三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性比較

蔣金花，吳聲敢，陳江濱，吳長(zhǎng)興，蔡磊明，趙學(xué)平

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021

三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性比較

蔣金花，吳聲敢，陳江濱，吳長(zhǎng)興，蔡磊明，趙學(xué)平*

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021

為探明三唑酮對(duì)魚(yú)類不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)，以斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽為測(cè)試生物，檢測(cè)了三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性差異。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎為低毒，其96 h-LC50值分別為21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1；高濃度的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的孵化有明顯的抑制作用，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮組斑馬魚(yú)胚胎的孵化率為4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮組稀有鮈鯽胚胎的孵化率為33.3%。三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)為低毒，其96 h-LC50值分別為24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮對(duì)稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)為中毒，其96 h-LC50值分別為9.96、7.89、6.89 mg·L-1。因此，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)排序一致，毒性從高到低順序依次為：成魚(yú)>幼魚(yú)>仔魚(yú)。試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于斑馬魚(yú)，稀有鮈鯽對(duì)三唑酮的毒性作用更為敏感，三唑酮對(duì)稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的毒性均高于斑馬魚(yú)相應(yīng)生長(zhǎng)階段的毒性。

三唑酮；斑馬魚(yú)；稀有鮈鯽；急性毒性

三唑酮是我國(guó)第一個(gè)商品化的三唑類殺菌劑，至今已有20多年的應(yīng)用歷史。由于其對(duì)作物多種病原菌具有高效、內(nèi)吸、廣譜的作用，而成為目前應(yīng)用范圍廣、防治效果好、最具開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力的一類殺菌劑。三唑酮在農(nóng)田施用后能夠向土壤深處遷移和擴(kuò)散，通過(guò)雨水的淋溶作用進(jìn)入水體造成水體污染，進(jìn)而影響水生生物。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)96 h急性毒性為低毒，96 h-LC50值為13.8 (11.3～14.8) mg·L-1[1]，三唑酮可以造成斑馬魚(yú)胚胎畸形和眼睛發(fā)育不全[2]。隨著三唑類殺菌劑的使用量逐年增加，其造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越受到重視，目前，已有大量三唑類殺菌劑包括三唑酮對(duì)哺乳動(dòng)物毒理研究的文獻(xiàn)報(bào)道，但三唑酮對(duì)水生生物不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)的研究較少，因此研究三唑酮對(duì)不同水生生物的毒性效應(yīng)對(duì)評(píng)價(jià)三唑酮的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和安全使用具有重要意義。

農(nóng)藥多數(shù)通過(guò)飄移或地下水滲漏進(jìn)入水體造成水污染，魚(yú)類是水環(huán)境中的主要生物之一，魚(yú)類的生態(tài)毒理反應(yīng)和變化可作為水環(huán)境評(píng)價(jià)的良好指標(biāo)，因此以魚(yú)類為受試對(duì)象的毒性試驗(yàn)在評(píng)價(jià)化學(xué)品環(huán)境效應(yīng)方面起著重要作用。目前OECD、EPA、ISO等各國(guó)組織機(jī)構(gòu)常用的生態(tài)毒性檢測(cè)魚(yú)種是斑馬魚(yú)(Danio rerio)，因其價(jià)格低廉、容易獲得、管理飼養(yǎng)易行等諸多因素受到許多環(huán)保組織或國(guó)家的重視，他們已經(jīng)將化學(xué)品對(duì)其急/慢性毒性效應(yīng)作為評(píng)價(jià)污染物對(duì)水生環(huán)境危害程度的指標(biāo)。我國(guó)尚沒(méi)有建立起標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)魚(yú)類，目前國(guó)內(nèi)有能力提供生態(tài)毒性數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室采用的試驗(yàn)用魚(yú)還局限于國(guó)際通用種，缺乏本土生物的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)不但影響了對(duì)化學(xué)品安全性的全面評(píng)價(jià)，也難以滿足我國(guó)化學(xué)品管理的需要。2003年，我國(guó)頒布的《新化學(xué)物質(zhì)環(huán)境管理辦法》[3]中明確規(guī)定：“新化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)必須包括在中國(guó)境內(nèi)用中國(guó)的供試生物完成的測(cè)試數(shù)據(jù)”，稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)被推薦為我國(guó)化學(xué)品毒性測(cè)試生物之一。稀有鮈鯽具有性成熟快、易于飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可周年產(chǎn)卵、連續(xù)產(chǎn)卵等優(yōu)點(diǎn)，20世紀(jì)90年代，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所就開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行了基本生物學(xué)研究[4]。目前，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心等正利用稀有鮈鯽為試驗(yàn)材料在“評(píng)價(jià)內(nèi)分泌干擾物長(zhǎng)期低劑量暴露影響的魚(yú)類實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?、“環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的生物篩選”等方面開(kāi)展工作。但作為一種新興實(shí)驗(yàn)魚(yú)種來(lái)說(shuō)，生態(tài)毒性數(shù)據(jù)還不全面，也沒(méi)有形成完善的檢測(cè)評(píng)價(jià)體系，目前關(guān)于化學(xué)品對(duì)稀有鮈鯽某一生長(zhǎng)階段的急性毒性或者慢性毒性效應(yīng)研究較多[5-9]，但對(duì)于稀有鮈鯽和斑馬魚(yú)不同生長(zhǎng)階段的毒性差異研究還十分有限，為了更好的證實(shí)稀有鮈鯽是進(jìn)行化學(xué)品毒性測(cè)試和環(huán)境水樣毒性實(shí)驗(yàn)的模式生物，本研究以斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽為供試生物模型，研究了三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)，通過(guò)比較三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽的毒性差異，豐富稀有鮈鯽的毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，為稀有鮈鯽發(fā)展成為國(guó)際通用種提供理論數(shù)據(jù)支撐。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究三唑酮的致毒機(jī)制具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，也為評(píng)價(jià)三唑酮的安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司，分別作為胚胎和仔魚(yú)染毒器具。

