張雪晴，仝錫帥, 3，王果帥，卞建春, 3，劉學(xué)忠，袁 燕，鄒 輝，沈小蘭，劉宗平, 3*，顧建紅*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009； 2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室)，揚(yáng)州225009； 4.興化市合陳畜牧獸醫(yī)站，泰州 225733)

鎘(cadmium，Cd)是一種廣泛存在于自然界的重金屬，可通過(guò)消化、呼吸、皮膚等循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，半衰期長(zhǎng)達(dá)20～30年[1]。動(dòng)物攝入超過(guò)一定劑量的鎘，可導(dǎo)致腎、肝、肺、骨骼和生殖器官損傷，并對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性效應(yīng)，進(jìn)而引起多種疾病[2]。骨是鎘毒性作用的靶器官之一，骨組織中的成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)是確保骨組織Ca沉積與骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，而任何形式的OB損傷都可造成骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松癥等疾病。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向OB分化的過(guò)程中，存在一系列縝密的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中，RUNX2(runt related transcription factor 2，RUNX2)屬于Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族，不僅可以誘導(dǎo)BMSCs向OB分化，還可通過(guò)屏蔽與不同細(xì)胞系相關(guān)的基因區(qū)域來(lái)抑制非OB的分化；骨鈣素(osteocalcin，OCN)作為OB成熟的標(biāo)志，其基因啟動(dòng)子區(qū)的OB特異性順式調(diào)控元件與RUNX2結(jié)合；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在OB和OB前體細(xì)胞(osteoblast precursor cells，OBP)中均有表達(dá)；轉(zhuǎn)錄因子osterix(OSX)是高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，與骨組織發(fā)育密切相關(guān)，是OB分化的重要調(diào)節(jié)因子，和RUNX2依次作用于BMSCs[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘在一定程度上能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(osteoclast precursor cells，OCP)向破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的分化，并對(duì)BMSCs向OB的分化具有抑制作用[4-6]。

葛根素(puerarin，Pur)是從中草藥葛根中分離的異黃酮類(lèi)衍生物，主要存在于豆科植物野葛或甘葛藤的根部，具有保護(hù)骨骼的作用，其治療骨質(zhì)疏松癥的療效已被報(bào)道[7]。葛根素具有促進(jìn)OB增殖,提高OB活性的作用[8]。Wnt/β-catenin通路對(duì)OB分化和骨形成有重要作用，鎘可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路導(dǎo)致OB分化受損，而葛根素可通過(guò)Wnt/β-catenin通路降低骨流失[5,9-10]。葛根素對(duì)鎘所致成骨發(fā)育的影響尚未闡明。因此，本研究旨在通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)，研究鎘暴露對(duì)大鼠股骨脛骨OB分化的抑制作用和葛根素對(duì)其的緩解效應(yīng)及機(jī)制，為臨床上葛根素防治鎘暴露所致的骨組織成骨發(fā)育損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)21日齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，購(gòu)自江蘇大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑

葛根素(Sigma，USA)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；蛋白酶抑制劑(蘇州新賽美生物科技有限公司，中國(guó))；Wnt3A、LEF1、TCF1鼠源單抗(Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.，USA)；β-actin、β-catenin鼠源單抗(Cell signaling technology，Lnc，USA)；羊抗鼠-HRP偶聯(lián)抗體(Jackson ImmunoResearch Ltd.，USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó))；醋酸鎘(cadmium acetate，CdAc2)及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

組織研磨機(jī)SN:1001682(天根生化科技有限公司，中國(guó))；NanoDrop2000(Thermo Fisher，USA)；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)(Merck Millipore，USA)；電子天平；ABI7500 qRT-PCR儀(ABI，USA)；PROTEAH電泳儀(BIO-RAD，USA)；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，中國(guó))；5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，Germany)；PinAAcle 900F火焰原子吸收光譜(PerkinElmer，美國(guó))。

