備方法如下：準(zhǔn)確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，50%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶內(nèi)，用50%乙醇準(zhǔn)確定容至25mL，得到濃度為0.4mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、2.0mL，分別置于10mL的比色管中，再分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0mL的50%乙醇，搖勻，再分別向各個比色管中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，混勻，靜置6min;再分別在比色管中加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，混勻，靜置6min;再分別向比色管加入1mol/L氫氧化鈉溶液4.0mL，混勻，用50%乙醇定容至刻度，混勻，靜置15min。在最大吸收波長370nm處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蘆丁質(zhì)量濃度x（mg/mL）與吸光度A之間的線性回歸方程：A=Kx+c（截距）。

刺桐花色素總黃酮含量的測定：取1.0mL提取液至10mL具塞比色管內(nèi)，按照上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的方法處理色素樣本。稀釋合適的倍數(shù)后，在370nm處測定其吸光度，平行3組，取平均值。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線算出黃酮含量：W=（ρ×V1×n）/（m×1000）×100。式中：W為色素總黃酮含量，單位%;ρ為樣品中黃酮的測出濃度，單位mg/mL;V1為色素提取液總體積，單位mL;n為稀釋倍數(shù);m為刺桐干花粉末的質(zhì)量，單位g。

2.3.2 單因素試驗 除了輔助超聲處理的單因素試驗以外，所有的單因素實驗都是在參考文獻(xiàn)[12]初始提取方法的基礎(chǔ)上變更某一個變量因素。分別對浸提劑（苯、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇、0.1% HCL-50%乙醇、0.2% HCL-50%乙醇、蒸餾水），物料比（花粉克數(shù)/浸提液體積分別為1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/110），不同pH值的50%乙醇（1、3、3.5、4、4.5、5.0、5.5、6、6.5、7、9、11、13），不同水浴溫度（25℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃），水浴時間（10min、20min、30min、40min、50min、60min）開展單因素試驗。

丁建英等人[18]采用了超聲波輔助提取線葉金雀花色素，說明超聲波能夠輔助提高色素提取率，故優(yōu)化實驗增加了超聲輔助提取工藝。初始條件同前，分別用不同超聲功率（50%、60%、70%、80%、90%、100%）和超聲時間（20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min）開展單因素試驗。通過比較370nm處吸光值的大小確定刺桐花色素提取的最優(yōu)條件。

2.3.3 正交試驗優(yōu)化提取條件及驗證 單因素試驗結(jié)果表明：浸提劑pH、水浴溫度和超聲功率對刺桐花色素的提取影響較大，故對浸提劑pH（A）、水浴溫度（B）和超聲功率（C）設(shè)計了三因素三水平的正交試驗（雞冠刺桐花色素總黃酮提取因素水平表見表1，正交試驗設(shè)計表見表2），以確定刺桐花色素的最優(yōu)提取條件。最后通過驗證試驗，測量其色素提取得率。

2.3.4 花色素提取液中黃酮成分的檢測分析 將雞冠刺桐花樣本送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，利用UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行色素成分分析。將實驗室最優(yōu)工藝提取的色素樣本，真空冷凍干燥后，溶于70%的甲醇水溶液后，4℃過夜，10000g離心10min，微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中用UPLC-MS/MS分析。具體的檢測與數(shù)據(jù)分析由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

其中UPLC-MS/MS的液相條件為：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm×100mm;流動相：A相為超純水（0.04%的乙酸），B相為乙腈（0.04%的乙酸）;洗脫梯度：0min水/乙腈（95：5V/V），11.0min為5：95V/V，12.0min為5：95V/V，12.1min為95：5V/V，15.0min為95：5V/V;流速0.4mL/min;柱溫40℃;進(jìn)樣量2μL。

