龐媛媛 盧志賢 任惠明

摘要：目的 改進(jìn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），探討其在病原體檢測中的檢測限。方法 以結(jié)核分枝桿菌核酸檢測為實(shí)例，建立兩組閉管LAMP反應(yīng)系統(tǒng)：使用錫紙隔離SYBR greenⅠ的反應(yīng)組及提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍(lán)）的反應(yīng)組，評(píng)估兩種方法的檢測限、污染控制性、直觀結(jié)果讀取，與常規(guī)PCR方法作比較。結(jié)果 兩種閉管分析系統(tǒng)的LAMP技術(shù)的檢測限為3×100拷貝/μl，高于普通PCR技術(shù)的檢測限（3×101拷貝/μl），同時(shí)兩種閉管分析方法未出現(xiàn)污染情況，溴酚藍(lán)作為輔顯劑可使陰性樣本反應(yīng)后呈淡紫色，陽性樣本反應(yīng)后呈綠色，更易于直觀結(jié)果讀取。結(jié)論 隔離SYBR greenⅠ建立閉管LAMP反應(yīng)系統(tǒng)及提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍(lán)）的閉管LAMP反應(yīng)系統(tǒng)均具有防污染、低檢測限，且加入輔顯劑更易于檢測限附近的直觀結(jié)果觀察，適合在多種LAMP檢測試劑盒中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù);輔顯劑;病原體檢測;檢測限

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）02-01

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，自問世以來其以獨(dú)特的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)模式擺脫了常規(guī)PCR核酸擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)溫度循環(huán)儀器的要求，從而極大簡化了反應(yīng)的過程，同時(shí)也降低了檢測成本，且由于LAMP反應(yīng)中特殊的引物設(shè)計(jì)還進(jìn)一步增強(qiáng)了該反應(yīng)的敏感性和特異性，使得該技術(shù)非常適合作為病原微生物的現(xiàn)場快速診斷方法[1，2]。但也由于LAMP技術(shù)過高的靈敏度也帶來了更加嚴(yán)峻的反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題和極低濃度結(jié)果的直觀判斷。本研究以結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）核酸檢測為實(shí)例，擬建立以閉管分析及溴酚藍(lán)為輔顯劑的LAMP改進(jìn)技術(shù)，并探討其在病原體檢測中的檢測限。

1資料與方法

1.1材料和試劑

MTB Rv株DNA、MTB Rv株DNA LAMP檢測試劑盒均由解放軍結(jié)核病研究所提供，溴酚藍(lán)為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（AR）。

1.2方法

1.2.1MTB基因組DNA稀釋試驗(yàn)

取濃度為3×104拷貝/μl的結(jié)核桿菌Rv株DNA原液，按照10倍的梯度稀釋5次，最后取3×104、3×103、3×102、3×101 、3×100及3×10-1拷貝/μl濃度模板進(jìn)行后面的LAMP反應(yīng)。以純水作為陰性對(duì)照用液。

1.2.2隔離SYBR greenⅠ的LAMP閉管分析方法

LAMP反應(yīng)前將錫紙折疊成凹狀后塞入EP管內(nèi)上端，紙壁與管壁之間留有較小空間縫隙，在錫紙凹狀紙壁上滴2μl SYBR greenⅠ，由于染料無法滲透過錫紙，故反應(yīng)前利用錫紙與管壁的摩擦力克服錫紙本身與染料的重力，使得原本會(huì)抑制反應(yīng)的染料在反應(yīng)過程中停留在錫紙的凹狀紙壁內(nèi)無法進(jìn)入反應(yīng)液中，反應(yīng)后用離心機(jī)離心反應(yīng)管使染料從紙壁與管壁間的縫隙中落入反應(yīng)液，從而完成了不開蓋的檢測過程[3]。

1.2.3提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍(lán)）的LAMP閉管分析方法

LAMP反應(yīng)前提前加入鈣黃綠素染料及溴酚藍(lán)溶液2μl，然后再按LAMP反應(yīng)操作進(jìn)行。

1.2.4LAMP反應(yīng)及PCR反應(yīng)

LAMP反應(yīng)及PCR反應(yīng)均按MTB基因各自的檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作[4]。所用的MTB基因引物序列共計(jì)6條，見表1。LAMP反應(yīng)條件：水浴63℃，加熱45min?？瞻讓?duì)照模板為水。PCR反應(yīng)模板設(shè)置同LAMP一致，上下游引物分別為LAMP第一組引物中的F3，B3。反應(yīng)程序?yàn)?4℃1min（變性），60℃1min（退火），72℃90s（延伸），30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后LAMP結(jié)果和PCR結(jié)果根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳判定。

2結(jié)果

反應(yīng)結(jié)束后，分別觀察提前加入鈣黃綠素染料的反應(yīng)組和使用錫紙隔離SYBR greenⅠ組反應(yīng)后的顏色變化。通過肉眼觀察顏色判定結(jié)果，兩種閉管系統(tǒng)LAMP方法所能檢測到的模板拷貝數(shù)極限值為3×100拷貝/μl，而常規(guī)PCR方法檢測限為3×101拷貝/μl，兩種閉管體系LAMP檢測技術(shù)檢測限優(yōu)于常規(guī)PCR方法，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)均未出現(xiàn)假陽性的發(fā)生。

