馬嘯辰 綜述 劉紅玲 審校

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科醫(yī)院，哈爾濱 150001

基因編輯是近年來眼科實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。眼球解剖結(jié)構(gòu)獨(dú)特，角膜透明，借助裂隙燈顯微鏡、光相干斷層掃描等儀器，方便對眼部疾病進(jìn)行觀察[1]；另外，眼部缺乏淋巴管結(jié)構(gòu)，眼球處于相對免疫赦免狀態(tài)，對新抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)較弱，更適合外源性基因編輯治療[2]。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由前核糖體RNA、Cas9和反式激活CRISPR RNA(crRNA)組成，其中，Cas9經(jīng)crRNA引導(dǎo)后與互補(bǔ)DNA靶序列結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂，理論上可以在任何基因位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)DNA切割[3]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅在目的基因設(shè)計(jì)合成篩選上更為簡便快捷，而且可以在單個細(xì)胞內(nèi)同時靶向編輯多個基因位點(diǎn)，成倍地提高了基因編輯的效率，但Cas蛋白的不穩(wěn)定性和脫靶效應(yīng)在一定程度上限制了其應(yīng)用[4]?；蚓庉媱游飳儆谠l(fā)性疾病模型，其表型持續(xù)時間長，并可穩(wěn)定遺傳。對于已明確致病基因的疾病，構(gòu)建基因編輯動物模型可真實(shí)地模擬疾病發(fā)生和演變過程。應(yīng)用胚胎細(xì)胞克隆技術(shù)，還可批量制備基因型一致的動物模型，減少個體差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[5]。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在構(gòu)建眼科疾病動物模型中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 角膜疾病

Schnyder角膜營養(yǎng)不良是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，病因可能為染色體1P36位點(diǎn)的UBIA異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(UbiA prenyltransferase domain containing 1，UBIAD1)基因突變，角膜出現(xiàn)漸進(jìn)性混濁，膽固醇和磷脂沉積，最終導(dǎo)致視力下降[6]。Dong等[7]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Ubiad1(N100S)點(diǎn)突變小鼠模型，小鼠角膜可見點(diǎn)狀沉積物；角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，甘油磷脂代謝發(fā)生障礙。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因突變可導(dǎo)致角膜營養(yǎng)不良，其中TGF-β(R124C)突變與格子狀角膜營養(yǎng)不良密切相關(guān)[8]。Kitamoto等[9]采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建TGF-β(R124C)基因突變小鼠，40周齡時，約80%純合TGF-β(R124C)基因突變小鼠和9.1%雜合小鼠出現(xiàn)角膜混濁，角膜基質(zhì)層內(nèi)有嗜酸性沉積，角膜出現(xiàn)大量TGF-β突變蛋白。以上研究有助于加深對角膜病發(fā)病機(jī)制的理解。

2 青光眼

Myocilin(MYOC)基因與青光眼密切相關(guān)[10]。Lynch等[11]采用CRISPR基因編輯技術(shù)構(gòu)建Myoc基因突變大鼠模型，大鼠小梁網(wǎng)組織中可檢測到MYOC突變蛋白表達(dá)，但大鼠眼壓并未升高。Optineurin(OPTN) E50K基因突變可導(dǎo)致正常眼壓性青光眼，其特點(diǎn)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)進(jìn)行性變性，最終可致盲[12]。Liu等[13]和Hou等[14]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OptnE50K突變青光眼小鼠模型，蛋白組學(xué)分析顯示自噬和線粒體功能相關(guān)的通路發(fā)生障礙；16月齡時，小鼠RGC軸突運(yùn)輸減慢；3月齡小鼠RGC軸突線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常，且隨年齡增長而加重；小鼠成年后出現(xiàn)視力損害和視網(wǎng)膜變性特征，但眼壓正常。色素性青光眼以虹膜釋放的色素沉積在前房為特點(diǎn)。黑素小體特異性蛋白(premelanosome protein，PMEL)參與黑色素合成、儲存和運(yùn)輸，PMEL基因突變可導(dǎo)致色素性青光眼的發(fā)生[15]。Lahola-Chomiak等[15]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建pmel基因突變斑馬魚模型，斑馬魚眼部出現(xiàn)大量色素沉積。以上研究進(jìn)一步擴(kuò)充并驗(yàn)證了青光眼的致病基因數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)治療研究提供了動物模型保障。

