施思，喬宗偉, 2*，鄭佳, 2，羅青春，廖勤儉，劉多濤

1(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007)2(中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644007)

雜醇油主要是指3個(gè)碳以上一元醇物質(zhì)的總稱，是白酒中的芳香成分，但同時(shí)它還是白酒苦味或澀味的主要來(lái)源之一，當(dāng)雜醇油含量過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致低度白酒渾濁，影響白酒質(zhì)量，飲酒后會(huì)產(chǎn)生上頭，不適等癥狀。其中，異戊醇和異丁醇對(duì)人體影響最大。因此，控制雜醇油含量是改善基酒口感的必要措施。目前，許多學(xué)者的研究工作表明，雜醇油的生成與微生物代謝和生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，并在降低雜醇油生成方面做了許多探索。在基礎(chǔ)研究方面，通過(guò)基因工程[1-5]、誘變育種[6-9]等技術(shù)選育低產(chǎn)雜醇油菌株，進(jìn)一步解析了雜醇油生成的有關(guān)機(jī)理；但由于其在遺傳穩(wěn)定性方面存在缺陷，且對(duì)生產(chǎn)環(huán)境中其他微生物生長(zhǎng)代謝的作用情況不明。因此，人工選育出的低產(chǎn)雜醇油菌株在實(shí)際應(yīng)用方面的可行性當(dāng)前來(lái)看并不大。在應(yīng)用研究方面，蒸餾裝備的改良和蒸餾條件的優(yōu)化可有效地降低雜醇油的含量，但有可能造成其他香味成分的損失，且重新改良和打造適宜的蒸餾裝置會(huì)投入大量成本，難以大規(guī)模推廣使用[10-12]。

固態(tài)發(fā)酵白酒有多種香型之分，但無(wú)論濃香、醬香還是清香，都是采用開(kāi)放式、多微共生共酵的生產(chǎn)方式，白酒的釀造品質(zhì)和風(fēng)格與產(chǎn)區(qū)大氣候及其所造就的微生物圈密切相關(guān)。生產(chǎn)上常通過(guò)上一輪糟醅生酸和產(chǎn)酒的情況，結(jié)合當(dāng)天的氣溫調(diào)整下一輪的糟醅結(jié)構(gòu)，因此降低雜醇油的含量需要從產(chǎn)區(qū)和生產(chǎn)操作的實(shí)際情況出發(fā)，建立一套實(shí)用合理，且易推廣應(yīng)用的發(fā)酵工藝。這項(xiàng)工作需要對(duì)固態(tài)白酒中相關(guān)雜醇油的含量與分布規(guī)律進(jìn)行摸索，并與生產(chǎn)中工藝控制的常規(guī)要素進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，最終通過(guò)糟醅中酸、溫、氣、水、構(gòu)的協(xié)調(diào)匹配，達(dá)到合理調(diào)控雜醇油生成的目的。

本試驗(yàn)自制磚窖作為固態(tài)白酒發(fā)酵設(shè)備，在2年時(shí)間中跟蹤檢測(cè)了共計(jì)30輪次的糟醅發(fā)酵數(shù)據(jù)，探討了異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇的生成規(guī)律，為特定產(chǎn)區(qū)雜醇油生產(chǎn)調(diào)控提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域氣候概況

宜賓地處“中國(guó)白酒金三角”核心區(qū)，位于四川盆地南緣，四川、云南、貴州3省交界處。它是長(zhǎng)江上游重要的生態(tài)屏障，屬于亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，適宜微生物生存，形成獨(dú)特的釀酒環(huán)境。宜賓市年平均降雨量達(dá)1 200 mm，氣候溫和，年平均氣溫17.6 ℃，年平均日照1 018.2 h。晝夜溫差小，濕度大，非常有利于釀造原料的生長(zhǎng)。它是同緯度地區(qū)農(nóng)作物生長(zhǎng)的最佳氣候區(qū)之一。在海撥高度、地理位置和大氣環(huán)流的共同作用下，宜賓市既有四川盆地中亞熱帶濕潤(rùn)氣候的特色，又有山地垂直氣候變化的規(guī)律，具有從南亞熱帶到溫暖帶的立體氣候特征[13]。氣候是決定一個(gè)地區(qū)熱量和水量的基本條件。宜賓五糧液產(chǎn)地常年溫差和晝夜溫差小、濕度大、日照時(shí)間短，形成冬暖夏熱的特殊氣候[14]。

