黃小松，章榮軍，崔明娟，鄭俊杰

(華中科技大學(xué) 巖土與地下工程研究所，武漢 430074)

近年來，MICP技術(shù)在重金屬污染土體/水體修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力被廣泛探究。MICP技術(shù)利用微生物固定重金屬離子，可降低重金屬的可遷移性、活性和生物毒性[8]。大量研究從污染環(huán)境中分離出重金屬耐受性強(qiáng)的土著微生物，如黃色考克氏菌(KocuriaflavaCR1)[9]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[10]、微桿菌(Exiguobacteiumundae)[11]、蠟狀芽孢桿菌(BacilluscereusYR5)[12]和腫大地桿菌(Terrabactertumescens)[13]等，并探究其固定/去除重金屬的潛力。但研究發(fā)現(xiàn)，相較于巴氏芽孢桿菌(Sporosarcinapasteurii)，其他土著微生物的脲酶表達(dá)量較低。

巴氏芽孢桿菌適應(yīng)性強(qiáng)、脲酶活性高、環(huán)境友好[14]，此前主要應(yīng)用于砂土固化等領(lǐng)域[15-16]。近年來，部分學(xué)者開創(chuàng)性地將巴氏芽孢桿菌應(yīng)用于重金屬污染水體的修復(fù)，并證明其具有去除重金屬的潛力[13,17-18]。但研究顯示，超過一定濃度后重金屬會(huì)抑制微生物活性，影響生物修復(fù)效果，如Cu2+易被微生物吸收，致使其蛋白質(zhì)變性并喪失功能；同時(shí)，生物礦化形成的碳酸銅沉淀會(huì)附著在碳酸鈣表面，從而阻止MICP反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行[17-18]，因此，有必要在高濃度范圍內(nèi)探究巴氏芽孢桿菌固定/去除重金屬的能力。此外，常用的生物修復(fù)工藝效率較低[17-18]。目前大部分研究?jī)H根據(jù)MICP理論分析巴氏芽孢桿菌固定/去除重金屬的機(jī)理，較難解釋生物修復(fù)這一復(fù)雜的生物化學(xué)過程。

為避免腐殖土體顆粒和滲濾液物化特性的影響，筆者以Zn、Cu、Ni、Cd和Cr(Ⅲ)等重金屬污染溶液為研究對(duì)象，采用簡(jiǎn)單拌和法開展生物修復(fù)重金屬污染溶液試驗(yàn)，確定巴氏芽孢桿菌對(duì)不同重金屬的去除能力，并分析修復(fù)時(shí)間、重金屬種類和濃度等因素對(duì)生物修復(fù)效果的影響；基于MICP和化學(xué)平衡理論，利用Visual MINTEQ軟件對(duì)微生物修復(fù)重金屬污染溶液的過程進(jìn)行簡(jiǎn)化模擬，對(duì)比試驗(yàn)和模擬結(jié)果，并結(jié)合XRD表征結(jié)果，分析微生物固定/去除重金屬的機(jī)理。

1 試驗(yàn)內(nèi)容

1.1 試驗(yàn)用菌種

試驗(yàn)使用從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)入的巴氏芽孢桿菌(Sporosarcinapasteurii)，菌種編號(hào)為CGMCC 1.3687。菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)均使用相同的培養(yǎng)液，其成分包括：20 g/L酵母提取物、10 g/L NH4Cl、10 mg/L MnSO4·H2O和24 mg/L NiCl2·6H2O。將各成分按比例混合均勻后，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至8.5。接種微生物前，培養(yǎng)液需經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。菌種活化時(shí)，取適量購(gòu)入的細(xì)菌凍干粉加入100 mL無(wú)菌培養(yǎng)液中，在30 ℃、170 r/min搖床中培養(yǎng)48 h。基于活化后的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到試驗(yàn)用菌液，使用分光光度計(jì)測(cè)得菌液光密度(OD600)為2.0左右，脲酶活性為10 U/mL。培養(yǎng)完成的菌液需放置在4 ℃恒溫環(huán)境中保存。

