蔣 昊， 王 旋， 劉成棟， 周慧慧， 麥康森， 何 艮

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

具有高營養(yǎng)價值的魚粉(Fish meal，F(xiàn)M)是水產(chǎn)飼料工業(yè)的主要蛋白質(zhì)來源，隨著全球FM產(chǎn)量下降，水產(chǎn)飼料中的FM短缺成為我們所面臨的一個重大挑戰(zhàn)[1]，探究如何使用新型蛋白源替代FM成為近年來的熱門研究課題[2]。用于水產(chǎn)養(yǎng)殖配合飼料的替代蛋白源主要有動物蛋白源、植物蛋白源和以單細(xì)胞藻類和酵母為主的一部分單細(xì)胞蛋白源[3-5]。然而，在氨基酸組成方面，和FM最相近的動物蛋白源，其替代水平一直不高。原料消化率低、不同來源地的質(zhì)量參差不齊、必需氨基酸組成不平衡和灰分含量過高等原因制約了動物蛋白源在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用[6]。因此，在水產(chǎn)飼料中添加氨基酸組成平衡、有利于消化吸收的動物蛋白源是減少FM用量的重要解決途徑。

水解魚蛋白(Fish protein hydrolysate，F(xiàn)PH)通過水解作用將蛋白質(zhì)水解成蛋白質(zhì)寡肽，不僅提高了魚加工下腳料蛋白質(zhì)的回收率，還充分提高了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[7]。與未進行水解的魚蛋白相比，F(xiàn)PH中含有許多小肽和游離氨基酸，可以促進魚體的攝食，更好的被魚體吸收[8]。FPH中含有促生長的小分子，如羥脯氨酸、?；撬岬龋梢栽黾酉富钚?，增強免疫應(yīng)答，加快生長速度[9-12]。此外，F(xiàn)PH中常量元素鉀、鈉、鈣、鎂、磷含量普遍較高，微量元素碘、硒、B族維生素及葉酸的含量普遍高于植物蛋白源[12]。作為新型蛋白源，F(xiàn)PH在蝦、鱸魚、大西洋鱈魚等中的應(yīng)用已有研究報道[13-15]。

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)又稱為多寶魚，具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高、容易飼養(yǎng)等特點，現(xiàn)已成為中國北方養(yǎng)殖的代表品種之一[16]。本研究旨在評估在低FM即高植物蛋白源替代的飼料中添加不同含量的FPH對大菱鲆幼魚的生長指標(biāo)、后腸形態(tài)、游離氨基酸濃度和PepT1基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果可為FPH在大菱鲆飼料中的FM替代提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 水解魚蛋白的制備

通過魚類加工廠(山東偉琪水產(chǎn)有限公司)鳀魚加工產(chǎn)品所剩的下腳料，經(jīng)酶法提取制作FPH。具體操作方法：用中性蛋白酶(山東蘇克漢生物有限公司提供)，含菌量10萬CFU/g，按1%添加，在55 ℃水浴的環(huán)境中水解魚蛋白5 h，保證外界環(huán)境達(dá)到pH=7.5。將水解完的魚蛋白放入80 ℃的干燥箱中30 min即得，水解魚蛋白(干物質(zhì))含粗蛋白70.11%，粗脂肪22.99%。

1.2 實驗飼料

共設(shè)計5組等氮(52%粗蛋白)等能(20 kJ/g能值)的飼料，以FM組作為正對照組，以植物蛋白源混合物(豆粕、玉米蛋白粉、花生粕)替代40%的FM作為負(fù)對照組(36% FM，)，在負(fù)對照組的基礎(chǔ)上分別添加3%、6%和9%的FPH作為實驗組，分別記為3% FPH、6% FPH和9% FPH處理組。飼料配方所包含的營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼料配方和其中所包含的營養(yǎng)物質(zhì)(干物質(zhì))1

所有的原料均經(jīng)過粉碎機超微粉碎后過180 μm篩網(wǎng)，按照飼料配方中的含量從少至多逐級混勻，然后將大豆卵磷脂和魚油加入，與各部分原料充分混合，隨后加入大約20%～25%溶解含有氯化膽堿的純水后再進行一次混勻，使用雙螺桿制粒機(F-26，華南理工大學(xué)，中國)制成顆粒飼料(粒徑規(guī)格3 mm×4 mm)，最后將所制成的飼料放入55 ℃的通風(fēng)烘箱中烘干(16 h)至恒重后放入-20 ℃冰箱中進行儲存。

