劉金河，張望明，晏文濤,向 天，羅 維，楊凱琳，徐澤權(quán)，劉杰麟

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550001;4.貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

Bloom DNA解旋酶(bloom DNA helicase,BLM)是RecQ解旋酶家族中的一員，能利用三磷酸腺苷(ATP)和其他三磷酸核苷水解釋放的能量解開雙鏈DNA或G四鏈體，是核酸復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、端粒穩(wěn)定等代謝過(guò)程的重要組成部分[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，BLM基因突變能引起皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[3]和前列腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)喹唑啉酮為母核合成的衍生物中，9 h能顯著抑制BLM 解旋酶與DNA的結(jié)合活力，也促進(jìn)端粒DNA的瓦解，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，研究小分子對(duì)BLM DNA解旋酶功能的影響及以BLM DNA解旋酶為靶向的腫瘤治療具有重要意義。

漢防己甲素(tetrandrine，TET)是一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有廣泛的抗腫瘤活性，例如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該藥物毒性小、副作用低，后期成藥性較好。TET能通過(guò)上調(diào)IGFBP-5蛋白的表達(dá)增強(qiáng)p53蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖[7]，Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TET通過(guò)調(diào)節(jié)CCND1/CDK4化合物及其下游蛋白磷酸化Rb(p-Rb)抑制結(jié)腸癌 HT-29 細(xì)胞的生長(zhǎng)。Bhagya等[9]證實(shí)了TET激活活性氧(reactive oxygen species，ROS)進(jìn)而通過(guò)caspase 途徑誘導(dǎo)乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞凋亡，Sun等[10]發(fā)現(xiàn)TET檸檬酸鹽上調(diào) ROS 水平，下調(diào)Bcl-2以及上調(diào)cleaved caspase-3、Fas、p-p38和 p-JNK 的表達(dá)水平來(lái)介導(dǎo)抗腫瘤活性。因此TET抗癌潛在分子機(jī)制可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)[6]。

目前研究漢防己甲素衍生物對(duì)腫瘤抑制作用的文章不多，以BLM DNA解旋酶作為靶點(diǎn)，分析其與BLM DNA解旋酶相互作用的分子機(jī)制的文章鮮見報(bào)道。本文擬使用熒光偏振檢測(cè)、紫外光譜掃描、孔雀綠-磷鉬酸銨比色等技術(shù)和方法，通過(guò)研究漢防己甲素衍生物HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的影響，揭示漢防己甲素衍生物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑漢防己甲素衍生物HL-49：(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室潘衛(wèi)東教授課題組)提供；ssDNA底物委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。序列如下：A1(45bp)：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGTTAGGTTAGGTT-AGTTTTTTTTTT-3′；A2(21bp)：3′-FAM-TTAGGCA-GCTCGTCTCAATCC-5′。(注：FAM為羧基熒光素)。

DNA底物雜交緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1NaCl，pH 7.9)；熒光偏振實(shí)驗(yàn)反應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，25 mmol·L-1NaCl，3 mmol·L-1MgCl2和0.1 mmol·L-1DTT，pH 7.9)；紫外光譜實(shí)驗(yàn)緩沖液buffer C (20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1咪唑，10%甘油，pH 7.9)；ATPase活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所需三乙醇胺、孔雀綠、鉬酸銨均用雙蒸水進(jìn)行配置。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器NGCTM蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；高壓細(xì)胞破碎儀(英國(guó)Constant Systems公司)；Synergy 4多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore Corp公司)。

1.3 方法

1.3.1BLM DNA解旋酶的制備、純化 將表達(dá) BLM DNA 解旋酶的重組大腸桿菌置于含有 50 mg·L-1氨芐青霉素+30 mg·L-1氯霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r·min-1的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.5。然后轉(zhuǎn)到18 ℃、180 r·min-1的條件，加入終濃度0.4 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)Bloom DNA解旋酶表達(dá)20 h，隨后在4 ℃、4 000 r·min-1的條件下離心15 min收集菌體。使用高壓細(xì)胞破碎儀在21 kpsi壓力下進(jìn)行一次性破碎，收集流出液，4 ℃、13 000 r·min-1的條件下離心45 min收集上清液，通過(guò)鎳親和層析和分子篩層析進(jìn)行分離純化，獲得能用于進(jìn)行酶生物學(xué)特性研究的重組BLM DNA解旋酶[11]。

