宋利國(guó)， 宋維星， 王宜東， 周衍平， 洪 波， 季軍遠(yuǎn)??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100；2. 中國(guó)海洋大學(xué)山東省海洋環(huán)境地質(zhì)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100；3. 山東高速服務(wù)開(kāi)發(fā)集團(tuán)有限公司， 山東 濟(jì)南 250000)

人工濕地屬于生態(tài)水處理系統(tǒng)，主要通過(guò)微生物的硝化反硝化以及植物吸收作用實(shí)現(xiàn)廢水脫氮[1]。微生物硝化過(guò)程需要氧氣作為電子受體，人工濕地中的氧氣主要來(lái)源于大氣自然復(fù)氧、水體更新復(fù)氧和植物根系泌氧[2]，而三者提供的氧氣含量有限，使得硝化反應(yīng)進(jìn)程受限。雖然垂直潛流人工濕地比水平潛流人工濕地氧氣傳輸速率更高，但仍無(wú)法滿足濕地脫氮過(guò)程中對(duì)氧氣的需求，對(duì)TN的去除率也僅為30%～40%左右[3]，極大限制了其在廢水脫氮領(lǐng)域的推廣及工程應(yīng)用[4]。濕地植物對(duì)廢水中氮污染物的去除主要通過(guò)根系吸收作用，傳統(tǒng)垂直流人工濕地中植物根系多呈分散生長(zhǎng)，與廢水接觸面積有限，這直接影響植物吸收氮污染物的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

新型間歇增氧垂直流人工濕地見(jiàn)圖1。濕地為有機(jī)玻璃制成的圓柱體，內(nèi)徑30 cm，高80 cm。距底部45 cm處設(shè)有法蘭和密封蓋板。將濕地分為上下兩部分，下部自下而上依次填充粒徑30～50 mm的粗礫石(高度10 cm)、粒徑10～20 mm的細(xì)礫石(高度15 cm)、粒徑5～10 mm的煤渣(高度20 cm)；濕地上部由同心多孔圓環(huán)板分成三個(gè)區(qū)域，最內(nèi)為內(nèi)徑5 cm的曝氣區(qū)，底部開(kāi)口與濕地下部貫通，放置曝氣頭進(jìn)行人工曝氣，由氣體流量計(jì)控制曝氣流量，繼電器控制曝氣泵啟閉，向外為沙土降解區(qū)，由內(nèi)徑14、19和26 cm三層擋板構(gòu)成，填充粒徑1～3 mm沙土(高度25 cm)，濕地植物蘆葦種植在內(nèi)徑14和19 cm擋板組成的圓環(huán)區(qū)域內(nèi)，目的是限制根系發(fā)散生長(zhǎng)，形成根系屏障墻，充分發(fā)揮根系吸收作用和泌氧能力，促進(jìn)氮污染物去除；最外側(cè)為出水區(qū)，廢水經(jīng)濕地處理后由出水口排出。

圖1 間歇增氧垂直流人工濕地系統(tǒng)

1.2 試驗(yàn)廢水

表1 微量元素溶液組成成分

1.3 濕地系統(tǒng)運(yùn)行

濕地系統(tǒng)采用連續(xù)進(jìn)水方式，由濕地底部進(jìn)水，上部出水，進(jìn)水流量為10 L/d，HRT設(shè)定為48 h，間歇曝氣過(guò)程采用前期試驗(yàn)所獲取的最優(yōu)曝氣參數(shù)，即曝氣量2 m3/h、曝停周期6 h、曝停比0.25。繼電器控制曝氣泵啟閉。

1.4 分析指標(biāo)及測(cè)定方法

PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序：將對(duì)人工濕地定點(diǎn)取樣后，采用Power Soil DNA Isolation Kit，按照操作提取樣品中DNA，使用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。采用細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4擴(kuò)增區(qū)域，引物為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用OMEGA膠回收純化試劑盒純化后4 ℃保存。最后交由基質(zhì)取樣后進(jìn)行超聲、離心預(yù)處理，預(yù)處理后的樣本交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行DNA提取和測(cè)序。利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)在HiSeq 2500系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽度對(duì)人工濕地中污染物去除性能影響