1.3 養(yǎng)殖實驗過程

大菱鲆魚苗購于山東威海某育苗場，養(yǎng)殖實驗地點隸屬于青島億海豐水產(chǎn)有限公司，此次養(yǎng)殖周期持續(xù)74 d。養(yǎng)殖實驗開始前暫養(yǎng)2周使幼魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，暫養(yǎng)結(jié)束后饑餓24 h，選取體格健壯、大小均一的大菱鲆幼魚((10.17±0.02)g)進行養(yǎng)殖實驗，每個實驗組各分3個養(yǎng)殖桶(水量約為300 L)，每桶含有30尾幼魚，本次實驗共計15個養(yǎng)殖桶。每天上午7:30和晚上18:30進行2次表觀飽食投喂，保持循環(huán)水水溫在16.0～18.6 ℃、pH穩(wěn)定在7.5～8.0之間、鹽度為29.1～32.2、持續(xù)充氧保證溶氧量在7 mg/L左右，氨氮和亞硝酸鹽的濃度控制小于0.1 mg/L。

1.4 樣品采集

在投喂完養(yǎng)殖魚體4 h后，用自動糞便收集器虹吸法收集糞便樣本。為了檢測的準(zhǔn)確性，僅收集新鮮完整的糞便。收集的糞便樣本隨即裝入50 mL離心分離管中，放入-20 ℃冰箱保存直至分析。

實驗結(jié)束后，饑餓魚體48 h，對每桶大菱鲆進行稱重和計數(shù)。隨機抽取4條魚，進行全魚體常規(guī)分析。隨機抽取4條魚，測量魚體體質(zhì)量、體長、內(nèi)臟團質(zhì)量和肝質(zhì)量，用以計算魚體的形體指標(biāo)。隨機抽取3條魚收集腸樣本進行組織學(xué)分析，解剖魚體取后腸部位，置于波恩氏固定液(飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)中24 h，然后按照標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)程序，用70%的乙醇進行保存。隨后切取約5 mm左右長度的后腸道，經(jīng)過不同濃度的乙醇和二甲苯逐級脫水，進行石蠟包埋，待石蠟涼至室溫后，使用組織切片機進行手動切片，腸道切片的厚度在5～7 μm之間，將切好的石蠟片放在載玻片上進行展片和烘片步驟，最后用HE染色法進行染色和封片。保證桶內(nèi)剩下的大菱鲆幼魚充分?jǐn)z食并達(dá)到表觀飽食狀態(tài)，在投喂8 h后隨機從桶內(nèi)抽取6條魚，務(wù)必確保所抽取的魚腸道內(nèi)包含飼料，否則棄之，使用1 mL一次性注射器從魚體尾靜脈處提取血液樣本，置于抗凝管中，然后在4 ℃下以3 500g離心10 min，抽取上清液獲得血清樣本，樣品在-80 ℃儲存。從每條魚的背部相同位置取下一塊背肌，放入1.5 mL的試管中(RNase-Free; Axygen)，冷凍在液氮里，然后儲存在-80 ℃冰箱中，直至分析。

1.5 分析方法

1.5.1 飼料、魚體及糞便的成分分析 所有的飼料原料、飼料和魚體的樣本都使用分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會[17]的方法來檢測粗蛋白、粗脂肪和粗灰分。將待測樣品(飼料和糞便)研磨成粉末狀，放置于105 ℃烘箱中烘干水分保持恒重，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射分光光度計(ICP-AES, VISTA-MPX, VARIAN, USA)測定高氯酸消化后日糧和糞便中的氧化釔(Y2O3)含量。每個單獨樣品指標(biāo)的檢測都需要重復(fù)測定2次，若2次的相對偏差過高則需要重新檢測，直到相對偏差在1%之內(nèi)方可使用檢測指標(biāo)。

1.5.2 組織學(xué)觀察 在光學(xué)顯微鏡下(Olympus, DP72，日本)使用相機(Nikon E600，日本)和cellSens標(biāo)準(zhǔn)軟件(Olympus，日本)進行圖像采集，所有采集完成的圖像均使用Imagine Pro Plus 6.0軟件進行測量分析，在不同放大倍率的物鏡下進行分析，每個處理組至少分析6張以上的切片。