3 白內(nèi)障

GJA8基因編碼晶狀體縫隙連接蛋白，該基因突變可引起先天性白內(nèi)障[16]。Yuan等[17]將Cas9/sgRNA mRNA注射到兔受精卵中構(gòu)建Gja8基因突變白內(nèi)障家兔模型，結(jié)果表明約78.9%Gja8基因突變家兔具有小眼球和晶狀體混濁表型。Mei等[18]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建pikfyve基因突變斑馬魚模型，斑馬魚晶狀體中出現(xiàn)大量液泡樣改變，晚期內(nèi)體與該液泡共定位，晶狀體纖維細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則。Karyopherin alpha 4(KPNA4)參與經(jīng)典核轉(zhuǎn)運(yùn)過程，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]。Ping等[19]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建kpna4基因突變斑馬魚模型，在胚胎期可觀察到晶狀體混濁，晶狀體上皮細(xì)胞層變薄，形態(tài)不規(guī)則。水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)是膜水通道的重要組成成分[20]。Tang等[21]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Aqp5突變小鼠模型，6月齡時晶狀體出現(xiàn)輕度混濁，9月齡時發(fā)生嚴(yán)重混濁。白內(nèi)障的發(fā)病基因具有多樣性，但針對特定基因位點(diǎn)構(gòu)建基因編輯動物模型有助于篩選特定的發(fā)病基因，為后續(xù)的白內(nèi)障基因回補(bǔ)治療奠定基礎(chǔ)。

4 眼底疾病

4.1 Leber先天性黑矇

KCNJ13基因表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞頂側(cè)，其突變可導(dǎo)致Leber先天性黑矇[22]。Zhong等[23]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Kcnj13突變小鼠，17周齡小鼠感光細(xì)胞幾乎消失，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。1%～2%的Leber先天性黑矇是由編碼纖毛蛋白的LCA5基因突變引起的[24]。Qu等[25]采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚lca5基因，視網(wǎng)膜電圖(electroretinography,ERG)檢查示斑馬魚視覺異常；視桿和視錐細(xì)胞光感受器進(jìn)行性變性，外節(jié)膜盤排列紊亂。

4.2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤

RB1等位基因失活可導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)發(fā)生。Naert等[26]采用CRISPR/Cas9技術(shù)改造非洲爪蟾RB基因，RB1或RBL1單一基因突變的非洲爪蟾并未出現(xiàn)RB，而RB1/RBL1等位基因突變蝌蚪迅速發(fā)展為RB表型；視網(wǎng)膜內(nèi)出現(xiàn)大量嗜堿性腫塊。

4.3 視網(wǎng)膜色素變性

Hexokinase Domain-Containing Protein 1(HKDC1)表達(dá)于視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)[27]。Zhang等[28]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Hkdc1敲除小鼠模型，小鼠出現(xiàn)暗視ERG反應(yīng)降低、外核層變薄、視紫紅質(zhì)蛋白異常定位和光感受器細(xì)胞凋亡增多等視網(wǎng)膜色素變性(retininitis pigmentosa,RP)病理特征。Chromosome 8 Open Reading Frame 37(C8ORF37)是常染色體隱性遺傳RP的致病基因[29]。Sharif等[29]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建C8orf37基因突變小鼠模型，小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性視桿和視錐細(xì)胞退化，光感受器外節(jié)段膜盤大量解體。Parain等[30]采用CRISPR/Cas9技術(shù)對視紫紅質(zhì)基因進(jìn)行改造，建立非洲爪蟾和熱帶爪蟾RP模型，爪蟾表現(xiàn)為視錐細(xì)胞形態(tài)異常并伴光感受器外節(jié)段萎縮和壞死。Domènech等[31]采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除小鼠神經(jīng)酰胺激酶樣(ceramide kinase-like,CERKL)基因，小鼠視錐細(xì)胞數(shù)量減少、光感受器外節(jié)段形態(tài)異常和RPE細(xì)胞吞噬功能下降。進(jìn)行性桿錐變性(progressive rodecone degeneration,PRCD)蛋白定位于光感受器外節(jié)段膜盤內(nèi)[32]。Sechrest等[32]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Prcd突變小鼠，小鼠光感受器外節(jié)段膜盤迂曲變形，視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)表達(dá)水平顯著下降。Zhou等[33]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建異天冬酰胺肽酶1(asparaginase like 1,Asrgl1)基因突變小鼠模型，9個月時小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度開始減少；光感受器內(nèi)、外節(jié)段變薄，視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞進(jìn)行性變性。Koster等[34]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin retinol acyltransferase,LRAT)基因突變大鼠模型，大鼠視網(wǎng)膜整體厚度變薄，ERG振蕩電位降低。Yeo等[35]采用CRISPR技術(shù)構(gòu)建Pde6b突變大鼠模型，3周時大鼠眼底可見色素沉著，視網(wǎng)膜光感受器出現(xiàn)變性，視網(wǎng)膜外核層厚度變薄。以上研究通過基因編輯技術(shù)模擬RP的發(fā)病過程，為RP治療靶點(diǎn)的選擇提供了依據(jù)。