表2 不同鹽度和進(jìn)水濃度下各污染物去除情況

圖2 鹽度對(duì)出水濃度(a)和去除率(b)的影響

圖3 鹽度對(duì)和出水濃度的影響

圖4 鹽度對(duì)TN出水濃度(a)和去除率(b)的影響

圖5 鹽度對(duì)出水COD濃度(a)和去除率(b)的影響

2.2 鹽度對(duì)人工濕地微生物群落影響

2.2.1 生物樣品測(cè)序結(jié)果與深度驗(yàn)證 8個(gè)樣品經(jīng)過(guò)測(cè)序后，得到的有效序列數(shù)平均為59 101個(gè)。按97%的一致性將序列聚類為OTUs，共得到1 915個(gè)OTUs，將得到的OTUs序列與Sliva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種的比較注釋，共有1 482個(gè)可以注釋到屬水平。稀釋曲線可以直觀反映測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性并在一定程度上間接反映物種多樣性，樣品的稀釋曲線見(jiàn)圖6。由圖6可知，樣品的測(cè)序量均在40 000后已經(jīng)趨于平緩，更多的測(cè)序量?jī)H產(chǎn)生少量的OTUs，說(shuō)明數(shù)據(jù)合理，測(cè)序深度足以包含樣本中絕大部分的微生物物種。提高鹽度以后的CW2-P1、CW2-P2、CW3-P1、CW3-P2、CW4-P1和CW4-P2樣本稀釋曲線對(duì)應(yīng)的OTUs均較無(wú)鹽工況(CW1-P1、CW1-P2)大，說(shuō)明各鹽度下物種多樣性均有所提高。

圖6 微生物樣品稀釋曲線

2.2.2 鹽度對(duì)微生物豐富度和多樣性影響 ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可分別表征微生物群落豐富度與多樣性，ACE、Chao1指數(shù)數(shù)值越高，代表物種豐富度越高，Simpson和Shannon指數(shù)數(shù)值越高，代表物種多樣性越高。生物樣品多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3，從表3中可知，8個(gè)生物樣品物種覆蓋率(Coverage)均高于99.5%，表明基質(zhì)樣品中絕大多數(shù)物種均涵蓋在高通量測(cè)序中，測(cè)序結(jié)果可準(zhǔn)確完整地反映濕地微生物樣品的真實(shí)情況。

表3 微生物樣品的Alpha多樣性指數(shù)分析

由表3分析得出，8個(gè)基質(zhì)樣品中，0.5%鹽度(CW2-P1、CW2-P2)、1.0%鹽度(CW3-P1、CW3-P2)、2.0% 鹽度(CW4-P1、CW4-P2)下樣品微生物的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均高于無(wú)鹽(CW1-P1、CW1-P2)下樣品微生物的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)，各鹽度下樣品中微生物的物種總數(shù)、菌落豐富度均較無(wú)鹽下顯著增大。濕地植物沙土區(qū)(P1)的4個(gè)樣品(CW1、CW2、CW3、CW4)微生物的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)以0.5%鹽度下(CW2)為最高，分別為1 260.387、1 222.439；曝氣底部填料區(qū)(P2)的4個(gè)樣品(CW1、CW2、CW3、CW4)微生物的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)以0.5%鹽度下(CW2)為最高，分別為1 349.208、1 322.524，0.5% 鹽度下樣品微生物的菌落豐富度最高。各鹽度下曝氣底部填料區(qū)樣品微生物的ACE均高于濕地植物沙土區(qū)，但隨鹽度增加，ACE指數(shù)差異減小，曝氣底部填料區(qū)微生物豐富度較濕地植物沙土區(qū)更高。

8個(gè)基質(zhì)樣品中，0.5%、1.0%和2.0%鹽度下樣品微生物的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均低于無(wú)鹽工況，兩個(gè)指數(shù)的最低值均出現(xiàn)在0.5%鹽度下，隨鹽度提升，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均逐步增大。無(wú)鹽工況下樣品微生物的多樣性指數(shù)最高，初期過(guò)渡到鹽環(huán)境下微生物的多樣性呈劇烈變化，且出現(xiàn)大幅降低，但此鹽度(0.5%鹽度)下微生物的均勻度最高；隨微生物對(duì)鹽度的逐步適應(yīng)，微生物多樣性又恢復(fù)至無(wú)鹽工況水平，表明鹽度對(duì)人工濕地系統(tǒng)微生物菌群分布及其多樣性產(chǎn)生了顯著影響。各鹽度下曝氣底部填料區(qū)樣品微生物的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于濕地植物沙土區(qū)樣品，但隨鹽度增加，兩者之間Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)差異均縮小，0.5% 鹽度下兩者的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)的差異最大，隨鹽度提升，兩者的微生物多樣性均有所增加，且兩者差異逐步減小。