1.4 鎘注射濃度及葛根素飼喂量的篩選

1.4.1 篩選鎘注射濃度 選用不同濃度CdAc2(1.25、2.5、5、10及15 mg·kg-1BW)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。每日腹腔注射，連續(xù)注射1周，選擇不良反應(yīng)較輕的劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 篩選葛根素飼喂量 葛根素的飼喂量參考張年寶等[11]研究中的注射劑量，根據(jù)大鼠體重進(jìn)行換算，在當(dāng)前研究中以每千克體重200 mg進(jìn)行計(jì)算，并作為本研究中葛根素的飼喂量。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與染毒

將大鼠籠養(yǎng)于清潔與安靜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)溫度(22±1)℃。自由飲食1 周后隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組(CON)、鎘(Cd)組、葛根素(Pur)組及鎘+葛根素(Cd+Pur)組。葛根素組、鎘+葛根素組大鼠每日灌服葛根素(200 mg·kg-1BW)，對(duì)照組、鎘組大鼠每日灌服相同劑量的純凈水，連續(xù)處理5周。從第5周開(kāi)始，對(duì)照組與葛根素組大鼠每日腹腔注射生理鹽水，鎘組、鎘+葛根素組大鼠每天腹腔注射醋酸鎘(2.5 mg·kg-1BW)，連續(xù)處理1周。飼喂5周后，對(duì)所有大鼠禁食禁水6 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液1 mL，麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，分離股骨與脛骨。

1.6 原子吸收光譜法測(cè)定大鼠骨骼鎘、鈣、磷含量

取各組大鼠骨骼樣品500 mg(濕重)，60 ℃烘干過(guò)夜，微波消解法對(duì)樣品進(jìn)行消解[12]，用超純水定容至5 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)(SRM、1598及NIST)，使用火焰原子吸收光譜測(cè)定骨組織中鎘、Ca及P含量。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)大鼠股骨脛骨中相關(guān)蛋白含量

1.7.1 大鼠股骨脛骨總蛋白制備 取各組大鼠股骨脛骨500 mg，液氮研磨至小塊狀后用組織研磨機(jī)、RIPA裂解蛋白法制備總蛋白樣品。股骨脛骨呈粉末狀后加入RIPA裂解液冰上裂解30 min(RIPA中添加蛋白酶抑制劑，終濃度為1 mmol·L-1)。4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，將各組蛋白樣品濃度調(diào)為一致，添加5×SDS Loading Buffer，混勻，煮沸10 min，-20 ℃保存。

1.7.2 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)量 將蛋白樣品加入凝膠泳道110V恒壓電泳90 min。使用250 mA恒流，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜90 min。將膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂乳溶液(TBST溶液稀釋)，室溫封閉2 h。按照蛋白大小剪條帶，分別加入β-catenin抗體、Wnt3A抗體、LEF1抗體、TCF1抗體、GAPDH抗體于搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影于Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)。Image J軟件分析相關(guān)條帶灰度值。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)大鼠成骨相關(guān)基因表達(dá)量

1.8.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI查詢到的基因全序列，用Blast設(shè)計(jì)引物，序列如表1，GAPDH為內(nèi)參。

表1 目的基因引物序列

1.8.2 qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 取各組大鼠股骨脛骨500 mg，用組織研磨機(jī)結(jié)合TRIzol法提取RNA樣品。每組樣品加入1 mL TRIzol，靜置5 min后加入0.2 mL三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至含有0.5 mL異丙醇的1.5 mL EP管，混勻，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；各管底出現(xiàn)的白色沉淀即RNA，棄去上清并加入1 mL 75%乙醇輕輕搖晃，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min；棄去上清，晾干至RNA透明，加無(wú)酶水溶解，根據(jù)Prime ScriptTMRT Reagent Kits試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBR premix EX TapTMKits試劑盒通過(guò)ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2-△△CT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)與分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性t-檢驗(yàn)和單因素方差(one-way ANOVA)分析，結(jié)果以“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示，*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鎘濃度篩選