1.3.2HL-49對(duì) BLM DNA解旋酶紫外光譜的影響 Buffer C 緩沖液(pH 7.9)中加入終濃度為2.7 μmol·L-1的BLM DNA解旋酶與不同終濃度(0～20 μmol·L-1)的HL-49，保持整個(gè)反應(yīng)體系總體積為200 μL。將混合液置于紫外分光光度計(jì)測(cè)量室內(nèi)，設(shè)定掃描速度為中等速度，掃描波長(zhǎng)間隔為1 nm，在230～300 nm波段下進(jìn)行掃描，以每5 min掃描1次的頻率掃描至平衡,取3次平衡值的圖譜進(jìn)行擬合。根據(jù)光譜峰值和峰形的變化即可判定蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否發(fā)生變化[11]。再用相同的方法掃描其余不同終濃度(0～20 μmol·L-1)的 HL-49 在buferC緩沖液中的紫外吸收光譜。

1.3.3HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶的DNA結(jié)合活性的影響 本實(shí)驗(yàn)采用熒光偏振法測(cè)定 HL-49對(duì) DNA與BLM DNA解旋酶結(jié)合活性的影響。采用2種方式研究 HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶 DNA結(jié)合活性的影響[12]。第1種，25 ℃下，用不同濃度的HL-49(0～25.33 μmol·L-1)滴定BLM DNA解旋酶與2 nmol·L-1的DNA(A2或A1A2)相互孵育形成的復(fù)合物；第2種是25 ℃下，不同濃度的HL-49先與BLM DNA解旋酶反應(yīng)5 min，再加入到含2 nmol·L-1DNA(ssDNA/dsDNA)的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為3～5個(gè)穩(wěn)定偏振值平均之后的結(jié)果。通過(guò)調(diào)節(jié)雙蒸水的體積，使實(shí)驗(yàn)的總體積保持在150 μL。

1.3.4HL-49 對(duì) BLM DNA 解旋酶 DNA 解鏈活性的影響 本實(shí)驗(yàn)采用熒光偏振法檢測(cè)HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶DNA解鏈活性的影響。取終濃度為75 nmol·L-1的BLM DNA解旋酶與不同終濃度(0～20 μmol·L-1)的HL-49混勻，在室溫下孵育5 min，加入到含2 nmol·L-1的dsDNA的反應(yīng)緩沖液中，測(cè)定熒光偏振值至穩(wěn)定，再加入終濃度為0.2 mmol·L-1的ATP，測(cè)定熒光偏振值至穩(wěn)定。取各個(gè)反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)5～7個(gè)的熒光偏振值的平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過(guò)調(diào)節(jié)雙蒸水的體積，使本次實(shí)驗(yàn)的總體積保持在150 μL。DNA解鏈的速率常數(shù)可根據(jù)方程(1)獲得：

At=A1exp(-kobst)

(1)

式中At是解鏈時(shí)間為t時(shí)的熒光偏振值，A1是解旋酶與dsDNA完全結(jié)合時(shí)的熒光偏振值。

1.3.5HL-49 對(duì) BLM DNA 解旋酶 ATP 酶活性的影響 本實(shí)驗(yàn)采取孔雀綠-磷鉬酸銨比色法來(lái)測(cè)定 HL-49 對(duì) BLM DNA解旋酶 ATPase 活性的影響。首先，反應(yīng)緩沖液(50 mmol·L-1三乙醇胺、50 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1MgCl2，pH 7.5)中加入終濃度為100 nmol·L-1的ssDNA，終濃度為75 nmol·L-1的 BLM DNA 解旋酶和不同終濃度(0～100 μmol·L-1)的HL-49于室溫下孵育10 min。隨后加入終濃度為2 mmol·L-1的ATP，在室溫下分別孵育(0、5、10、15、20、25、30)min，通過(guò)調(diào)節(jié)雙蒸水的體積，使本次反應(yīng)的總體積保持在75 μL。然后取 50 μL上述反應(yīng)液迅速加入850 μL染液(36 mL 0.045%孔雀綠溶液，12 mL 4.2%鉬酸銨溶液，1 mL 1%的Triton X-100)中以終 ATP的水解反應(yīng)，在3 min時(shí)，往染液中加入100 μL 34% 的檸檬酸溶液來(lái)終止顯色反應(yīng)。終止顯色反應(yīng)后，各不同濃度藥物組吸取100 μL 加至96孔板中，于660 nm波長(zhǎng)處讀值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用國(guó)際單位定義表示酶量的多少，即每分鐘催化1 μmol底物水解所需的酶量為1個(gè)國(guó)際單位(unit)。酶活力Activity(kU·L-1·min-1)可通過(guò)以下公式(2)計(jì)算