1.2 材料與試劑

釀酒原料：高粱、小麥、大米、糯米、玉米，國(guó)產(chǎn)市售；酚酞、NaOH，均為國(guó)產(chǎn)分析純；異戊醇、正丁醇、異丁醇、正丙醇，均為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

7890氣相色譜儀[配備火焰離子檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)檢測(cè)器]，美國(guó)安捷倫公司；磚窖：長(zhǎng)×寬×高約為2.5 m×1.8 m×1.2 m。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵方法

試驗(yàn)采用續(xù)糟發(fā)酵，每輪發(fā)酵結(jié)束后添加一定比例的曲粉，混勻后重新入窖。糟醅發(fā)酵體系分為上、中、下3層，每層糟醅約為1 200 kg，發(fā)酵周期為40 d。入窖前，檢測(cè)每層糟醅酸度及入窖溫度；發(fā)酵結(jié)束后，分層起糟，檢測(cè)每層出窖糟酸度。試驗(yàn)發(fā)酵共計(jì)30輪次。

1.4.2 糟醅酸度的檢測(cè)方法

取糟醅試樣20.0 g于250 mL燒杯中，加入200 mL純凈水?dāng)嚢杈鶆?，于室溫下浸?0 min，前15 min勤攪拌，后15 min靜置。吸取20.0 mL上清液于250 mL三角瓶中，環(huán)瓶壁加入20 mL純凈水。加入酚酞指示劑2滴，以0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色為其終點(diǎn)。酸度表示為10 g糟醅消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾數(shù)。

1.4.3 異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇含量分析

發(fā)酵結(jié)束后，用甑子蒸餾，每一甑裝載量對(duì)應(yīng)一層糟醅量，每甑糟醅蒸餾完畢后取樣分析，用氣相色譜檢測(cè)雜醇油含量。氣相色譜檢測(cè)條件為，色譜柱：Agilent19095N-123毛細(xì)管柱(0.530 mm×30 m，1 μm)；色譜柱溫度：初始溫度35 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升到180 ℃，保持1 min；載氣N2；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；進(jìn)樣量10 μL；分流比20∶1[15]。

1.4.4 基酒產(chǎn)量分析

試驗(yàn)采用實(shí)際的基酒產(chǎn)量反映糟醅中的乙醇發(fā)酵程度，每甑裝載量為一層糟量，每甑糟醅蒸餾完畢后收集基酒稱重。產(chǎn)量越高，則乙醇發(fā)酵越充分。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 9進(jìn)行單因素方差分析，多變量相關(guān)性分析及主成分分析(principal component analysis，PCA)。在執(zhí)行PCA過(guò)程中，由于變量單位不統(tǒng)一，選擇標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(standardized data)，并通過(guò)并行分析(parallel analysis)來(lái)選擇成分?jǐn)?shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 入窖溫度

環(huán)境是微生物生長(zhǎng)代謝的重要因素，而環(huán)境溫度是生產(chǎn)工藝控制的關(guān)鍵。其中，入窖溫度在所有調(diào)控因素中起支配作用，其他要素均需要根據(jù)入窖溫度的變化而變化。入窖溫度和氣候變化密切相關(guān)，主要由地溫決定，正是因?yàn)槿虢褱囟鹊囊蛩?，傳統(tǒng)固態(tài)釀造生產(chǎn)有了冷季和熱季之分[16]。秉持釀酒生態(tài)與自然生態(tài)相契合的原則，遵循客觀氣候條件，試驗(yàn)采用自然鼓風(fēng)和攤晾調(diào)節(jié)入窖糟溫度(圖1)。其中，15～22 ℃有18批次，23～29 ℃有12批次。試驗(yàn)經(jīng)歷了從冷季到熱季的自然轉(zhuǎn)換。