1.2 微生物修復(fù)重金屬污染溶液

1.2.1 試驗(yàn)工況 試驗(yàn)主要探究重金屬種類、濃度和修復(fù)時(shí)間對(duì)生物修復(fù)效果的影響。設(shè)置Zn、Cu、Ni、Cd和Cr(Ⅲ)5個(gè)試驗(yàn)組。各試驗(yàn)組根據(jù)重金屬初始濃度分為6個(gè)工況，工況0不添加重金屬，為對(duì)照組；工況1中重金屬濃度根據(jù)《綠化種植土壤》[19]重金屬含量技術(shù)要求值(Ⅲ級(jí))換算得到，工況2～5中重金屬濃度在工況1的基礎(chǔ)上依次遞增。此外，分別在1、2、4、8、12、24、48 h檢測(cè)各試驗(yàn)參數(shù)。具體試驗(yàn)方案見表1。

表1 微生物修復(fù)重金屬污染溶液試驗(yàn)方案

1.2.2 試驗(yàn)步驟 微生物修復(fù)重金屬污染溶液試驗(yàn)包括制備重金屬污染溶液和生物修復(fù)重金屬污染溶液兩大步驟：

2)制備生物修復(fù)重金屬污染溶液：生物修復(fù)試驗(yàn)在250 mL燒杯中進(jìn)行，將50 mL菌液與同體積的重金屬污染溶液混合均勻?；旌贤瓿蓵r(shí)尿素和CaCl2的濃度為0.5 mol/L，各重金屬離子濃度見表1。分別在不同時(shí)間測(cè)定pH值、重金屬離子濃度和Ca2+濃度等試驗(yàn)參數(shù)。其中，pH值使用pH計(jì)(pH-100A)測(cè)定；重金屬離子濃度和Ca2+濃度使用原子吸收分光光度計(jì)(AA-6880)測(cè)定。試驗(yàn)中同種工況設(shè)置3個(gè)平行試樣，測(cè)試值平均后得到最終的結(jié)果。

1.2.3 試驗(yàn)指標(biāo) 采用生物修復(fù)完成率(γi)、重金屬殘余率(δ)和Ca2+殘余率(ε)等試驗(yàn)指標(biāo)表示生物修復(fù)的進(jìn)行程度和效果，計(jì)算過程見式(1)～式(3)。其中，αi和βi分別為ih的重金屬離子濃度和Ca2+濃度。由于48 h時(shí)生物修復(fù)反應(yīng)基本完成，因此，將ih已去除重金屬濃度(α0-αi)與48 h已去除重金屬濃度(α0-α48)相比得到生物修復(fù)完成率，以表示生物修復(fù)進(jìn)行程度，1～48 h時(shí)生物修復(fù)完成率小于等于100%。重金屬殘余率(δ)和Ca2+殘余率(ε)則是48 h時(shí)溶液中殘余離子濃度(α48或β48)占初始離子濃度(α0或β0)的百分比，以此表征生物修復(fù)效果。殘余率(δ或ε)越高，生物修復(fù)效果越差。

(1)

(2)

(3)

1.3 Visual MINTEQ軟件模擬

1.4 XRD分析

使用X射線衍射儀分析試驗(yàn)生成固相沉淀的成分。在進(jìn)行X射線衍射分析前，將收集的沉淀烘干并研磨，并用0.1 mm細(xì)篩篩分。檢測(cè)的結(jié)果使用軟件MDI Jade 6鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物修復(fù)完成率與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系

相同試驗(yàn)組(重金屬種類相同)不同工況(重金屬濃度不同)下的生物修復(fù)完成率隨時(shí)間的變化差異不大，因此，圖1僅展示各試驗(yàn)組工況1的生物修復(fù)完成率與時(shí)間的關(guān)系。如圖1所示，Cr(Ⅲ)試驗(yàn)組的生物修復(fù)完成率幾乎不隨修復(fù)時(shí)間變化，始終接近100%，表明溶液中游離態(tài)的Cr(Ⅲ)在微生物誘導(dǎo)下迅速沉淀。隨著反應(yīng)進(jìn)行，Ni、Zn、Cd試驗(yàn)組的生物修復(fù)逐漸完成，并分別在24、24、2 h時(shí)趨于穩(wěn)定。由于Cu2+未被去除，因此圖中顯示Cu試驗(yàn)組生物修復(fù)完成率為0。

圖1 生物修復(fù)完成率與時(shí)間的關(guān)系

其他學(xué)者在開展生物修復(fù)重金屬污染溶液試驗(yàn)時(shí)菌液與污染溶液體積比較小，并在微生物生長(zhǎng)過程中修復(fù)重金屬，通常需要72 h才能完成修復(fù)處理，如表2所示。試驗(yàn)采用簡(jiǎn)單拌和法，將菌液和污染溶液按照體積比1∶1進(jìn)行混合，提高溶液體系菌液初始濃度，早期脲酶濃度增多，尿素快速水解，因此，生物修復(fù)速率顯著提高。