試劑：三唑酮原藥(97.1%)，江蘇鹽城利民農(nóng)化有限公司；分析純吐溫-80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

稀有鮈鯽種魚(yú)購(gòu)自江蘇無(wú)錫中科水質(zhì)環(huán)境技術(shù)有限公司，斑馬魚(yú)種魚(yú)購(gòu)自武漢中科院水生生物研究所的國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，AB型品系，本試驗(yàn)所用斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽的胚胎、仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)均系其繁殖所得。斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎分別為同一天收集的健康胚胎；仔魚(yú)為孵化后8日齡；幼魚(yú)為孵化后55日齡；成魚(yú)為3月齡。仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)均于正式試驗(yàn)前24 h停止投餌。

試驗(yàn)用水為曝氣除氯并經(jīng)活性炭過(guò)濾的自來(lái)水，水溫為(25±1) ℃，pH控制在6.5～7.5，光/暗比為14 h/10 h，溶解氧≥5.8 mg·L-1。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 試驗(yàn)藥液配制

三唑酮原藥用吐溫-80和DMF溶解，經(jīng)超聲混勻定容后配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏備用。試驗(yàn)時(shí)，用移液器吸取適量?jī)?chǔ)備液加入定量的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，超聲混勻，按相應(yīng)倍數(shù)逐級(jí)稀釋至設(shè)計(jì)濃度。試驗(yàn)期間各試驗(yàn)容器內(nèi)助溶劑DMF在水中最終濃度均未超過(guò)0.100 mg·L-1。標(biāo)準(zhǔn)稀釋水按照《化學(xué)品魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)》[10]方法配制。

1.3.2 胚胎染毒試驗(yàn)

參考世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)方法[11]，通過(guò)立體顯微鏡觀察，挑選發(fā)育正常的健康受精卵供試。采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入2 mL供試藥液并放入1枚受精卵。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎毒性試驗(yàn)濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設(shè)置助劑對(duì)照組，以稀釋水為空白對(duì)照組。每濃度設(shè)2次重復(fù)，每重復(fù)為1個(gè)24孔板。

染毒期間環(huán)境溫度為(25±1) ℃，光/暗比為14 h/10 h。每24 h更換1次溶液。試驗(yàn)期間分別于6、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄死亡數(shù)、孵化數(shù)及相關(guān)中毒癥狀，并及時(shí)取出死亡個(gè)體。

1.3.3 仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)試驗(yàn)

根據(jù)OECD TG 203[12]方法，設(shè)計(jì)不同生長(zhǎng)階段的斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的試驗(yàn)濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設(shè)助劑對(duì)照組，以稀釋水為空白對(duì)照組。