2.2.3 鹽度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 為探究鹽度對(duì)人工濕地內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)影響，在物種門、綱、屬不同水平上進(jìn)行分類，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 微生物不同水平分布

從圖7可見(jiàn)，不同鹽度的8個(gè)基質(zhì)樣品(CW1-P1、CW1-P2、CW2-P1、CW2-P2、CW3-P1、CW3-P2、CW4-P1、CW4-P2)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落在門類水平上達(dá)到8門以上(見(jiàn)圖7A)，其中以變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)為主，在總序列中的占比為96.1%，其中對(duì)氮污染物去除占主要作用的為變形菌門，變形菌屬于革蘭氏陰性菌，多為兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?，是COD去除和脫氮過(guò)程的重要貢獻(xiàn)者[25]，其在P1(濕地植物沙土區(qū))的4個(gè)基質(zhì)樣品中的平均豐度為86.7%，在P2(曝氣底部填料區(qū))的4個(gè)基質(zhì)樣品中的平均豐度為85.9%，說(shuō)明濕地植物區(qū)更利于變形菌門生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)由圖7A可見(jiàn)，8個(gè)基質(zhì)樣品中變形菌門在鹽度的變化下豐度保持相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明其具有一定的耐鹽性。在綱類水平上(見(jiàn)圖7B)，優(yōu)勢(shì)菌群以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為主，其中γ-變形菌綱作為典型的氨氧化細(xì)菌[26]，在8個(gè)基質(zhì)樣品中的平均豐度為80.4%，且在濕地植物沙土區(qū)中的相對(duì)豐度(81.0%)同樣略高于曝氣底部填料區(qū)(79.8%)。在屬水平上(見(jiàn)圖7C)，樣品中微生物優(yōu)勢(shì)菌群有鐵氧化菌屬(Ferritrophicum)、硫發(fā)菌屬(Thiothrix)等，另有大部分屬于不可培養(yǎng)細(xì)菌(Others)，也為進(jìn)一步濕地中微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供方向。

在鹽脅迫下一些非脫氮菌屬也發(fā)生了豐度變化。Ferritrophicum參與鐵氧化過(guò)程，對(duì)鐵及碳、氮、磷等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)具有重要意義，在各個(gè)鹽度下均占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。Thiothrix作為菌膠團(tuán)附著的載體，在無(wú)鹽度下豐度低于10%，在0.5%鹽度下豐度大幅提高至71%，使樣品中微生物豐富度顯著提升；隨著鹽度繼續(xù)提升，該菌豐度有所下降，但仍維持在50%左右，表明鹽脅迫會(huì)促進(jìn)硫發(fā)菌屬生長(zhǎng)繁殖。從圖7C中可得出，CW1-P2菌種分布最為均勻，而表3中CW1-P2也具有最大的Simpson和Shannon指數(shù)，證實(shí)此鹽度下的微生物多樣性最大，而CW2-P1中的Thiothrix占比高達(dá)71%，其他菌種總豐度不足30%，對(duì)應(yīng)的表3中CW2-P1的Simpson和Shannon指數(shù)最小。

3 結(jié)論

(2) 不同鹽度、濕地不同區(qū)域(水生植物沙土區(qū)、曝氣底部填料區(qū))微生物的種群和相對(duì)豐度差別較大，0.5%、1.0%、2.0%鹽度下濕地微生物豐富度均高于無(wú)鹽工況，且0.5%鹽度下微生物豐富度最高；各鹽度下曝氣底部填料區(qū)微生物豐富度均高于濕地植物沙土區(qū)；鹽脅迫初期(0.5%鹽度)濕地微生物多樣性較無(wú)鹽下顯著降低，但隨著對(duì)鹽脅迫環(huán)境的逐步適應(yīng)，微生物多樣性初步恢復(fù)并接近無(wú)鹽工況水平。鹽度對(duì)人工濕地系統(tǒng)微生物菌群分布及其多樣性產(chǎn)生了顯著影響。

(3) 微生物在門分類水平上是以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)為共有的優(yōu)勢(shì)菌門，在綱分類水平上以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為主。屬分類水平上，隨著鹽度由0.0%提升至2.0%，氨氧化細(xì)菌(Nitrosomonas)、亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(Nitrospiraceae)平均豐度均降低，分別由2.5%、1.7%降至0.5%、0.3%，表明其對(duì)鹽度的耐受能力較差；具有反硝化功能的Thiobacillus和Denitratisoma平均豐度較高(分別為11.6%、5.4%)且保持相對(duì)穩(wěn)定，表明其對(duì)鹽脅迫具有較好的耐受性。