表2 生物修復(fù)時(shí)間統(tǒng)計(jì)

2.2 重金屬生物修復(fù)效果

圖2～圖4分別展示了48 h時(shí)重金屬殘余率、Ca2+殘余率、pH值與重金屬種類和濃度的關(guān)系。在本研究的重金屬濃度范圍內(nèi)，以重金屬殘余率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，將巴氏芽孢桿菌對(duì)不同重金屬的生物修復(fù)效果分為：

1)良好且穩(wěn)定，如對(duì)重金屬Cd和Cr(Ⅲ)。Cd和Cr(Ⅲ)試驗(yàn)組的重金屬殘余率均接近0%(如圖2所示)，Ca2+殘余率低于10%(如圖3所示)。此外，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)修復(fù)處理后溶液體系的pH值呈現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)，最終達(dá)7.4左右(如圖4所示)。Li等[13]和Jalilvand等[17]同樣發(fā)現(xiàn)，巴氏芽孢桿菌對(duì)Cd2+耐受性強(qiáng)，生物修復(fù)效果好。此外，此前研究表明微生物可通過誘導(dǎo)Cr(Ⅵ)生成CaCrO4或?qū)r(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)以完成去除[21-22]，但幾乎沒有研究探究微生物對(duì)Cr(Ⅲ)的去除。研究結(jié)果顯示，巴氏芽孢桿菌同樣可有效去除Cr(Ⅲ)，具體機(jī)理將結(jié)合Visual MINTEQ軟件模擬結(jié)果和XRD結(jié)果進(jìn)行分析。

圖2 重金屬殘余率與重金屬種類和濃度的關(guān)系

圖3 Ca2+殘余率與重金屬種類和濃度的關(guān)系

圖4 pH值與重金屬種類和濃度的關(guān)系

2)非穩(wěn)定，如對(duì)重金屬Zn。圖2顯示，當(dāng)Zn2+濃度在500～1 000 mg/L范圍時(shí)，重金屬殘余率低于10%。但當(dāng)離子濃度高于1 000 mg/L時(shí)，重金屬殘余率迅速增加，最終達(dá)到47.5%。同時(shí)，Ca2+殘余率明顯增加(如圖3所示)。因此，在研究濃度范圍內(nèi)，隨著Zn2+初始濃度增加，生物修復(fù)效果明顯降低。Jalilvand等[17]研究表明，Zn2+最低抑制濃度為195 mg/L；Mugwar等[18]同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Zn2+初始濃度高于130 mg/L時(shí)，巴氏芽孢桿菌活性開始受到抑制。綜上所述，巴氏芽孢桿菌僅可在一定濃度范圍內(nèi)高效去除Zn2+。

3)欠佳，如對(duì)重金屬Ni和Cu。Ni試驗(yàn)組結(jié)果顯示，Ca2+殘余率穩(wěn)定在20%～30%(如圖3所示)，表明Ni2+不會(huì)顯著抑制微生物活性，但Ni2+殘余率始終保持在80%～92%(如圖2所示)，生物修復(fù)效果不佳。Gheethi等[23]研究表明，當(dāng)Ni2+濃度在0.1～0.8 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，巴氏芽孢桿菌可通過生物富集作用去除50%～80%的重金屬離子，且隨著Ni2+初始濃度增加，生物去除率降低。因此，研究中巴氏芽孢桿菌可能同樣通過生物富集作用去除Ni2+，但由于Ni2+濃度較高，導(dǎo)致生物修復(fù)率始終較低。

Cu試驗(yàn)組結(jié)果顯示，在本研究濃度范圍內(nèi)(Cu2+初始濃度為400～2 000 mg/L)，重金屬殘余率和Ca2+殘余率均接近100%(如圖2和圖3所示)，且與其他試驗(yàn)組不同的是，經(jīng)生物修復(fù)后Cu試驗(yàn)組pH值略微降低(如圖4所示)。試驗(yàn)的上述現(xiàn)象(如圖2和圖3所示)表明，溶液中的尿素或并沒有被微生物水解，巴氏芽孢桿菌的活性可能完全喪失。其他研究表明，即使當(dāng)Cu2+濃度較低(32～320 mg/L)時(shí)，巴氏芽孢桿菌對(duì)Cu2+去除效果仍不佳[18,24-25]。因此， Cu2+濃度相對(duì)較高，微生物活性被顯著抑制。