1.5.3 組織游離氨基酸檢測 檢測大菱鲆魚體攝食飼料8 h后血漿和肌肉中的游離氨基酸。從-80 ℃冰箱中取出待測的血漿樣品，放置于冰上進行解凍，待血漿充分融化后，取0.4 mL血漿上清液置于2 mL離心管中，隨后加入1.2 mL的磺基水楊酸(10%)，充分混勻靜置5 min，在18 894.2g、4 ℃的條件下離心15 min，用1 mL注射器吸取上清液，最后將上清液經(jīng)過0.2 μm濾膜過濾后再加入到上樣管中，使用全自動氨基酸檢測儀(L-8900，HITACHI，Japan)檢測游離氨基酸含量。

從-80 ℃冰箱中取出待測的肌肉樣品，放置于冰上進行解凍，待肌肉充分融化后，稱取1 g肌肉置于5 mL勻漿離心管中，隨后加入3 mL的磺基水楊酸(10%)，充分勻漿后取勻漿液1.5 mL，在18 894.2g、4 ℃的條件下離心15 min，用1 mL注射器吸取上清液，最后將上清液經(jīng)過0.2 μm濾膜過濾后再加入到上樣管中，使用全自動氨基酸檢測儀(L-8900，HITACHI，Japan)檢測游離氨基酸含量。

1.5.4 實時熒光定量PCR分析 采用Trizol法進行腸道組織RNA提取，使用TaKaRa公司(日本)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量熱循環(huán)儀(Mastercyclerep realplex, Eppendorf，德國)進行RNA反轉(zhuǎn)錄，結(jié)束后檢測濃度并使用DEPC水將其稀釋至80 ng/μL，放置于-80 ℃的冰箱中保存。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測小肽轉(zhuǎn)運體1 基因(Peptidetransporter1,PepT1, XM_035629795.1)和β-肌動蛋白基因(β-actin)的mRNA表達(dá)，β-actin(EU686692.1)作為內(nèi)參基因。本實驗?zāi)康幕蛞镄蛄衃18]列于表2。所有靶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCT方法測定目的基因的表達(dá)量[19]。

表2 實時熒光定量PCR所用的引物

1.6 計算公式和統(tǒng)計方法

計算公式如下：

增重率(Weight gain rate, WGR)=(FBW-IBW)/IBW×100%。

特定生長率(Special growth rate, SGR,%·d-1)=ln(FBW-IBW)/養(yǎng)殖天數(shù)。

攝食率(Feed intake, FI)={攝入飼料干質(zhì)量/[(FBW+IBW)/2]}/養(yǎng)殖天數(shù)×100%。

飼料轉(zhuǎn)化率(Feed conversion ratio, FCR)=攝入飼料干質(zhì)量/魚體增重濕質(zhì)量×100%。

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio, PER)=(FBW-IBW)/(W×P)×100%。

蛋白質(zhì)沉積率(Protein productive value, PPV)=(FBW×P1-IBW×P0)/(W×P)×100%。

存活率(Survival rate, SR)=終末魚數(shù)/初始魚數(shù)×100%。

肥滿度(Condition factor, CF)=FBW/L3×100%。

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=肝臟質(zhì)量/FBW×100%。

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=內(nèi)臟團質(zhì)量/FBW×100%。

表觀消化率(Apparent digestibility coefficient, ADC)=(1-飼料中氧化釔/糞便中氧化釔)×100%。

絨毛直徑比(Villus diameter ratio, VDR)=絨毛高度(Villi height, VH)/管腔直徑(Lumen diameter, LD)。

式中：IBW為初始體質(zhì)量(Initial body weight, IBW)；FBW為終末體質(zhì)量(Final body weight, FBW)；W表示每尾魚攝食的飼料干物質(zhì)量(g)；P表示飼料粗蛋白含量(干質(zhì)量，%)；P0表示實驗開始時魚體粗蛋白含量(濕質(zhì)量，%)；P1表示實驗結(jié)束時魚體粗蛋白含量(濕質(zhì)量，%)；L表示魚體體長(cm)。

所有測得的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當(dāng)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)時，再利用Tukey進行多重比較，最后的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式來體現(xiàn)，差異性則使用上標(biāo)字母不同來表示。

