焦雨帆， 劉飛萍，2， 傅夏燕， 陳其臻， 紀亞忠， 王炎秋

(1. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200065； 2. 上海市嘉定區(qū)婦幼保健院，上海 201821)

凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技術因其具有提高累積妊娠率、降低卵巢過度刺激綜合征發(fā)生率、增加子宮內(nèi)膜容受性等優(yōu)點，已成為人類輔助生殖技術的重要組成部分。FET的成功與否與多種因素有關，如年齡、胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性等，而子宮內(nèi)膜的準備是其中關鍵環(huán)節(jié)，目前最佳子宮內(nèi)膜準備方案尚無共識。國內(nèi)外已將多種子宮內(nèi)膜準備方案應用于臨床，分別為自然周期(natural cycle, NC)方案，激素替代周期(hormone replacement cycle, HRT)方案以及促性腺激素釋放激素激動劑聯(lián)合激素替代周期(gonadotropin releasing hormone agonist plus hormone replacement cycle, GnRHa+HRT)方案。本研究通過比較以上3種內(nèi)膜準備方案，探討何種方案可使FET的患者取得更好的妊娠結局，以期為臨床工作提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年7月1日—2018年12月31日至同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行卵裂期胚胎FET的患者資料，進行回顧性分析。納入標準: 年齡25～34歲；移植2枚胚胎，其中至少移植1枚優(yōu)質(zhì)胚胎；行FET操作；不孕類型為原發(fā)不孕或繼發(fā)不孕；無嚴重器質(zhì)性或免疫性疾病者。排除標準: 存在嚴重子宮畸形；黏膜下子宮肌瘤或肌瘤較大嚴重影響子宮腔形態(tài)；子宮腺肌癥(Ⅳ期)；子宮內(nèi)膜增生、息肉；凍融周期行囊胚移植者；輸卵管積液；免疫因素流產(chǎn)患者；雙方或者其中一方存在染色體異常者；多囊卵巢綜合征患者，資料不全者。

1.2 方法

回顧性分析2016年7月1日—2018年12月31日在同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心進行的605個FET周期患者的臨床資料及胚胎實驗室數(shù)據(jù)。入選標準為NC、HRT或GnRha+HRT周期。所有納入研究的患者胚胎冷凍均采用玻璃化冷凍技術，移植前行宮腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜病變、宮腔粘連等。胚胎移植后12 d測血β-hCG以判斷生化妊娠；妊娠者則于移植后30～35 d行陰道超聲檢查以明確孕囊位置、孕囊個數(shù)、心管搏動，及是否為異位妊娠；隨訪并記錄患者持續(xù)妊娠情況、分娩及新生兒情況。

1.2.1 超聲測量方法 采用三維能量多普勒超聲顯像儀(美國GE公司，Voluson E10型)，對所有患者均由同一醫(yī)師在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行經(jīng)陰道超聲監(jiān)測，采用儀器內(nèi)預定義設置的能量多普勒值對子宮內(nèi)膜進行120°慢掃: 屏幕顯示最完整的子宮內(nèi)膜線時測量內(nèi)膜厚度。應用多平面成像模型描記子宮內(nèi)膜軌跡，按照30°旋轉(zhuǎn)切面，手動描記子宮內(nèi)膜切面軌跡，通過計算機輔助分析成像程序(virtual organ computer-aided analysis, VOCAL)自動生成子宮內(nèi)膜容積。于子宮頸、體部兩側探查，顯示子宮動脈清晰、規(guī)則的脈沖多普勒血流頻譜，觀察并測定子宮動脈PI、RI、S/D值，每項指標測量3次，取其平均值。

1.2.2 自然周期 在月經(jīng)周期第12天左右開始行B超監(jiān)測卵泡，同時測定外周血中女性激素，評估卵泡及內(nèi)膜發(fā)育情況，確定排卵時間，排卵后口服地屈孕酮片(商品名稱: 達芙通)30 mg/d。當B超提示內(nèi)膜厚度(endometrial thickness, Em)≥8 mm、卵泡直徑為18～20 mm，且雌二醇(estradiol, E2)≥650 pmol/L，于排卵后3 d行卵裂期胚胎移植。