2.3 試驗(yàn)值和模擬值的比較

圖5和圖6分別為不同試驗(yàn)組重金屬殘余率和Ca2+殘余率試驗(yàn)值和模擬值的比較。由于通過純化學(xué)平衡不能生成Cd相關(guān)的沉淀，因此，Cd試驗(yàn)組重金屬殘余率模擬值為100%(圖5(a))。圖5(b)～(e)顯示，Cr(Ⅲ)、Zn、Cu和Ni試驗(yàn)組的重金屬殘余率模擬值基本穩(wěn)定在10%以下，其中，模擬結(jié)果顯示游離態(tài)Cu2+、Ni2+、Zn2+可分別轉(zhuǎn)化為CuCO3、NiCO3、ZnCO3，Cr3+則以Cr2O3形式沉淀。圖6(a)～(e)表明，溶液體系中的Ca2+幾乎可完全被誘導(dǎo)生成CaCO3沉淀。綜上，基于MICP和化學(xué)平衡理論，在尿素完全水解時(shí)，大部分金屬離子將以碳酸鹽或氧化物的形式沉淀。

圖5(b)和圖6(b)顯示，Cr(Ⅲ)試驗(yàn)組的試驗(yàn)值和模擬值基本一致。但其他試驗(yàn)組的試驗(yàn)值和模擬值存在差異：1)圖5(a)顯示Cd試驗(yàn)組重金屬殘余率試驗(yàn)值幾乎為0%，但模擬結(jié)果顯示無(wú)Cd相關(guān)沉淀生成。由于純化學(xué)平衡不能生成Cd相關(guān)沉淀，但有研究表明Cd2+可能通過CaCO3的吸附作用被去除[26]，因此，試驗(yàn)值和模擬值差異較大；2)圖5(c)、(d)和圖6(c)、(d)顯示，Zn和Cu試驗(yàn)組的重金屬殘余率和Ca2+殘余率試驗(yàn)值不同程度地高于模擬值。已有研究表明，超過重金屬最低抑制濃度后，重金屬會(huì)抑制微生物活性，尿素水解不充分或幾乎未被水解，生物修復(fù)反應(yīng)被抑制或終止[17-18,24-25]。因此，試驗(yàn)中Cu2+和Zn2+濃度較高，巴氏芽孢桿菌活性受到抑制；3)試驗(yàn)表明，巴氏芽孢桿菌可能通過生物富集作用去除Ni2+,但去除效果有限，因此，試驗(yàn)值和模擬值存在較大差異(圖5(e)和圖6(e))。

圖5 重金屬殘余率試驗(yàn)值和模擬值

圖6 Ca2+殘余率試驗(yàn)值及模擬值

2.4 XRD分析

圖7 XRD分析結(jié)果

3 結(jié)論

通過巴氏芽孢桿菌生物修復(fù)重金屬污染溶液試驗(yàn)，對(duì)比試驗(yàn)值和Visual MINTEQ軟件模擬值，并結(jié)合XRD對(duì)固相沉淀成分的分析結(jié)果，得到如下結(jié)論：

1)巴氏芽孢桿菌具有高效修復(fù)高濃度重金屬污染溶液的潛力。在本研究重金屬濃度范圍內(nèi)，巴氏芽孢桿菌幾乎可完全去除Cr(Ⅲ)、Cd2+；隨著Zn2+初始濃度增加，其修復(fù)效果降低，具體表現(xiàn)為重金屬殘余率從3.7%增至47.5%；但巴氏芽孢桿菌對(duì)Ni2+和Cu2+去除效果不佳。

2)巴氏芽孢桿菌可能通過生物礦化和生物富集作用去除重金屬離子，如巴氏芽孢桿菌可誘導(dǎo)Cr(Ⅲ)和Zn2+生成氧化物和碳酸鹽沉淀，并可能通過生物富集作用去除Ni2+。

3)研究采用的簡(jiǎn)單拌和法操作簡(jiǎn)便，生物修復(fù)效率更高，具有生物修復(fù)重金屬污染溶液和沉積物工程應(yīng)用的潛力。