2 結(jié)果

2.1 大菱鲆幼魚生長指標(biāo)和飼料利用

如表3所示，養(yǎng)殖實驗期間，各處理組都沒有收集到死亡的大菱鲆魚苗，存活率都是100%。74 d飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，各組間的FI、FCR、PER、PPV相比較均無顯著性差異(P>0.05)。負(fù)對照組的FBW、WGR、SGR均顯著低于正對照組、6% FPH組和9% FPH組(P<0.05)。添加6%和9%比例的FPH組與正對照組相比，在FBW和SGR指標(biāo)上均沒有顯著差異(P>0.05)。與此同時，與其他處理組相比，9% FPH組的WGR水平顯著升高，并出現(xiàn)了最高的數(shù)值(P<0.05)。

表3 投喂不同添加水平的水解魚蛋白對大菱鲆幼魚的生長性能和飼料利用的影響1

2.2 飼料干物質(zhì)表觀消化率

ADC的結(jié)果見圖1，負(fù)對照組的ADC明顯低于其他各組(P<0.05)。伴隨著FPH的添加量的升高，ADC出現(xiàn)了相同趨勢的變化，當(dāng)FPH添加量為3%和6%時，兩組的ADC顯著低于FM和9% FPH組(P<0.05)。正對照組與9% FPH組相比較，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)。

(數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示(n=6)，同一列中不同字母表示實驗組之間差異顯著(P<0.05)。Dates were expressed as means ± stan-dard error(n=6), values in the same column with different sup superscripted denote significant difference between experimental groups(P<0.05).)

2.3 魚體組成和形體指標(biāo)

如表4所示，全魚體常規(guī)成分分析表明，隨著FPH添加水平的升高，各處理組大菱鲆幼魚的魚體水分、粗脂肪、粗灰分與兩個對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。使用FM和9% FPH組飼料喂養(yǎng)后的大菱鲆幼魚粗蛋白均顯著高于其他三個處理組(P<0.05)。與此同時，粗蛋白數(shù)值最高的是9% FPH處理組。如表5所示，所有實驗組與對照組相比，大菱鲆幼魚的形體指標(biāo)(CF、HSI、VSI)均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 投喂不同添加水平的水解魚蛋白對大菱鲆幼魚的魚體組成的影響(魚體濕質(zhì)量)1

表5 投喂不同添加水平的水解魚蛋白對大菱鲆幼魚的肥滿度、肝體比和臟體比的影響1

2.4 后腸形態(tài)分析

各組大菱鲆后腸橫切面形態(tài)變化見圖2、最終測量數(shù)據(jù)見表6。隨著FPH的添加量的上升，大菱鲆幼魚后腸絨毛更加緊湊，向中心點靠攏的趨勢越發(fā)明顯。添加FPH處理組與負(fù)對照組相比對VDR、腸上皮細(xì)胞高度(Enterocyte height,EH)和微絨毛高度(Microvillus height，MVH)均有顯著影響，呈上升趨勢(P<0.05)。6% FPH和9% FPH處理組的VDR與正對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。隨著FPH的添加量加大，EH和MVH數(shù)值也呈現(xiàn)顯著性的升高(P<0.05)，同時，與正對照組相比，在9% FPH處理組中，EH和MVH的長度顯著高于正對照組，并出現(xiàn)了實驗數(shù)據(jù)的最高值(P<0.05)。

表6 投喂不同添加水平的水解魚蛋白對大菱鲆幼魚后腸的組織學(xué)指標(biāo)的影響1

(A～E分別是正對照組, 負(fù)對照組, 3% FPH, 6% FPH和9% FPH處理組，比例尺是500 μm。A～E were sections from fish diet positive control group, negative control group, 3% FPH, 6% FPH and 9% FPH. The scale bars are presented as 500 μm.)

2.5 血漿和肌肉中的游離氨基酸含量變化

血漿游離氨基酸含量數(shù)據(jù)見表7，與負(fù)對照組相比，9% FPH組的亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、酪氨酸水平顯著升高。與此同時，9% FPH組的必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量也顯著高于負(fù)對照組(P<0.05)。正對照組和9% FPH組相比，各游離氨基酸含量變化無統(tǒng)計學(xué)上差異(P>0.05)。