試驗(yàn)用水為曝氣除氯并經(jīng)活性炭過(guò)濾的自來(lái)水。仔魚(yú)急性毒性試驗(yàn)采用6孔板，每孔放入3條仔魚(yú)，設(shè)2次重復(fù)，每重復(fù)為1個(gè)6孔板；幼魚(yú)和成魚(yú)采用6 L魚(yú)缸，每缸15條魚(yú)，均設(shè)2次重復(fù)。仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的試驗(yàn)過(guò)程均采用“半靜態(tài)法” ，每24 h更換1次藥液。

表1 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性試驗(yàn)濃度Table 1 The acute toxicity concentration of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow

試驗(yàn)期間分別于6、24、48、72和96 h時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄各組斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽中毒癥狀及死亡情況，每隔24 h檢查1次各組的pH值及溶解氧含量，并及時(shí)清除死魚(yú)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(9.50標(biāo)準(zhǔn)版，浙江大學(xué))計(jì)算斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎、仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的LC50值及其95%置信區(qū)間，分析三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽各生長(zhǎng)階段的毒性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的毒性效應(yīng)2.1.1 致死效應(yīng)

圖1為斑馬魚(yú)胚胎經(jīng)不同濃度三唑酮處理不同時(shí)間后的死亡率。最高試驗(yàn)濃度80.0 mg·L-1三唑酮處理組24 h時(shí)胚胎的死亡率為29.2%，在48 h時(shí)死亡率已達(dá)100%；在24～96 h內(nèi)，53.3、35.6、23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1三唑酮處理組的胚胎死亡率

圖1 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率的影響

逐漸增加，96 h時(shí)死亡率分別為87.5%、58.3%、29.2%、 20.8%、8.30%、4.17%。相對(duì)于藥劑處理組，空白對(duì)照組和助劑對(duì)照組對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的死亡率沒(méi)有影響。

圖2為稀有鮈鯽胚胎經(jīng)不同濃度三唑酮處理不同時(shí)間后的死亡率。在24～96 h內(nèi)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，三唑酮各濃度處理組的胚胎死亡率逐漸增加，72 h后各處理組的死亡率顯著增加；在96 h時(shí)，4.44、6.67、10.0、15.0和22.5 mg·L-1試驗(yàn)組的死亡率分別為0%、16.7%、27.8%、50.0%和83.3%。稀有鮈鯽孵化時(shí)間約為卵產(chǎn)出后72 h，因此72 h為其孵化出卵殼的關(guān)鍵時(shí)間，從圖2可見(jiàn)，72～96 h為三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎毒性作用最明顯的時(shí)間段。相對(duì)于藥劑處理組，空白對(duì)照組和助劑對(duì)照組對(duì)稀有鮈鯽胚胎的死亡率沒(méi)有影響。

結(jié)果表明，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的毒性隨處理濃度的增大而增加，同時(shí)隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，顯示一定的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

圖2 三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎死亡率的影響

表2為96 h 時(shí)三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的半致死濃度(LC50)及95%置信區(qū)間。從中可看出，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎96 h-LC50值分別為21.1 (14.4～31.0)和14.2 (9.65～20.9) mg·L-1,因此稀有鮈鯽胚胎對(duì)三唑酮比較敏感，三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎的毒性高于斑馬魚(yú)胚胎。

2.1.2 亞致死效應(yīng)

圖3為不同濃度三唑酮處理后斑馬魚(yú)胚胎孵化率的變化趨勢(shì)。在三唑酮作用下，斑馬魚(yú)胚胎孵化率隨著三唑酮濃度的增大而降低，高濃度的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化有明顯的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化。染毒96 h后，23.7、15.8、10.5、7.02 mg·L-1的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化率分別為4.17%、50.0%、91.7%、91.7%?？瞻讓?duì)照組和助劑對(duì)照組對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化率沒(méi)有影響。

圖4為不同濃度三唑酮處理后對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。稀有鮈鯽胚胎孵化的最早時(shí)間為染毒48 h后，22.5 mg·L-1的三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎的孵化有明顯的抑制作用，染毒72和96 h時(shí)，22.5 mg·L-1的三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎的孵化率分別為27.8%和33.3%。其余濃度(4.44～15.0 mg·L-1)對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化的影響與空白對(duì)照和助劑對(duì)照組相近。

試驗(yàn)表明，高濃度的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的孵化都有一定程度的抑制作用。在相同培養(yǎng)條件下，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化的影響高于對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。