1.2.3 激素替代周期 在月經(jīng)周期第2～5天起口服戊酸雌二醇(商品名稱: 補佳樂)2～4 mg/d或芬嗎通(17-β雌二醇片)紅片2～4 mg/d，每隔3～5 d予B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度。當Em≥8 mm，E2水平≥650 pmol/L且孕酮(P)<5.0 nmol/L時加用孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，予以黃體酮針20～40 mg/d肌內(nèi)注射或雪諾酮90 mg/d陰道內(nèi)給藥，并口服地屈孕酮片30 mg/d。

1.2.4 促性腺激素釋放激素激動劑聯(lián)合激素替代周期 對于排卵者于排卵后3～5 d后行垂體降調(diào)，并給予黃體酮類藥物協(xié)助內(nèi)膜轉(zhuǎn)化；對于無排卵或卵泡不破裂黃素化者，予人工周期，同時監(jiān)測內(nèi)膜變化，在使用黃體酮類藥物轉(zhuǎn)化內(nèi)膜的第3～5天予降調(diào)。使用貝依(通用名稱為注射用醋酸亮丙瑞林微球，3.75 mg/支，長效GnRHa)，皮下注射，降調(diào)成功后予激素替代方案，黃體支持同HRT周期。

1.3 觀察指標

(1) 3組不同周期患者基本資料: 年齡、不孕年限、不孕類型、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、移植凍胚級別等；(2) 在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行陰道三維超聲測量子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜容積、子宮動脈PI、RI、S/D值；(3) 臨床妊娠結局: 臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、足月產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率等。

1.4 妊娠結局

臨床妊娠指凍胚移植后5周超聲掃描見孕囊回聲和原始心管搏動。早產(chǎn)定義為妊娠滿28周至不滿37周間分娩；足月產(chǎn)定義為妊娠滿37周至不滿42周間分娩。早期流產(chǎn)指妊娠12周前妊娠終止，晚期流產(chǎn)為妊娠12周至不滿28周間妊娠終止。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同子宮內(nèi)膜準備方案下研究對象基本情況的比較

NC組共納入145個周期，HRT組共納入378個周期，GnRHa+HRT組共納入82個周期，3組子宮內(nèi)膜準備方案年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、移植凍胚級別比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3種子宮內(nèi)膜準備方案下研究對象基本情況的比較

2.2 不同內(nèi)膜準備方案患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日三維超聲各測量指標情況

3種子宮內(nèi)膜準備方案下內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度: HRT組為(8.48±1.72) mm，GnRHa+HRT組為(8.27±2.02) mm，NC組為(9.93±1.78) mm，NC組內(nèi)膜厚度高于HRT組及GnRHa+HRT組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；子宮內(nèi)膜容積: HRT組為(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT組為(2.04±0.04) cm3，NC組為(2.96±0.04) cm3，GnRHa+HRT組子宮內(nèi)膜容積低于HRT組及NC組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。3組患者中子宮動脈血流參數(shù)情況差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 3種內(nèi)膜準備方案患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日三維超聲各測量指標的比較

2.3 不同內(nèi)膜準備方案下妊娠結局的比較

3組患者足月產(chǎn)率比較，HRT組為57.1%(88/154)；GnRHa+HRT組為58.3%(21/36)；NC組為75.3%(55/73)；自然周期(NC)組的足月產(chǎn)率明顯高于HRT組及GnRHa+HRT組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組內(nèi)HRT組與NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。而3組患者臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3種內(nèi)膜準備方案下妊娠結局的比較

2.4 凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)的影響因素分析

以凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)妊娠結局為因變量，單因素Logisitic回歸分析表明，不孕類型、雙胎妊娠及內(nèi)膜調(diào)理方案3項指標對凍融胚胎移植患者是否足月產(chǎn)的影響均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4；進一步多因素Logistic回歸分析結果表明，不孕類型、雙胎妊娠及內(nèi)膜調(diào)理方案為凍融胚胎移植患者是否足月產(chǎn)的獨立影響因素(P<0.05)，其中內(nèi)膜調(diào)理方案中以NC為參考，HRT及GnRHa+HRT兩種方案凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)的可能性均降低，其OR值及95%CI分別為0.452(0.239～0.853)、0.415(0.173～0.995)，見圖1。