圖1 不同糟層入窖溫度Fig.1 The temperature of different Zaopei layers before fermentation

2.2 糟醅酸度變化

酸度變化顯示了每一批次、不同糟層的生酸情況。酸度在生產(chǎn)工藝上是一個(gè)重要指標(biāo)，入窖酸一般采用加糧，加水等操作進(jìn)行調(diào)控。酸度的變化體現(xiàn)了糟醅發(fā)酵體系中微生物的演替過(guò)程，一般情況下，糟醅生酸多，會(huì)形成酸多酒少的結(jié)果；糟醅生酸少時(shí)，有利于酵母發(fā)酵產(chǎn)酒，有利于下一輪的發(fā)酵。如圖2所示，本試驗(yàn)發(fā)酵周期為40 d，生酸幅度主要集中在0.5～1.5。通過(guò)方差分析顯示，不同糟層之間酸度變化無(wú)差異(P=0.168 5)，而不同批次之間酸度變化極為顯著(P<0.001)。

2.3 不同糟層乙醇發(fā)酵分析

為緊貼實(shí)際生產(chǎn)操作要素，本試驗(yàn)使用基酒產(chǎn)量反映實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中乙醇的發(fā)酵情況，乙醇發(fā)酵越好，產(chǎn)酒越多。每甑裝載量為一層糟量，蒸餾完畢后，收集的基酒可完全反映每層糟醅的乙醇發(fā)酵情況。如圖3所示，試驗(yàn)發(fā)酵周期為40 d，基酒產(chǎn)量范圍主要集中在20～40 kg/甑。

圖2 不同糟層的酸度變化Fig.2 The acidity change of different Zaopei layers

圖3 不同糟層基酒產(chǎn)量Fig.3 The liquor yield of different Zaopei layers

2.4 不同糟層中4種雜醇油的分布

發(fā)酵結(jié)束后，用甑子蒸餾，每一甑裝載量對(duì)應(yīng)一層糟醅量，每甑基酒收集完畢后，取樣分析，分析結(jié)果可完全反映每一層糟醅中雜醇油的生成情況。表1顯示了異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇在不同糟層中的含量和分布情況。從總體生成量來(lái)講，正丙醇>正丁醇>異戊醇>異丁醇；方差分析結(jié)果表明，異戊醇、正丙醇和正丁醇在空間分布上具有顯著差異，其中正丙醇和正丁醇分布規(guī)律較為一致，兩者在下層糟醅中含量顯著提高，分別為210.4 mg/100mL和114.2 mg/100mL，而異戊醇的分布規(guī)律則為從上至下，逐漸升高；異丁醇在4種雜醇油中，生成量最少，且在空間分布上無(wú)顯著差異。

表1 異戊醇、異丁醇、正丙醇、正丁醇在不同空間層面的分布 單位：mg/100mL

2.5 不同糟層中4種雜醇油和工藝要素的相關(guān)性分析

對(duì)不同糟層中4種雜醇油的生成情況同生酸、產(chǎn)酒和入窖溫度進(jìn)行相關(guān)性分析，各變量的相關(guān)系數(shù)如表2所示，上層糟醅中異戊醇含量與酸度，入窖溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與基酒產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；下層糟醅中正丁醇含量與基酒產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與酸度和入窖溫度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)等。相關(guān)性系數(shù)中，|r|>0.3，P<0.05的數(shù)據(jù)有26個(gè)，占整體相關(guān)系數(shù)的72.2%。結(jié)果表明各變量之間相關(guān)性較強(qiáng)，可通過(guò)PCA對(duì)各變量之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步解析[17]。

表2 異戊醇、正丙醇、正丁醇和異丁醇與酸度變化、 基酒產(chǎn)量和入窖溫度的相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis of isoamyl alcohol, n-propanol, n-butanol and isobutanol with acidity change, liquor yield and temperature

2.6 雜醇油和工藝要素的PCA

表3顯示，經(jīng)PCA共提取了5個(gè)主成分，其中主成分1貢獻(xiàn)率最大，占比41.80%，表明主成分1對(duì)發(fā)酵體系中各變量的影響最大。前3個(gè)主成分特征值均>1，累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.93%，基本可以反映各變量相互影響的大部分信息。故選取前3個(gè)主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。

表3 主成分的特征值與貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and their contribution of principal components