5 眼部發(fā)育障礙

膜卷曲相關(guān)蛋白(membrane frizzled-related protein，MFRP)基因突變可導(dǎo)致眼球萎縮、上瞼下垂、RPE細(xì)胞缺失和視盤玻璃疣等[36]。Collery等[36]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚Mfrp基因中構(gòu)建多個移碼突變，斑馬魚視敏度降低、眼軸縮短和視網(wǎng)膜下巨噬細(xì)胞聚積。眼前段發(fā)育不全(anterior segment dysgenesis，ASD)常表現(xiàn)為角膜混濁、角膜Schwalbe線向前移位、虹膜發(fā)育不全、虹膜粘連和白內(nèi)障[37]。Bonet-Fernndez等[38]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建cpamd8基因突變斑馬魚模型，該突變體斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重ASD體征，其眼部病變包括虹膜角膜發(fā)育不全、眼球萎縮、前房淺和角膜基質(zhì)膠原排列紊亂。哺乳動物Pax6基因定位于無眼基因座，其突變常導(dǎo)致眼部發(fā)育異常。Nakanishi等[39]采用CRISPR/Cas9技術(shù)改造水蚤的Pax6基因，部分存活幼體眼球形態(tài)異常，約8.2%第2代水蚤出現(xiàn)眼部異常。Yasue等[40]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Pax6基因缺陷小鼠，胚胎期小鼠出現(xiàn)不同程度眼部發(fā)育異常。FREM2基因突變可導(dǎo)致胚胎皮膚水皰、隱眼、并指癥和泌尿生殖系統(tǒng)畸形等[41]。Zhang等[42]采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Frem基因突變小鼠模型，小鼠出現(xiàn)雙側(cè)或單側(cè)隱眼表型，伴眼球發(fā)育不良，還可并發(fā)角膜新生血管和虹膜粘連。

綜上所述，CRISPR技術(shù)構(gòu)建動物模型對于后續(xù)的基因編輯治療具有重要意義，有助于擴(kuò)充并驗(yàn)證疾病的致病基因數(shù)據(jù)庫。目前，Mouse Knockout聯(lián)合會等正在廣泛使用該技術(shù)生成基因突變小鼠，以期探索疾病的發(fā)病機(jī)制[43]。但我們?nèi)詰?yīng)注意到，動物疾病模型并不能完全模擬疾病的發(fā)生過程，可能會由于基因缺失而引發(fā)一系列代償反應(yīng)。完全性基因敲除往往會導(dǎo)致胚胎死亡，條件性基因敲除因可在某一特定的時間階段或組織器官內(nèi)調(diào)控靶基因的表達(dá)而越來越受到重視。此外，基因與其相應(yīng)表型并非具有必然的對應(yīng)關(guān)系，遺傳背景及其他因素使基因編輯的結(jié)果更加復(fù)雜[44]。盡管如此，借助基因編輯技術(shù)構(gòu)建疾病動物模型仍是一種非常有前景的探索疾病起源的方法，值得深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突