3討論

LAMP等各種分子生物學(xué)診斷技術(shù)之所以難以大范圍的推廣應(yīng)用，一方面是昂貴的診斷成本限制了其大范圍的普及[5，6]，另一方面不論是PCR還是LAMP，由于其極高的擴(kuò)增效率，反應(yīng)后一旦開蓋很容易造成環(huán)境中大量的氣溶膠污染，給后續(xù)的檢測帶來干擾，容易導(dǎo)致一部分假陽性結(jié)果[7]。本研究在保證特異性的同時(shí)為了降低反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物污染所帶來的假陽性，提高結(jié)果可信度，使用了兩種不開蓋檢測擴(kuò)增結(jié)果的方法，從而避免了反應(yīng)后開蓋檢測所導(dǎo)致的氣溶膠污染。其中提前加入染料的方法利用反應(yīng)前氯化錳和鈣黃綠素結(jié)合抑制了鈣黃綠素本身的綠色熒光，反應(yīng)后由于陽性樣本伴隨目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物：焦磷酸根離子，焦磷酸根離子剝奪了鈣黃綠素上的錳離子從而使得鈣黃綠素本身的熒光得以釋放[8]。在實(shí)際使用中我們發(fā)現(xiàn)原始配方的染料陰性與陽性樣本之間的區(qū)分有時(shí)并不很明顯，由于原染料對(duì)于陰性樣本反應(yīng)后顯淡橙黃色，陽性樣本反應(yīng)后顯淡綠色，在顏色光譜上這兩種顏色是緊挨在一起的兩個(gè)區(qū)域，故實(shí)際中會(huì)對(duì)弱陽性的結(jié)果判定造成一定程度的困擾。針對(duì)這種情況我們改進(jìn)了原染料的配方，在原始配方的基礎(chǔ)上加入了溴酚藍(lán)作為輔顯劑，加入輔顯劑后，陰性樣本反應(yīng)后呈淡紫色，陽性樣本反應(yīng)后呈綠色，從色輪圖上可見這兩種顏色間隔相對(duì)較遠(yuǎn)，肉眼分辨這兩種顏色相對(duì)較容易。而錫紙隔離SYBR greenⅠ組是由于染料中的主要配方鈣黃綠素配置成溶液后穩(wěn)定性較低，故我們自主設(shè)計(jì)了一種新型的不開蓋檢測方法，利用錫紙隔絕SYBR greenⅠ染料在反應(yīng)過程中同反應(yīng)液的接觸，反應(yīng)后通過離心使染料落入反應(yīng)液指示反應(yīng)結(jié)果，整個(gè)檢測過程均可在閉管體系內(nèi)完成，該方法簡單易行同時(shí)SYBR greenⅠ保存較鈣黃綠素染料容易，不需要每次試驗(yàn)前重新配置染料，使得該方法相對(duì)于鈣黃綠素染料法更加方便。我們的檢測發(fā)現(xiàn)，無任是提前加入鈣黃綠素染料的反應(yīng)組還是使用錫紙隔離SYBR greenⅠ組，其所能檢測到的模板拷貝數(shù)極限值為3×100拷貝/μl，而常規(guī)PCR方法檢測限為3×101拷貝/μl，兩種閉管體系LAMP檢測技術(shù)檢測限優(yōu)于常規(guī)PCR方法，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)均未出現(xiàn)假陽性的發(fā)生。且加入溴酚藍(lán)作為輔顯劑（雖然加入輔顯劑后對(duì)于擴(kuò)增效率會(huì)有一定程度的限制，延長了一部分反應(yīng)時(shí)間，但對(duì)于結(jié)果判定具有顯著優(yōu)勢(shì)）更易于直觀結(jié)果的讀取，適合在多種LAMP檢測試劑盒中推廣應(yīng)用[9]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Vesper S， McKinstry C， Hartmann C， et al. Quantifying fungal viability in air and water samples using quantitative PCR after treatment with propidium monoazide （PMA）[J]. Journal of Microbiological Methods， 2008，72（2）：180-184.

[2]孫艷杰.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌檢測效果的評(píng)估[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（39）：131，133.

[3]Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediaied isothermal Amplification of DNA[J]. Nucleic Acid Res， 2000，28（12）：63.

[4]Tomita N， Mori Y， Kanda H， et al. Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） of gene sequences and simple visual detection of products[J]. Nat. Protoc， 2008，3（5）：877-882.

[5]顧錦，郭會(huì)，周圍，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在下呼吸道感染常見病原體檢測中的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2021，39（1）：12-16.

[6]顧淵，岑銘松，馬海杰，等.柑橘潰瘍病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測技術(shù)研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（1）：113-118.

[7]Aryan E， Makvandi M， Farajzadeh A， et al. A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complex[J]. Microbiol Res， 2010，165（3）：211-220.

[8]Verettas D，Kazakos C，Tilkeridis C. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis in synovial fluid tissue samples，bone marrow aspirate and peripheral blood[J].Acta Orthop Belg， 2003，69（5）：396-399.

[9]劉亞東，冷雪，時(shí)坤，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2018，34（5）：460-465.