表4 影響凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)的單因素logistic回歸分析

圖1 影響凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析Fig.1 Multivariate analysis of factors associated with full-term deliveries

3 討 論

目前IVF-ET治療已成為不孕癥患者最有效的治療方式。相較于鮮胚移植，凍融胚胎移植可顯著降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生[1]，并可于FET前行充分的內(nèi)膜準備以降低子宮內(nèi)膜及子宮環(huán)境的不利影響因素，提高其移植效率。隨著胚胎的玻璃化冷凍保存技術的成熟，其胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能與新鮮胚胎相接近[2]，故FET已經(jīng)成為輔助生殖助孕過程中的一種常規(guī)技術。

3.1 不同子宮內(nèi)膜準備方案的優(yōu)劣性對比

本研究納入了進行NC組、HRT組、GnRHa+HRT組3種內(nèi)膜準備方案的605個周期。NC較為接近生理狀態(tài)，因為有自然排卵后的黃體形成。HRT周期則需在移植后予甾體激素行黃體支持。GnRHa+HRT周期適用于盆腔子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥合并不孕癥的患者以及反復著床失敗的患者。促性腺激素釋放激素激動劑通過與GnRH競爭性結合垂體前葉促性腺激素分泌細胞上的受體，導致垂體不再釋放促性腺激素，實現(xiàn)垂體的降調(diào)，從而抑制內(nèi)源促性腺激素的釋放，有利于改善子宮內(nèi)膜容受性，調(diào)節(jié)免疫活性作用，改善胚胎著床。

3.2 不同內(nèi)膜準備方案患者子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜容積及子宮動脈血流參數(shù)情況

本研究發(fā)現(xiàn)，在FET周期中臨床妊娠組內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度為(8.86±1.97) mm，大于未臨床妊娠組[(8.32±1.59) mm]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。故認為內(nèi)膜厚度與臨床結局呈正相關，與大多數(shù)的文獻報道結果一致。一項納入3 601名不孕婦女IVF-ET周期的多中心回顧性研究發(fā)現(xiàn)，HCG日的內(nèi)膜厚度影響IVF-ET的妊娠結局，當內(nèi)膜厚度<8 mm時臨床妊娠率與活產(chǎn)率較低[3]。Groenewoud等[4]認為在FET周期中內(nèi)膜厚度尚不能預測其妊娠結局。Yuan等[5]的一項大數(shù)據(jù)研究中，共研究了10 000多個IVF/ICSI新鮮周期，結果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜厚度小于8 mm的患者臨床妊娠率明顯低于子宮內(nèi)膜厚度在8～11 mm的患者(分別為23%和37.2%)。

子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指內(nèi)膜允許囊胚定位，黏附，侵入，并誘導內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生一系列變化，最終使胚胎著床。反映ER的指標主要有子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜容積、子宮內(nèi)膜或子宮動脈多普勒數(shù)據(jù)及CD4+、CD8+、CD14+等分子標志物[6]。子宮內(nèi)膜容積反映了整個宮腔子宮內(nèi)膜的情況，內(nèi)膜厚度與內(nèi)膜容積具有顯著相關性。本研究中，黃體轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜容積: HRT組為(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT組為(2.04±0.04)cm3，NC組為(2.96±0.04)cm3，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與3組內(nèi)膜厚度差異相一致。Mayer等[7]在一項回顧性隊列研究中發(fā)現(xiàn)，妊娠組與未妊娠組子宮內(nèi)膜容積存在顯著差異，妊娠率隨子宮內(nèi)膜容積增大而升高，與本研究結果一致。