表7 投喂不同添加水平的水解魚蛋白8 h后大菱鲆幼魚血漿中游離氨基酸含量的變化1

如表8所示，與負(fù)對照組相比，9% FPH組顯著升高了背部肌肉中的亮氨酸、精氨酸、組氨酸、絲氨酸、酪氨酸、非必需氨基酸和總游離氨基酸含量(P<0.05)。正對照組和9% FPH組的所有個體氨基酸濃度和游離氨基酸總量相比較沒有顯著性差異(P>0.05)。

表8 投喂不同添加水平的水解魚蛋白8 h后大菱鲆幼魚肌肉中游離氨基酸含量的變化(濕質(zhì)量)1

2.6 后腸的基因表達(dá)量

檢測結(jié)果如圖3所示，9% FPH組PepT1基因表達(dá)量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。同時，與負(fù)對照組相比，6% FPH組PepT1基因表達(dá)也得到了顯著性升高(P<0.05)。然而，負(fù)對照組與3% FPH組相比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

(數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示(n=6)，不同字母表示實驗組之間差異顯著(P<0.05)。Dates were expressed as means ± standard error(n=6), values with different sup superscripted denote significant difference between experimental groups(P<0.05).)

3 討論

最近幾年對大菱鲆幼魚的研究表明，F(xiàn)M仍然是飼料中最重要的蛋白質(zhì)來源，大菱鲆幼魚至少需要50%的FM才能正常生長[20]。本實驗設(shè)計中，正對照組含60%的FM，用植物蛋白源混合物替代40%的FM作為負(fù)對照組，即飼料含36%的FM，F(xiàn)M水平較低，我們預(yù)期這不會是大菱鲆幼魚生長的最佳添加量。我們設(shè)計各組的粗蛋白、粗脂肪和總能量的組成相同，保證各實驗組的植物蛋白源替代水平一致，在負(fù)對照組的基礎(chǔ)上分別添加3%、6%和9%的FPH，主要目的是比較不同含量的FPH添加效果，評估不同含量的FPH功能之間的差異。

3.1 水解魚蛋白對生長指標(biāo)的影響

目前，F(xiàn)PH在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用廣泛，不同品種之間FPH的最適添加量存在著顯著的差異。飼料中添加適量的FPH可顯著促進魚體的生長，適宜添加量為3%～20%，當(dāng)FPH的添加量超過適宜的水平時，實驗結(jié)果顯示FPH會抑制攝食對象的生長，生長出現(xiàn)下降的原因可能是由于體內(nèi)蛋白質(zhì)和小肽氨基酸的吸收利用過程不同步，進而導(dǎo)致部分氨基酸利用率下降所致[21]。有研究表明，在高植物蛋白飼料中適當(dāng)添加低分子量的FPH[22]，大菱鲆幼魚的生長和飼料利用有升高的趨勢；而高水平含量添加低分子量的FPH會抑制其生長和飼料利用[23]。在本研究中，6% FPH組和9% FPH組與負(fù)對照組相比能有效提高生長性能，包括FBW、WGR、SGR，在最高的9% FPH處理組出現(xiàn)了以上指標(biāo)的最高值。然而，F(xiàn)I、FCR、PER、PPV在各處理組間無統(tǒng)計學(xué)差異，相似的結(jié)果在鱸魚、牙鲆的研究中也得到了驗證[21，24]。因此，本實驗結(jié)果論證了FPH并沒有通過改變大菱鲆幼魚的飼料利用率來促進魚體生長。與此同時，添加FPH可顯著改善大菱鲆幼魚的ADC，在9% FPH處理組中出現(xiàn)了ADC的最高值。有研究表明，草魚的ADC在0.25%和1.00%蝦蛋白水解物添加后顯著升高[25]。與正對照組相比，牙鲆喂食FPH(37 g/kg)處理組的ADC最高[24]。實驗結(jié)果表明，魚體對飼料干物質(zhì)的吸收得到提升可能是導(dǎo)致魚體的增長的原因之一。