2.2 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的急性毒性

研究發(fā)現(xiàn)，隨著三唑酮濃度的增加，斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的死亡率都出現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，說(shuō)明三唑酮和毒性之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)期間，經(jīng)三唑酮染毒處理后，中毒癥狀隨濃度的提高而越發(fā)明顯。高濃度的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽成魚(yú)的毒性作用比較明顯，染毒初期主要表現(xiàn)為快速游動(dòng)，焦躁不安，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)游動(dòng)變得遲緩，對(duì)外界刺激變得遲鈍，個(gè)別魚(yú)出現(xiàn)側(cè)翻失衡及沉底現(xiàn)象，最終死亡。三唑酮處理后，斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽仔魚(yú)和幼魚(yú)的早期中毒癥狀不明顯，隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，個(gè)別魚(yú)體出現(xiàn)側(cè)翻，脊柱彎曲或者魚(yú)體變白腐爛等中毒癥狀。低濃度三唑酮處理組的斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽無(wú)異常癥狀，與空白對(duì)照和助劑對(duì)照組基本相似。

圖3 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響

表2 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的急性毒性 (96 h)Table 2 The acute toxicity of triadimefon to the embryo of zebrafish and rare minnow (96 h)

圖4 三唑酮對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化率的影響

三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽3個(gè)不同生長(zhǎng)階段的急性毒性見(jiàn)表3，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的96 h-LC50值分別為24.8、21.3、13.1 mg·L-1，三唑酮對(duì)稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的96 h-LC50值分別為9.96、7.89、6.89 mg·L-1，因此，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性從高到低順序依次為：成魚(yú)>幼魚(yú)>仔魚(yú)。研究表明，稀有鮈鯽對(duì)三唑酮比較敏感，三唑酮對(duì)稀有鮈鯽不同生命階段的毒性均高于斑馬魚(yú)相應(yīng)生長(zhǎng)階段的毒性，與三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎的毒性結(jié)果一致。

3 討論(Discussion)

毒性研究是熱點(diǎn)問(wèn)題，一般情況下，以一種魚(yú)類模式生物的急性毒性結(jié)果作為化學(xué)品的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，可能會(huì)造成對(duì)本土生物的欠保護(hù)或過(guò)保護(hù)，也無(wú)法對(duì)化學(xué)品安全性作出全面的評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)分別以胚胎、8日齡仔魚(yú)、55日齡幼魚(yú)和3月齡成魚(yú)為研究樣本，以國(guó)際通用種斑馬魚(yú)和我國(guó)特有種稀有鮈鯽為測(cè)試生物，研究了三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性影響。三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽的毒性影響涵蓋了魚(yú)類生長(zhǎng)的整個(gè)生命周期，所得結(jié)果可以為三唑酮的毒性效應(yīng)以及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過(guò)比較三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)，豐富本土生物稀有鮈鯽的毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以完善相關(guān)毒性效應(yīng)研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，滿足我國(guó)化學(xué)品管理的需要，并為制定合理的測(cè)試導(dǎo)則提供參考，也為選擇更為合適的本土模式生物來(lái)評(píng)價(jià)不同化合物的毒性效應(yīng)提供數(shù)據(jù)支撐。

在相同培養(yǎng)條件下，高濃度的三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化有明顯的抑制作用，35.6 mg·L-1的三唑酮可以完全抑制胚胎的孵化，染毒96 h后，23.7 mg·L-1三唑酮組中斑馬魚(yú)胚胎孵化率為4.17%，22.5 mg·L-1三唑酮組中稀有鮈鯽胚胎的孵化率為33.3%。由此可見(jiàn)，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化影響高于對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性測(cè)定結(jié)果顯示，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)、幼魚(yú)和胚胎的毒性相當(dāng)，96 h-LC50值分別為24.8、21.3和13.1 mg·L-1，斑馬魚(yú)成魚(yú)對(duì)三唑酮最為敏感，稀有鮈鯽不同生命階段對(duì)三唑酮毒性的敏感性從高到低順序依次為：胚胎>成魚(yú)>幼魚(yú)>仔魚(yú)(96 h-LC50值分別為14.2、9.96、7.89、6.89 mg·L-1)。根據(jù)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局制定的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[13]中將農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類的毒性等級(jí)劃分為4個(gè)等級(jí)：劇毒，LC50≤0.1 mg·L-1；高毒，0.110 mg·L-1，因此97.1%三唑酮原藥對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽胚胎、斑馬魚(yú)仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的96 h急性毒性等級(jí)均為低毒，對(duì)稀有鮈鯽仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的96 h急性毒性等級(jí)均為中毒。本研究表明，稀有鮈鯽對(duì)三唑酮的毒性作用更為敏感，因此，在研究三唑酮的毒性作用機(jī)制時(shí)，作為我國(guó)本土生物的稀有鮈鯽相對(duì)于斑馬魚(yú)更為適合。