(2)

式中，A是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的磷酸鹽濃度(μmol·L-1)，B是反應(yīng)時(shí)間(min)。

2 結(jié)果

2.1 HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶的構(gòu)象無(wú)影響HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶紫外光譜影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Fig 2。對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，肽鍵的強(qiáng)吸收峰一般出現(xiàn)在210～240 nm處，而芳香族氨基酸殘基中共軛雙鍵的吸收峰出現(xiàn)在280 nm附近。由 Fig 2A可以看出，HL-49在238 nm和280 nm 處具有兩個(gè)峰。隨著HL-49濃度的增加，BLM DNA 解旋酶在236 nm和280 nm處的峰位置和峰型未發(fā)生明顯變化(Fig 2B)，再結(jié)合HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶在236 nm和280 nm處的紫外吸收值約等于HL-49和BLM之和(Fig 2C)可知兩者之間并無(wú)相互作用，由此推斷HL-49不能改變BLM DNA解旋酶的三維構(gòu)象。

Fig 1 Determination of BLM DNA helicase purity after molecular sieve chromatography

2.2 HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶的DNA結(jié)合活性無(wú)影響HL-49對(duì)BLM解旋酶的DNA結(jié)合活性的影響見Fig 3。由圖Fig 3A和Fig 3B可知，無(wú)論是dsDNA(Fig 3A)還是ssDNA(Fig 3B)作為底物，HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶因結(jié)合而增加的熒光偏振值影響非常小，也不具濃度依賴性，熒光偏振值的增量(ΔA1，ΔA2)無(wú)明顯變化(P>0.05)，說(shuō)明HL-49并不影響B(tài)LM DNA解旋酶與DNA的結(jié)合；然而，HL-49 單獨(dú)滴定dsDNA或者ssDNA 時(shí)，熒光偏振值的增量(ΔA3)隨著HL-49濃度的增加而明顯增大(P<0.01)，說(shuō)明HL-49可與DNA(dsDNA or ssDNA)相結(jié)合(Fig 3C)，且結(jié)合能力與HL-49的濃度呈正相關(guān)。

Fig 2 The Ultraviolet (UV)absorption spectra of HL-49 interacted with BLM DNA helicaseA:The changes of UV absorption spectra by different concentrations of HL-49;B:The changes of UV absorption spectra by different concentrations of HL-49 interacted with BLM helicase treatment;C:The UV absorption spectra of BLM (2.7 μmol·L-1)，BLM (2.7 μmol·L-1)and HL-49(10 μmol·L-1)，HL-49(10 μmol·L-1 );D:The titration curve of BLM helicase for the addition of HL-49 at the 236 nm.

2.3 HL-49能抑制 BLM DNA 解旋酶的DNA解鏈活性利用熒光偏振方法研究HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶的DNA解鏈活性的影響。由Fig 4A可知，隨著反應(yīng)體系中HL-49終濃度的逐漸增加(0～25.33 μmol·L-1)，因解鏈而降低的熒光偏振值(A1-A2)逐漸減小，表明BLM DNA 解旋酶的解鏈活性與HL-49的濃度呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)公式(1)進(jìn)一步分析HL-49存在下BLM解旋酶的Kobs值的變化(Fig 4B)，可知隨著HL-49濃度的增加，BLM解旋酶的Kobs值逐漸減小，表明HL-49能夠明顯抑制BLM解旋酶的DNA解鏈活性。

Fig 3 Effects of HL-49 on DNA-binding activity of BLM DNA Fluorescence anisotropy values were determined as a function of the helicase concentration both A and B.C:The effects of HL-49 on dsDNA and ssDNA were assayed by fluorescence polarized technology.2 nmol·L-1 DNA substrate was pre-incubated in the DNA binding buffer for 5 min at 25 ℃.ΔA1 and ΔA2 represent the increased value of the total fluorescence polarization value after the addition of HL-49 minus the fluorescence polarization value of DNA.ΔA3 represents the total fluorescence polarization value of HL-49 after addition minus the value of DNA.

Fig 4 Effects of HL-49 on DNA unwinding activity of BLM DNA A：Effects of different concentrations of HL-49 on the unwinding activity of BLM.B：The change of Kobs values of the BLM helicase to dsDNA in the presence of different concentrations of HL-49.The Kobs values were calculated from equation (1).A1 is the fluorescence polarization value of HL-49 interacting with BLM helicase and DNA at different concentrations.A2 is the fluorescence anisotropy of the reaction system after the addition of 2 nmol·L-1 ATP.