3.2 水解魚蛋白對后腸形態(tài)的影響

腸道是水生動物體內(nèi)最大的消化器官和內(nèi)分泌器官，不僅負(fù)責(zé)魚體從外界環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，還參與機體的新陳代謝、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)，而水產(chǎn)動物腸道組織形態(tài)上的完整以及黏膜屏障功能的正常表達(dá)是保障機體健康的基礎(chǔ)[26]。在大黃魚和牙鲆[27-28]的實驗中表明，植物蛋白源中所含的抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANFs)可能會導(dǎo)致魚的腸道結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致VH降低，腔內(nèi)絨毛排列雜亂等現(xiàn)象。本研究中，F(xiàn)PH組的VDR、EH和MVH與負(fù)對照組相比均顯著性升高。這結(jié)果與在舌鰨上有關(guān)于FPH添加的研究結(jié)果相似[10]。VH、EH和MVH是評價腸組織結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)，這些組織高度的增加可以擴大小腸的吸收面積，有利于小腸對外界環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[29]。我們的研究結(jié)果表明，在高植物蛋白源替代FM的飼料中添加FPH可以改善后腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進腸道的發(fā)育從而保證了機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而促進魚體的生長。

3.3 水解魚蛋白對游離氨基酸含量的影響

飼料中的氨基酸含量的差異與攝食后魚體內(nèi)不同組織的游離氨基酸的含量具有關(guān)聯(lián)性[30]。魚體對外界環(huán)境中蛋白質(zhì)的攝食吸收從根本上說就是對食物來源中的必需氨基酸和非必需氨基酸的吸收。氨基酸對機體的生理變化、代謝、蛋白質(zhì)合成和生長發(fā)育有重要影響，同時組織中游離氨基酸濃度的變化反映了機體的營養(yǎng)狀況[18]。膳食蛋白質(zhì)來源的質(zhì)量影響著魚機體組織中游離氨基酸的組成。由于水解酶的加入，F(xiàn)PH中含有大量可溶性小肽和游離氨基酸，以小肽為主要氨基酸源時，飼料的蛋白沉積速率要高于以氨基酸或未分解蛋白為主的原料，換言之，氨基酸在寡肽中的吸收效率高于以蛋白質(zhì)為主體的吸收效率，攝食添加FPH的飼料可以提高蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的利用率[31]。在本實驗中，9% FPH處理組的大菱鲆幼魚出現(xiàn)了最高的粗蛋白，同時血漿和肌肉中也含有最高的游離氨基酸濃度。因此，我們推測FPH中的小肽更容易被魚體吸收、游離氨基酸可以提高魚體攝食，進而促進大菱鲆幼魚蛋白質(zhì)的合成，最終促進生長。

3.4 水解魚蛋白對PepT1 基因表達(dá)的影響

PepT1作為一種重要的轉(zhuǎn)運蛋白基因，在寡肽轉(zhuǎn)運的調(diào)控中起著重要作用，PepT1可以轉(zhuǎn)運400～8 000余種不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的小肽，為魚類的生長、消化代謝和繁衍后代提供了堅實的保障。PepT1基因表達(dá)主要集中在消化道中，因為機體主要吸收蛋白質(zhì)降解小肽和多肽的功能器官主要分布于腸道中。飼料中所包含的蛋白質(zhì)、多肽和晶體氨基酸組成水平的差異會影響攝食對象PepT1基因的表達(dá)[32]。在草魚的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加FM作為蛋白源的PepT1基因表達(dá)量明顯高于飼料中添加大豆作為蛋白源的飼料組[33]。在大菱鲆的研究中發(fā)現(xiàn)，30%FM被豆粕替代后，PepT1基因表達(dá)量明顯下降[34]。相同的結(jié)果也出現(xiàn)在鯛魚以及大黃魚的研究中[27，35]。研究表明FPH中的小肽，在體內(nèi)具有生物活性，在機體內(nèi)的吸收速度往往快于游離氨基酸，機體吸收小肽所需要的能量供給也較少，小肽能更加高效的參與消化系統(tǒng)的吸收過程[36]。在本研究中，6% FPH組、9% FPH組和正對照組的PepT1基因表達(dá)量較高，PepT1基因表達(dá)的增加趨勢與生長性能結(jié)果一致。結(jié)果表明，通過適量的FPH添加到飼料中可以增加魚體的PepT1基因表達(dá)，促進魚體對氨基酸的吸收，從而提高大菱鲆幼魚的生長。

4 結(jié)語

飼料中添加9% 水解魚蛋白可以顯著提高大菱鲆幼魚的生長指標(biāo)，增加體內(nèi)游離氨基酸濃度，增強腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力和腸道內(nèi)PepT1基因的表達(dá)。添加水解魚蛋白還可以減少植物蛋白源對腸道的負(fù)面影響。本研究認(rèn)為水解魚蛋白可以成為大菱鲆幼魚的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。