張 巍,涂曉娟, 楊祎娜, 舒 心

銀屑病是一種由免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性的常見(jiàn)皮膚炎性反應(yīng)性疾病，尋常型銀屑病是最常見(jiàn)的類(lèi)型。銀屑病常罹患終身，皮損為局限或廣泛分布的鱗屑性紅斑及斑塊，發(fā)作期伴有劇烈的瘙癢、灼熱等癥狀，藥物治療不能完全緩解，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和精神狀況。銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)來(lái)源于花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，是一種重要的炎性反應(yīng)介質(zhì)，BLT1和BLT2是目前已被鑒定的兩種LTB4受體。多項(xiàng)研究表明，LTB4參與了銀屑病的炎性反應(yīng)和增殖過(guò)程。LTB4的炎性反應(yīng)作用必須通過(guò)與特異性受體結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。本研究旨在通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BLT1和BLT2在尋常型銀屑病皮損表皮中的表達(dá)強(qiáng)度，探討白三烯B4受體(BLT1和BLT2)在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)情況，為尋找臨床治療新靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2014-11-01至2018-10-31在我院皮膚科行常規(guī)組織病理檢查，并保存完整的尋常型銀屑病石蠟組織標(biāo)本30例為銀屑病組。選取30例在整形外科行手術(shù)切除患者的正常皮膚為對(duì)照組。所有患者均于術(shù)前1個(gè)月無(wú)全身性用藥史，術(shù)前2周取材部位皮膚無(wú)局部用藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期、哺乳期；(2)嚴(yán)重感染性疾病、紅斑狼瘡等自身免疫性疾??；(3)惡性腫瘤、肝腎疾病及其他嚴(yán)重疾病者。銀屑病組男18例，女12例，平均(40.85±6.48)歲，病程6個(gè)月～18年。對(duì)照組男20例，女10例，平均(38.75±9.46)歲。兩組患者性別和年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 主要試劑 兔抗人白三烯B4受體(BLT1和BLT2)多克隆抗體均為上海雅吉生物科技有限公司產(chǎn)品，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均為北京中杉生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 石蠟組織標(biāo)本 兩組皮膚組織均采用10%的甲醛溶液固定，后經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋等處理制作成石蠟組織標(biāo)本，編號(hào)備用。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素-生物素過(guò)氧化物酶(S-P)三步法檢測(cè)BLT1和BLT2的表達(dá)。操作過(guò)程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟組織標(biāo)本經(jīng)修整后用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5 μm，置于溫水中展開(kāi)，采用聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片撈片，置于65 ℃干燥箱中烤片2 h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01 M枸椽酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓鍋修復(fù)，3%HO孵育,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清進(jìn)行封閉，滴加兔抗人BLT1、BLT2多克隆抗體，濃度為1∶200，4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加二抗(生物素化山羊抗兔抗體工作液)，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。BLT1和BLT2表達(dá)陽(yáng)性表現(xiàn)為光鏡下胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒。陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照為白三烯B4受體表達(dá)陽(yáng)性的胰腺癌石蠟切片。

1.3.3 免疫組化BLT1和BLT2的光密度值分析 高倍顯微鏡下BLT1和BLT2表達(dá)陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒。采用Image-Pro Plus6.0軟件系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行半定量分析。按照隨機(jī)抽樣原則，在光學(xué)顯微鏡200倍視野下每張切分別攝取5個(gè)視野，測(cè)量每個(gè)視野陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度(AIOD)值，測(cè)量范圍是皮膚表皮基底層與角質(zhì)層之間的區(qū)域，并求其平均值。以平均光密度值反映BLT1和BLT2的表達(dá)強(qiáng)度，平均光密度值越高，表達(dá)強(qiáng)度越大，反之亦然。全部圖片的采集及分析均由同一名操作人員完成。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 BLT1和BLT2在銀屑病組和對(duì)照組皮膚組織中均有不同程度的表達(dá)，陽(yáng)性著色部位主要是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿，呈淡黃色至黃褐色顆粒，胞核未見(jiàn)明顯表達(dá)。(1)皮膚組織中BLT1的免疫組化染色結(jié)果：銀屑病組皮損組織表皮中，BLT1主要表達(dá)于棘層下部(圖1A)。對(duì)照組皮膚組織中，BLT1主要表達(dá)于基底層(圖1B)。(2)皮膚組織中BLT2的免疫組化染色結(jié)果：在銀屑病組皮損組織表皮中，BLT2在棘層中呈高表達(dá)，在基底層無(wú)表達(dá)或極少表達(dá)(圖1C)。對(duì)照組皮膚組織中，BLT2主要表達(dá)于基底層(圖1D)。

圖1 BLT1和BLT2在銀屑病皮損和正常皮膚表皮中的表達(dá)(SP，×400)A. BLT1在銀屑病皮損表皮棘層下部呈高表達(dá)；B.BLT1在正常人皮膚表皮基底層中表達(dá)為陽(yáng)性；C.BLT2在銀屑病皮損表皮棘層中呈高表達(dá)；D.BLT2在正常人皮膚表皮基底層中表達(dá)為陽(yáng)性