基于武漢邁維公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、定量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 色素最大吸收波長的確定及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 蘆丁及刺桐花紅色素粗提液在370nm～600nm內(nèi)的光譜掃描結(jié)果見圖2，可以看出蘆丁與刺桐花紅色素在370nm處均有最大吸收峰，刺桐花色素和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的最大吸收波長一致，均為370nm，再次表明刺桐花色素內(nèi)主要成分為黃酮類物質(zhì)。在本次試驗中蘆丁的最大吸收波長與刺桐花色素提取液的最大吸收波長相同，故選擇370nm作為本試驗的檢測波長。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，蘆丁濃度（mg/mL）與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程有：y=11.794x-0.0126，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9986，其中x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，y為對應(yīng)濃度下的吸光度。以初始方法提取的色素樣品在370nm處測出平均吸光度為0.471，通過回歸方程計算，得出樣品內(nèi)總黃酮的質(zhì)量濃度為ρ=0.0410mg/mL，故總黃酮含量（以蘆丁計）w（%）=（x×10×20）/0.5=16.4mg/g，即每1g刺桐干花粉末中含有16.4mg總黃酮。

3.2 單因素試驗 浸提劑對刺桐花色素吸光度的影響見圖4。結(jié)果表明，當(dāng)以苯、甲醇、不同濃度乙醇和水作為提取劑時，50%乙醇作為提取劑時OD最高，表明其提取效果最好。由于酸度會顯著影響紅色素的呈現(xiàn)效果，比較不同HCL含量下50%乙醇浸提液的OD值，發(fā)現(xiàn)它們之間的存在差異，因此有必要研究pH對刺桐花色素提取效率的影響。

物料比和pH對色素提取率的影響見圖5。當(dāng)料液比為1∶40時吸光度最大，故選擇1∶40為最優(yōu)物料比。花色素提取液在堿性條件下呈綠色，且吸光值穩(wěn)定。在pH值為3.5以下，OD值下降明顯。提取液在酸性條件下呈黃紅色，pH值為5.5時顏色最深，吸光度最大，故選擇pH5.5為最優(yōu)pH提取條件。

水浴溫度和水浴時間對色素提取率的影響見圖6。隨著水浴溫度的升高，吸光度逐漸提高，當(dāng)溫度為60℃時吸光度達(dá)到最大，當(dāng)溫度超過60℃后吸光度劇烈下降，故選擇60℃作為最優(yōu)水浴溫度。水浴時間從25min到60min條件下吸光度持續(xù)增加，當(dāng)水浴時間超過40min以上時，吸光值間差異不大。由于水浴60min時吸光度最高，故選擇60min為最優(yōu)的水浴時間。

不同超聲功率及超聲時間下的色素提取液在370nm處的OD檢測值見圖7。隨著超聲功率的增加，吸光度也在持續(xù)增加，超聲波加快了機械振動，增大了接觸面積，在功率為100%（（40KHz）時吸光度最高，故選擇100%為試驗的最優(yōu)超聲功率。由于受制于設(shè)備本身功率，未能檢測更高超聲功率對色素提取的影響。隨著超聲時間的增加，吸光度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，100%功率超聲處理40min時吸光度最大，故將超聲處理40min作為最佳超聲處理時間。

3.3 正交試驗優(yōu)化提取工藝及提取得率驗證 單因素試驗結(jié)果表明：浸提劑pH、水浴溫度和超聲功率對刺桐花色素的提取影響較大，故對浸提劑pH（A）、水浴溫度（B）和超聲功率（C）設(shè)計了3因素3水平的正交試驗。正交試驗結(jié)果如表2所示。根據(jù)極差的大小，可以得出在試驗中影響刺桐花色素提取的因素主次為A>B>C，即pH>水浴溫度>超聲功率;根據(jù)k3>k2>k1，可以得出最優(yōu)組合為A3B3C3。由表3的方差分析結(jié)果可知：pH、溫度和超聲功率這3個因素各水平之間沒有顯著性差異。原因可能在于選擇正交因素水平時，這些條件本身已接近最優(yōu)條件，所以差異不明顯。故本試驗的色素提取最佳工藝為：以pH為6的50%乙醇為浸提劑，在70℃下水浴60min，再輔以100%（40KHz）超聲功率處理40min。

根據(jù)上述正交試驗得出的最優(yōu)條件進(jìn)行驗證，得出刺桐花色素的提取率為71.2mg/g干花，相較于初始提取條件下的色素提取率16.2mg/g提高了3.43倍。黃瓊等[16]使用優(yōu)化后的桑葚葉黃酮提取工藝，得到的黃酮提取得率為50.2mg/g。本試驗結(jié)果比上述試驗結(jié)果還要高41.8%，說明雞冠刺桐花色素含有較高的黃酮成分。