表3 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性 (96 h)Table 3 The acute toxicity of triadimefon to different life stages of zebrafish and rare minnow (96 h)

歐盟(EU)和世界自然基金(WWF)把三唑酮列為具有生殖和內(nèi)分泌干擾毒性的殺菌劑之一。三唑酮主要通過(guò)影響甾醇14-α脫甲基酶(CYP51)和芳香酶(CYP19)，從而影響類固醇生成，具有一定的擬雌激素活性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)小鼠和斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的類固醇合成途徑中關(guān)鍵元件的基因表達(dá)具有一定的調(diào)控作用[15-16]。同時(shí)，三唑酮對(duì)大鼠和人類肝臟細(xì)胞具有相同的毒性效應(yīng)，可以調(diào)控雌雄激素代謝，脂肪酸以及固醇和類固醇代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)[17]?，F(xiàn)有研究表明，三唑酮對(duì)不同的生物具有類似的毒性效應(yīng)，但其具體的毒性機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。已有報(bào)道顯示，三唑酮對(duì)日本青鳉不同生命階段的毒性為仔魚(yú)>幼魚(yú)>成魚(yú)(96 h-LC50值分別為12.5、11.0、0.354 mg·L-1[18])，說(shuō)明三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)、稀有鮈鯽和日本青鳉不同生長(zhǎng)階段的毒性差異大，三唑酮對(duì)日本青鳉不同生長(zhǎng)階段的毒性均高于斑馬魚(yú)，日本青鳉成魚(yú)對(duì)三唑酮最為敏感。斑馬魚(yú)、日本青鳉和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段對(duì)三唑酮敏感性差異的具體原因，應(yīng)該從這3種生物的基因組差異來(lái)進(jìn)一步研究，從分子和蛋白水平來(lái)研究三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)、日本青鳉和稀有鮈鯽的胚胎毒性、致畸性、神經(jīng)毒性以及內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，進(jìn)一步討論三唑酮的致毒機(jī)制。

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Acute Toxicity Effects of Triadimefon on Different Life Stages of Zebrafish (Daniorerio) and Chinese Rare Minnow (Gobiocyprisrarus)

Jiang Jinhua, Wu Shenggan, Chen Jiangbin, Wu Changxing, Cai Leiming, Zhao Xueping*

State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory for Pesticide Residue Detection of Ministry of Agriculture, Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

Received 18 November 2014 accepted 30 December 2014

To explore the toxic effects of triadimefon on fish at different life stages, the differences in acute toxicity of triadimefon to zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) at different life stages were evaluated. The results showed that triadimefon was low toxic to the embryos of both zebrafish and rare minnow, and the 96 h-LC50value was 21.1 (14.4～31.0) and 14.2 (9.65～20.9) mg·L-1, respectively. An obvious inhibition of embryos hatching for both fish was observed after the exposure to high concentration of triadimefon for 96 h, and the hatching rate was 4.17% and 33.3%when the embryos of zebrafish and rare minnow were exposed to 23.7 and 22.5 mg·L-1triadimefon, respectively. Triadimefon exhibits low toxic to the larvae, juvenile, and adult of zebrafish with the 96 h-LC50values of 24.8, 21.3, and 13.1 mg·L-1respectively. Triadimefon shows moderately toxic to the larvae, juvenile, and adult of rare minnow with the 96 h-LC50values of 9.96, 7.89, and 6.89 mg·L-1. The trend of triadimefon acute toxicity to zebrafish and rare minnow at different life stages was the same: adult>juvenile>larva, and rare minnow was more sensitive to triadimefon during different life stages compared with zebrafish.

triadimefon; zebrafish (Danio rerio); Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus); acute toxicity

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目

蔣金花(1985-)，女，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理學(xué)，E-mail: jinhuajjh@sina.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhaoxueping@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141118002

2014-11-18錄用日期：2014-12-30

1673-5897(2015)5-150-07

X171.5

A

趙學(xué)平(1969-)，男，本科，研究員，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)藥應(yīng)用與毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

蔣金花, 吳聲敢, 陳江濱, 等. 三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)和稀有鮈鯽不同生長(zhǎng)階段的急性毒性比較[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(5): 150-156

Jiang J H, Wu S G, Chen J B, et al. Acute toxicity effects of triadimefon on different life stages of zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 150-156 (in Chinese)