子宮內(nèi)膜及內(nèi)膜下血流灌注的缺失往往伴隨著子宮動脈的高阻狀態(tài)[8]。本研究中3組內(nèi)膜準備方案患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮動脈血流參數(shù)無明顯差異性，臨床妊娠率亦無顯著性差異。一項研究在胚胎移植當天評估了70名女性，發(fā)現(xiàn)臨床妊娠和未妊娠女性之間子宮動脈PI和RI以及子宮內(nèi)膜下PI和RI相似[9]。但有學者認為子宮動脈阻力可以反映ER并影響妊娠結局，該研究顯示胚胎移植日子宮動脈高PI、RI與不良妊娠結局有關，而子宮內(nèi)膜血流PI、RI相較于子宮動脈降低[10]。盡管子宮動脈高阻力常與不良妊娠結局有關，但其并不能直接反映內(nèi)膜血供，對于妊娠結局的影響仍需進一步分析探討[6]。作為一種非侵入性檢查，經(jīng)陰道三維超聲測量子宮內(nèi)膜容積、子宮內(nèi)膜血流參數(shù)、子宮動脈血流參數(shù)可預測子宮內(nèi)膜容受性，可以指導臨床醫(yī)師進行FET胚胎移植時機的選擇。

3.3 不同子宮內(nèi)膜準備方案對妊娠結局的影響

揭慧英等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，NC周期、HRT周期兩種內(nèi)膜準備方案的胚胎著床率及臨床妊娠率無明顯差異。一項2016年的Meta分析結果顯示，NC周期患者的臨床妊娠率明顯高于HRT周期，推測HRT周期臨床妊娠率的降低可能與治療過程中子宮內(nèi)膜容受性受損以及胚胎種植窗的提前關閉有關[12]。Kalem等[13]的研究同樣證實，NC周期、HRT周期的著床率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率并無差別。本研究根據(jù)患者內(nèi)膜特征，選擇不同的內(nèi)膜處理方案，3組均獲得了較滿意的臨床結局。

3.4 凍融胚胎移植患者足月產(chǎn)的影響因素分析

本研究結果表明，不同的內(nèi)膜調(diào)理方案、雙胎妊娠及不孕類型為足月產(chǎn)的獨立影響因素。相比于HRT及GnRHa周期患者，NC周期患者足月產(chǎn)率顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。原發(fā)不孕的FET患者足月產(chǎn)率較繼發(fā)者高2.170倍(OR=2.170,95%CI: 1.270～3.709)。單胎妊娠患者足月產(chǎn)率較雙胎妊娠患者高2.103倍(OR=2.103,95%CI: 1.132～3.907)。

雙胎妊娠為高危妊娠，易發(fā)生各種妊娠期并發(fā)癥，如早產(chǎn)、胎兒窘迫、產(chǎn)后出血等。早產(chǎn)是雙胎妊娠最常見的并發(fā)癥之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于年齡<35歲的不孕患者，單胎妊娠足月產(chǎn)的可能性為雙胎妊娠的2.103倍(OR=2.103,95%CI=1.132～3.907)。建議對35歲以下年輕患者行單胚移植，以求更好的圍產(chǎn)期結局。

本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)不孕患者足月產(chǎn)率為繼發(fā)性不孕患者的2.170倍(OR=2.170,95%CI=1.270～3.709)。故推測，繼發(fā)不孕為足月產(chǎn)危險因素，可能既往妊娠尤其流產(chǎn)等導致子宮內(nèi)膜的損傷，從而導致胎盤形成不良、宮頸機能不全等，但具體機制需進一步探究[15-16]。

NC方案中，子宮內(nèi)膜發(fā)育為機體生理狀態(tài)下，通過自身內(nèi)源性激素調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于HRT及GnRHa+HRT方案，NC組患者具有更高的足月產(chǎn)率。因此，對于有自然排卵的患者盡可能選用NC方案，可能獲得更好的妊娠結局。

綜上所述，本研究通過回顧性分析單中心的3種不同的子宮內(nèi)膜處理方案，對臨床妊娠結局的影響，結果顯示3組早產(chǎn)率、早期自然流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率等妊娠結局，差異均無統(tǒng)計學意義，而足月產(chǎn)率3組比較，差異有統(tǒng)計學意義。具體機制尚待擴大樣本量，設計多中心的隨機對照試驗和系統(tǒng)性評價，進行深入分析。