3.4 雞冠刺桐花色素成分 基于UPLC-MS/MS檢測得到的雞冠刺桐花色素中黃酮類物質(zhì)成分信息見表4，相對含量低于0.1%的物質(zhì)未參與統(tǒng)計。結(jié)果表明雞冠刺桐花色素提取液內(nèi)含有37種黃酮類化合物，其中主體成分為黃酮（狹義的黃酮），占到了82.16%，其余依次為黃酮醇（占6.15%）、黃烷酮（占6.07%）、花青素（占3.08%）和異黃酮類（占0.56%）等。將原始數(shù)據(jù)與https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，黃酮中有多達(dá)12個物質(zhì)是芹菜素衍生物，占比達(dá)到71.6%。其中有7類芹菜素衍生物相對含量較高，按從高到低的排序，主要包括異夏佛塔苷（Isoschaftoside），占14.47%;夏佛塔苷（Schaftoside），占13.41%，維采寧-3（Vicenin-3），占10.90%;異牧荊素（Isovitexin），占9.75%;芹菜素C-己糖基C-戊糖苷（C-hexosyl-C-pentoside Apigenin），占9.22%;芹菜素C-葡萄糖苷（C-glucoside Apigenin），占7.14%;芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷（6，8-di-C-glucoside Apigenine），占6.71%。雞冠刺桐花色素中為何含有如此高比例的芹菜素類衍生物有待更進(jìn)一步的研究。

芹菜素在自然界廣泛分布，主要存在于瑞香科、馬鞭草科、卷柏科以及溫、熱帶蔬菜和水果中[19]。芹菜素及其衍生物有多種藥理作用，包括抗炎、抗痙攣、抗細(xì)菌感染、治療皮膚疾病、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、保護(hù)肝功能、預(yù)防骨質(zhì)疏松、防輻射損傷、抗動脈硬化和腦血栓、降壓和鎮(zhèn)靜抗焦慮等[20-21]。廣金錢草內(nèi)存在大量互為同分異構(gòu)體的夏佛塔苷和異夏佛塔苷，它們有抗炎、清熱祛濕、利尿通淋的活性[22-23];梁楓等[24]證明異夏佛塔苷具有明顯的抗腫瘤活性;Gomes A等[25]的研究證明異夏佛塔苷可以保肝護(hù)肝和治療高血壓。三角草和小葉榕都含有大量的異牧荊素[26，27];Choo C Y等[28]證明口服少量的異牧荊素能夠降低糖尿病的發(fā)病幾率;Lin C M等[29]發(fā)現(xiàn)異牧荊素具有抗氧化性。Aseervatham G等[30]認(rèn)為芹菜素C-葡萄糖苷能夠抗癲癇和保護(hù)神經(jīng);Tomasz M. Karpiński等[31]發(fā)現(xiàn)芹菜素C-葡萄糖苷能抑制細(xì)菌，且結(jié)構(gòu)相似的芹菜素苷元的抗菌活性差異不大。這些黃酮化合物在雞冠刺桐花色素提取液中含量豐富，進(jìn)一步說明雞冠刺桐具有潛在的藥用開發(fā)價值。

4 結(jié)論

本研究通過全波段掃描發(fā)現(xiàn)，雞冠刺桐花色素提取液的最大吸收波長為370nm。通過對浸提劑種類、物料比、pH、水浴溫度、水浴時間、超聲功率和超聲時間等條件的優(yōu)化，得出了最佳提取條件：以pH為6的50%乙醇為浸提液，物料比為1/40，在70℃水浴60min，輔以100%超聲功率超聲40min。此時的黃酮提取得率達(dá)到71.2mg/g干花（以蘆丁計），較初始條件提高了3.43倍。通過UPLC-MS/MS技術(shù)對雞冠刺桐花色素提取液中的黃酮類物質(zhì)組成分析，檢測出至少37種黃酮類化合物的存在，其中71.6%的黃酮類化合物是芹菜素類衍生物。因此，對于雞冠刺桐的花色素內(nèi)芹菜素及其衍生物值得進(jìn)一步的研究與開發(fā)。

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（責(zé)編：王慧晴）