2.4 HL-49 能抑制BLM DNA 解旋酶的ATPase活性由Fig 5A所示可知，隨著HL-49濃度的逐漸增加，BLM DNA解旋酶的ATPase活性逐漸降低，揭示出BLM DNA解旋酶的酶活力與HL-49的濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。由Fig 5B可知，在相同HL-49濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(0～30 min)，BLM DNA解旋酶的酶活力逐漸下降。通過(guò)米氏方程雙倒數(shù)作圖法進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算出酶反應(yīng)的Vmax、Km等常數(shù)，結(jié)果見Tab 1，可知隨著HL-49濃度的增加，Vmax保持不變，而Km逐漸增大，且Kcat減小，說(shuō)明HL-49對(duì)BLM DNA解旋酶的作用為可逆性競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

Fig 5 Effects of HL-49 on ATPase activity A：Curves of activity that based on the equation (2)of recombinant BLM helicase in the presence of different concentrations of HL-49.In each reaction，DNA was present at a concentration of 100 nmol·L-1 and ATP was 2 mmol·L-1.B：Time course of ATP hydrolysis by 2.7 μmol·L-1 recombinant BLM helicase in the presence of different concentrations of HL-49 at 30 min.Experiments were performed at 25 ℃ in ATPase activity assay buffer containing 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7.9)，2.5 mmol /L MgCl2.

Tab 1 The ATPase activity constants of HL-49 interacted with BLM DNA helicase

3 討論

由紫外光譜掃描和DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，HL-49不會(huì)改變BLM DNA解旋酶的構(gòu)象，也不會(huì)與其相互結(jié)合，且能與DNA(dsDNA/ssDNA)相互結(jié)合并具濃度依賴性。DNA解鏈活性的結(jié)果顯示：隨著HL-49濃度增大，BLM DNA解旋酶的解鏈活性逐漸受到抑制，抑制作用明顯(P<0.01)。ATPase活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低，且隨著HL-49濃度的增加，ATPase活性逐漸降低。由此可知，BLM DNA解旋酶的ATPase活性具時(shí)間依賴性和濃度依賴性，進(jìn)一步分析酶的相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km逐漸增大、Vmax不變且Kcat值減小，可知HL-49抑制BLM DNA解旋酶生物學(xué)活性的類型為DNA的可逆性競(jìng)爭(zhēng)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，HL-49抑制BLM DNA解旋酶的生物學(xué)活性的可能機(jī)制為HL-49可逆性結(jié)合于DNA(ssDNA/dsDNA)鏈上，阻礙BLM DNA解旋酶與DNA的結(jié)合，進(jìn)而影響B(tài)LM DNA解旋酶的DNA解鏈活性和ATPase活性。

BLM DNA解旋酶作為人體細(xì)胞當(dāng)中存在的一種具解開雙鏈DNA活性的蛋白，在DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和端粒維持的功能中發(fā)揮重要作用。BLM基因的表達(dá)異常造成BS綜合征，其臨床表現(xiàn)為高水平的姐妹染色單體互換、身材矮小、免疫系統(tǒng)缺陷、不孕不育、癌癥發(fā)生率高[12]。

BLM DNA解旋酶在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，但表達(dá)水平因腫瘤細(xì)胞系而異[13]，故以BLM DNA解旋酶為抗癌研究靶標(biāo)，利用小分子化合物抑制癌癥細(xì)胞中BLM DNA解旋酶的表達(dá)及活性，抑制細(xì)胞的增殖，最終抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，在理論上是可行的。因此，尋找一種療效好，副作用低，成本低廉且靶向抑制BLM DNA解旋酶活性的小分子化合物具有顯著的臨床意義。而漢防己甲素目前作為臨床常用藥物，普遍用來(lái)治療各種炎癥反應(yīng)，毒副作用很小，且提煉成本較低，具有先天優(yōu)勢(shì)，在此基礎(chǔ)上改造而來(lái)的一系列漢防己甲素衍生物，比如HJNO,HL-49[14-15]，都表現(xiàn)出了很好的抗腫瘤活性，而本文對(duì)HL-49抑制腫瘤的分子機(jī)制的研究印證了其抗腫瘤活性。該研究的結(jié)果能為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)提供一定的參考。