前3個(gè)主成分的特征向量與載荷矩陣如表4所示。載荷值反映了各變量與主成分間的相關(guān)系數(shù)，載荷值的絕對(duì)值越大，表明該變量對(duì)主成分影響越大，正號(hào)表示為正向影響，而負(fù)號(hào)表示為負(fù)向影響[18-19]。表4的分析結(jié)果顯示，雜醇油成分中，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)度最大的是異戊醇和異丁醇，其次為正丁醇和正丙醇；其中，異戊醇和異丁醇對(duì)主成分1的影響為正相關(guān)，正丙醇和正丁醇對(duì)主成分1的影響呈負(fù)相關(guān)。在生產(chǎn)工藝控制要素方面，酸度變化和入窖溫度與主成分1呈負(fù)相關(guān)，且入窖溫度的絕對(duì)影響值更高。

表4 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and loading matrix of principal components

在圖4中，箭頭的長(zhǎng)度反映了變量信息丟失程度，箭頭的程度越長(zhǎng)，則變量信息在分析過(guò)程中丟失越少[20]。不同變量間距離越長(zhǎng)表明差異越大，距離越短則說(shuō)明相關(guān)性越高[21]。由圖4可知，7個(gè)變量分布在了3個(gè)不同的象限。酸度變化和入窖溫度分布在第2象限，正丙醇和正丁醇分布在第3象限，而基酒產(chǎn)量和異戊醇和異丁醇分布在第4象限?；飘a(chǎn)量在一定程度上可反映糟醅中乙醇發(fā)酵的強(qiáng)度，和異戊醇，異丁醇的特征向量為正，處在主成分1的正向分布上；酸度變化反映糟醅中的產(chǎn)酸代謝，它與入窖溫度密切相關(guān)，兩者和正丙醇，正丁醇的特征向量為負(fù)，分別排列在主成分1的負(fù)軸方向。由于主成分1對(duì)變異分析的貢獻(xiàn)度最大，因此可以推測(cè)出正丙醇，正丁醇主要與酸調(diào)控相關(guān)；異戊醇和異丁醇的生成主要與乙醇發(fā)酵有關(guān)。且兩組雜醇油的調(diào)控策略相反：即溫度偏高時(shí)，生酸較多，影響乙醇發(fā)酵，基酒產(chǎn)量減少，可能會(huì)降低異戊醇和異丁醇的生成，但正丙醇和正丁醇含量增加；當(dāng)溫度偏低時(shí)，生酸緩，酸度低，會(huì)促進(jìn)乙醇發(fā)酵，增加基酒產(chǎn)量，正丙醇和正丁醇生成量減少，但異戊醇和異丁醇含量可能會(huì)偏高。因此，在生產(chǎn)上掌握調(diào)控的平衡是至關(guān)重要的。

圖4 載荷圖Fig.4 Loading diagram

3 結(jié)論

本研究在2年時(shí)里跟蹤了30輪次固態(tài)發(fā)酵糟醅中異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇的生成規(guī)律，生成量最多是正丙醇，其次為正丁醇、異戊醇和異丁醇；正丙醇(P<0.001)、正丁醇(P<0.01)和異戊醇(P<0.01)在不同糟層中的分布具有顯著差異，分布規(guī)律為下層>中層>上層；異丁醇在不同糟層中的分布無(wú)顯著差異(P>0.05)。4種雜醇油與入窖溫度、酸度變化和基酒產(chǎn)量的相關(guān)性及主成分分析結(jié)果表明，溫度和生酸與正丙醇和正丁醇的生成呈正向影響，與異戊醇和異丁醇的生成呈負(fù)向影響；基酒產(chǎn)量在一定程度上反映了乙醇的發(fā)酵強(qiáng)弱，它與異戊醇、異丁醇的生成呈正向影響；在工藝要素方面，酸度變化與入窖溫度呈正相關(guān)，兩者與基酒產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。主成分分析是一種強(qiáng)大的探索性模型，在多個(gè)變量同時(shí)存在的情況下，降低數(shù)據(jù)維度，進(jìn)行主要特征提取，是一種可靠的數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法。通過(guò)主成分分析，初步弄清了4種雜醇油與溫度、生酸、產(chǎn)酒之間的關(guān)系，且控酸、控溫等參數(shù)易在生產(chǎn)操作中進(jìn)行調(diào)控，為建立實(shí)用易推廣的雜醇油調(diào)控工藝奠定了基礎(chǔ)。