各濃度醋酸鎘(CdAc2)腹腔注射大鼠結(jié)果顯示，1.25 mg·kg-1BW組無(wú)明顯不良反應(yīng)，2.5 mg·kg-1BW組大鼠精神沉郁、飲食欲下降，個(gè)別大鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，5 mg·kg-1BW組精神沉郁且飲食欲下降，被毛粗亂，不良癥狀較2.5 mg·kg-1BW組嚴(yán)重，10 mg·kg-1BW組飲食欲下降且所有大鼠于第3日死亡，15 mg·kg-1BW組所有大鼠于第2日死亡。選擇輕微不良反應(yīng)組(2.5 mg·kg-1BW)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 鎘暴露及葛根素處理對(duì)大鼠股骨脛骨中鎘含量的影響

由大鼠股骨脛骨鎘含量檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)，對(duì)照組與葛根素組鎘含量較低，兩組間無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，鎘組股骨脛骨中鎘含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘+葛根素組中鎘含量極顯著降低(P<0.01)。

2.3 鎘暴露及葛根素處理對(duì)大鼠股骨脛骨中Ca和P含量的影響

大鼠股骨脛骨中Ca和P含量檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，各組大鼠股骨脛骨中Ca和P含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

*差異顯著(P<0.05);**差異極顯著(P<0.01)；ns表示無(wú)顯著差異，下同* Indicate significant difference (P<0.05);** Indicate extremely significant difference (P<0.01); ns indicate no significant difference, the same as below圖1 SD大鼠股骨脛骨中鎘含量Fig.1 Content of cadmium in femur and tibia of SD rats

圖2 鎘與葛根素對(duì)SD大鼠股骨脛骨中Ca和P含量的影響Fig.2 Effects of Cadmium and puerarin on Ca and P content in femur and tibia of SD rat

2.4 鎘暴露及葛根素處理對(duì)大鼠股骨脛骨中成骨相關(guān)基因的影響

qRT-PCR檢測(cè)大鼠股骨脛骨中成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、OCN和OSX的mRNA水平。結(jié)果如圖3，與對(duì)照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中RUNX2、OCN、OSXmRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P<0.01)，ALPmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)；葛根素組大鼠股骨脛骨中RUNX2、ALP、OCNmRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)，OSXmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。與鎘組相比，鎘+葛根素組大鼠股骨脛骨中RUNX2、OCN、OSX和ALPmRNA轉(zhuǎn)錄水平均極顯著升高(P<0.01)。

2.5 鎘暴露及葛根素處理對(duì)大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖4)，與對(duì)照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)；葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與鎘組相比，鎘+葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01)。

圖3 鎘與葛根素對(duì)SD大鼠股骨脛骨中成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Effects of cadmium and puerarin on the transcription of osteogenic-related genes in femur and tibia of SD rat

圖4 鎘與葛根素對(duì)SD大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of cadmium and puerarin on the expression of Wnt/β-catenin pathway related proteins in femur and tibia of SD rats