2.2 BLT1和BLT2表達(dá)強(qiáng)度比較 根據(jù)皮膚表皮組織中表達(dá)強(qiáng)度的平均光密度值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組平均光密度(128.29±6.16)相比，BLT1在銀屑病組平均光密度(144.82±17.75)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=2.838，=0.008)；BLT2在銀屑病組皮損中平均光密度(141.75±16.72)，明顯高于對(duì)照組(127.54±5.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=2.604，=0.002)。

3 討 論

銀屑病是一種增殖過(guò)度性疾病，而這種增殖是由一系列復(fù)雜的炎性反應(yīng)介質(zhì)驅(qū)動(dòng)的，主要與中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的Th17免疫有關(guān)。表皮增生、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管擴(kuò)張是銀屑病的特征性組織學(xué)特征。中性粒細(xì)胞通常在角化不全病灶的正上方，中性粒細(xì)胞微膿腫通常在角質(zhì)層的多個(gè)層次出現(xiàn)，通常位于角化不良小病灶的頂部，角化不全與中性粒細(xì)胞交替出現(xiàn)呈現(xiàn)“三明治征”。

LTB4是花生四烯酸在白細(xì)胞中經(jīng)5-脂氧化酶代謝的活性產(chǎn)物之一，是重要的炎性反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)白細(xì)胞(尤其是中性粒細(xì)胞)有強(qiáng)烈的趨化作用，可以使白細(xì)胞向炎性反應(yīng)聚集，還可激活白細(xì)胞產(chǎn)生超氧產(chǎn)物，釋放炎性反應(yīng)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，LTB4可導(dǎo)致銀屑病早期皮損中大量中性粒細(xì)胞侵入表皮形成典型的微膿腫；LTB4還可抑制表皮細(xì)胞cAMP的生成，可能參與了銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖；銀屑病患者的皮損處LTB4濃度與銀屑病皮損面積與嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)評(píng)分有顯著相關(guān)性。這些研究均表明，LTB4在銀屑病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。因此，減少LTB4的生成、加快LTB4的清除、阻斷LTB4與其受體結(jié)合或可成為銀屑病治療的新靶點(diǎn)。

BLT1是LTB4特異性的高親和性受體，除粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，還在1型輔助性T細(xì)胞(Th1)、2型輔助T細(xì)胞(Th2)、17型輔助T細(xì)胞(Th17)、效應(yīng)CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)和破骨細(xì)胞中表達(dá)。在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型中，中性粒細(xì)胞中的LTB4-BLT1信號(hào)通過(guò)與CXCL1/2趨化因子受體CXCR2協(xié)同作用，顯著加速了中性粒細(xì)胞在皮膚中的浸潤(rùn)，并促進(jìn)了銀屑病皮炎的發(fā)展。除了對(duì)中性粒細(xì)胞的影響外，LTB4還通過(guò)BLT1作用于皮膚樹(shù)突狀細(xì)胞和γδT細(xì)胞，促進(jìn)其遷移和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這也促進(jìn)了銀屑病皮炎的進(jìn)展。BLT2是一種低親和性受體，但表達(dá)更為廣泛，這些受體通過(guò)介導(dǎo)LTB4的活性，參與宿主免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)疾病的發(fā)病機(jī)制。馬聰?shù)韧ㄟ^(guò)外源性L(fǎng)TB4刺激小鼠體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs，證明BLT2通路是LTB4介導(dǎo)的DCs趨化的關(guān)鍵通路，參與LTB4介導(dǎo)的 DCs TNF-α和IL-lβ的釋放。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了BLT在銀屑病患者皮損處及正常人皮膚表皮組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLT1和BLT2在銀屑病患者和正常對(duì)照皮膚表皮中均可見(jiàn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿，呈淡黃色至黃褐色顆粒，但BLT1和BLT2在表皮中的分布與正常皮膚不同，表達(dá)強(qiáng)度較正常對(duì)照皮膚明顯上調(diào)。這與文獻(xiàn)[15，16]的研究結(jié)果相似。在本實(shí)驗(yàn)中，BLT1、BLT2在正常皮膚組織表皮中主要表達(dá)于基底層，提示二者在健康機(jī)體中參與重要的生理活動(dòng)，維持正常的細(xì)胞周期。在尋常型銀屑病皮損組織表皮中BLT1和BLT2在棘層呈高表達(dá)，由此推測(cè)BLT1和BLT2可能參與了角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和分化、炎性反應(yīng)細(xì)胞的趨化聚集。其中，BLT1主要表達(dá)于棘層下1/3，推測(cè)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖及異常凋亡可能存在于棘層下部。由此本研究從病理學(xué)角度解釋了銀屑病皮損棘層全層角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖及分化，但BLT1和BLT2在銀屑病棘層的表達(dá)分布模式值得進(jìn)一步研究分析。

綜上所述，LTB4在尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，在銀屑病皮損組織表皮中LTB4濃度升高，且皮損棘層中BLT1和BLT2高表達(dá)。LTB4通過(guò)其受體(BLT1和BLT2)發(fā)揮作用，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)細(xì)胞在皮損處聚集浸潤(rùn)，參與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化，從而導(dǎo)致尋常型銀屑病皮損的產(chǎn)生。使用LTB4拮抗劑有望通過(guò)阻斷LTB4與受體結(jié)合從而減輕銀屑病炎性反應(yīng)和表皮的過(guò)度增殖，這一治療方法有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。