3 討 論

鎘是廣泛存在于環(huán)境中的有毒重金屬，可對(duì)腎產(chǎn)生損傷作用，致腎小管對(duì)Ca和(或)P重吸收障礙，血清中Ca和(或)P缺乏，繼而動(dòng)員骨中Ca和(或)P進(jìn)入血液，造成骨丟失及骨質(zhì)疏松[13-15]。張翔[16]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量鎘暴露20周，可導(dǎo)致骨中的Ca和(或)P沉積下調(diào)。本研究顯示，與對(duì)照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨Ca和P沉積減少，但無(wú)顯著性差異，這可能與鎘作用時(shí)間較短有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，鎘可以促進(jìn)人BMSCs向成脂細(xì)胞分化，抑制其向OB分化，間接造成骨密度下降，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等疾病[17]。骨代謝平衡是OC行使的骨吸收和OB行使的骨重建共同維持[18]，其中，OB具有形成骨骼、調(diào)節(jié)細(xì)胞外骨基質(zhì)成分的構(gòu)成和使Ca及P沉積的功能。OB起源于BMSCs，在轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和OSX的調(diào)控下向成骨祖細(xì)胞定向分化，最終分化為骨細(xì)胞[3]。RUNX2是促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，為OB分化的早期標(biāo)志物，并在骨形成中起關(guān)鍵作用[19]。ALP是BMSCs向OB分化的早期標(biāo)志物，可分解磷酸酯維持礦化所需的無(wú)機(jī)磷酸鹽，其活性水平可以反映OB分化的程度[20-21]。OCN參與胚胎骨形成，并在骨重建過(guò)程中被激活，是OB成熟的重要標(biāo)志[22]。此外，OSX是RUNX2調(diào)控OB分化過(guò)程中的下游靶點(diǎn)，可激活COL1A1(collagen type I alpha 1 chain，COL1A1)和OCN的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)骨形成[23]。骨質(zhì)疏松癥主要是由BMSCs向OB分化失調(diào)所致。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鎘組大鼠OB相關(guān)基因RUNX2及OCN的表達(dá)極顯著降低，與Ma等[6]研究結(jié)果一致；OSX表達(dá)極顯著降低，ALP顯著降低，與Wu等[5]結(jié)果一致。此外，王怡等[24]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鎘對(duì)體外OB有一定的毒性作用。Al-Ghafari等[25]研究發(fā)現(xiàn)，鎘可直接作用于人OB，主要通過(guò)降低ATP含量，抑制線粒體活性和有氧呼吸來(lái)破壞細(xì)胞生物功能。這些研究表明，鎘可對(duì)體內(nèi)外OB的分化及骨礦化產(chǎn)生一定的抑制作用。

葛根素是一種從野葛的根中提取的植物激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和雌激素類(lèi)似，具有一定的抗骨質(zhì)疏松作用。為防止雌性大鼠體內(nèi)不同水平雌激素的干擾，本研究選用了雄性SD大鼠。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有促進(jìn)OB分化的作用，可通過(guò)ERK1/2和p38-MAPK通路促進(jìn)BMSCs向OB的分化[26]。葛根素和鋅可抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化，間接促進(jìn)其向OB分化，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[27]。此外，葛根素亦可與雌二醇協(xié)同作用，增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨密度[28]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，葛根素組大鼠OB相關(guān)基因(RUNX2、OCN和ALP)的表達(dá)極顯著升高；與鎘組相比，鎘+葛根素組骨中鎘含量顯著下降，且成骨相關(guān)基因(RUNX2、OCN、OSX與ALP)表達(dá)極顯著升高，表明葛根素可促進(jìn)OB分化，并減輕鎘在股骨脛骨中的沉積。

另外，研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可參與骨骼的生長(zhǎng)，調(diào)控成骨祖細(xì)胞向OB分化[19,29-30]。Wnt家族由許多高度保守的基因組成，其中Wnt3A可與卷曲蛋白結(jié)合后激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在脊椎動(dòng)物中，β-catenin可發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄激活因子作用，在胞質(zhì)內(nèi)聚集發(fā)生核位移后，與TCF1和LEF1互作并介導(dǎo)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)及其下游基因轉(zhuǎn)錄[31-32]。在臨床應(yīng)用研究方面，葛根素可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕來(lái)曲唑(一種非甾體芳香化酶抑制劑)引起的大鼠骨流失[10]，葛根素可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制人BMSCs成脂分化[33]。本研究中，與對(duì)照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白(β-catenin、LEF1、TCF1與 Wnt3A)的表達(dá)均極顯著下調(diào)，與Wu等[5]報(bào)道一致。且本研究中葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)極顯著升高；與鎘組相比，鎘+葛根素組可使大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)均極顯著上調(diào)，說(shuō)明葛根素通過(guò)Wnt/β-catenin通路緩解鎘暴露對(duì)大鼠股骨脛骨中OB分化的抑制作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，鎘暴露可增加大鼠股骨脛骨中的鎘沉積，并對(duì)OB分化造成一定的損傷，該過(guò)程涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路。此外，葛根素對(duì)鎘抑制大鼠股骨脛骨中OB分化具有一定的緩解效應(yīng)。