汪銘銳，吳俊花，王 飛，邵紅霞，3，錢 琨，3，葉建強，3，4，秦愛建，3，4*

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院 教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009；4.揚州大學 教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus, CIAV)屬圓環(huán)病毒科，是全世界范圍內公認的重要禽類病原體[1-3]。CIAV在雞群中主要以垂直傳播的方式進行傳播，感染后會引起雞貧血及免疫器官發(fā)育不良，易導致疫苗免疫失敗，并常與其他免疫抑制病毒同時感染雞群[4-9]。CIAV基因組共包含3個開放閱讀框[10]，分別編碼結構蛋白VP1和非結構蛋白VP2、VP3，VP2作為非結構蛋白被認為在VP1蛋白的組裝以及VP3蛋白的磷酸化中起重要作用[11-13]。在雞群感染CIAV后，僅需要2周就可檢測到針對VP2抗體的存在，因此可以作為檢測CIAV感染的重要靶標抗原[14]。

已有相關文獻報道表達的重組VP2蛋白可以作為間接ELISA的檢測抗原[14-15]，檢測感染雞群中的VP2蛋白抗體，但特異性和靈敏性有待驗證。目前，國內針對該病的檢測試劑盒較少，且特異性尚有限，而國外的試劑盒價格十分昂貴，不利于大批量的檢測，因此建立一種特異性好，靈敏性高的檢測方法對我國CIAV的防控有重大意義。

mAb以及抗原表位的研究在疾病防控方面取得諸多成果，基于mAb建立的阻斷ELISA具有高度特異性，在諸多疾病的監(jiān)測中得以應用[16-18]，因此制備針對CIAV VP2蛋白的mAb以及抗原表位的研究有助于CIAV防控。本研究通過原核表達VP2蛋白并免疫小鼠制備mAb，對研制mAb識別的抗原表位進行鑒定，為研究VP2蛋白在CIAV感染中的作用以及病毒檢測方法的建立提供了基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

CIAV海安分離株(HA9805)、低致病性禽流感病毒(LPAIV)及其mAb 2A8、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)及其mAb 5D3、馬立克病病毒(MDV)及其mAb BA4、pET-32a載體、MDCC-MSB1細胞、DF1細胞、CEF細胞、MDCK細胞、Sf9細胞、SP2/0細胞、重組桿狀病毒rBac-CIAV-VP2、pCAGSS-VP2-Flag質粒、大腸桿菌BL21 (DE3)由本實驗室保存；6～8周齡BALB/c母鼠由揚州大學比較醫(yī)學中心提供。Axy Prep基因組DNA小量試劑盒購自Axygen公司;膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；轉染試劑TransIT-LT1購自Mirus公司；FITC標記山羊抗鼠IgG、HRP標記山羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；聚乙二醇(PEG1500)購自Roche公司；蛋白Marker、高保真酶購于諾唯贊公司，ECL發(fā)光顯色液購自NCM Biotech公司；mAb亞類鑒定試劑盒購自SouthernBiotech公司；RIPA裂解液(強)購自康為世紀公司。

1.2 原核表達載體構建及VP2重組蛋白的誘導表達

根據CIAV的VP2(NCBI序列號：M55918.1)的序列，設計合成了1對引物(EcoRⅠ-F:5′-CCGGAATTCATGCACGGGAACGGCG-3′,XhoⅠ-R:5′-CCGCTCGAGCACTATACGTACCGGGG-CG- 3′)，按照文獻[19]的方法培養(yǎng)CIAV，CIAV感染MSB1細胞48～72 h后收集細胞懸液提取基因組，以基因組為模板，PCR擴增CIAV的VP2基因并克隆至原核表達載體pET-32a，轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中構建表達菌株，同時設置轉化pET-32a空載體組為對照。參考文獻[20]進行誘導表達：將重組菌加入含有氨芐青霉素的LB液體中過夜培養(yǎng)，以1∶100的比例接種于含有氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，約3 h后(OD600 nm=0.6～0.8)加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1誘導4 h，所得菌液離心后，使用PBS洗滌并以1∶5的比例重懸，冰浴裂解5 min，分別取上清和沉淀15 μL進行SDS-PAGE分析。

1.3 蛋白樣品的制備及小鼠免疫

按參考文獻[20]方法制備蛋白樣品并免疫小鼠。主要過程：將表達的重組蛋白進行SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色并充分脫色，切下目的蛋白條帶，將目的條帶置于凍干機中過夜凍干后，加入適量PBS研磨，直至樣品能順暢地通過1 mL注射器。取6周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫，免疫方式均為腹腔注射，第4次免疫后72 h按照常規(guī)方法，用聚乙二醇(PEG1500)融合。

1.4 IFA篩選陽性雜交瘤細胞

用桿狀病毒rBac-CIAV-VP2感染Sf9細胞，72 h 后以預冷的丙酮乙醇(3∶2)固定，作為IFA篩選抗原進行篩選：以雜交瘤上清為一抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗4遍；再以FITC標記山羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)為二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗5遍， 最后滴加甘油于熒光顯微鏡下觀察。將pCAGGS-VP2-Flag轉染至DF1細胞，48 h后使用丙酮乙醇固定，用于陽性克隆的進一步驗證。3次篩選后，對陽性克隆進行3次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗CIAV VP2蛋白的雜交瘤細胞株。取雜交瘤培養(yǎng)上清，按照SouthernBiotech公司的mAb亞類鑒定試劑盒對制備的mAb進行亞類鑒定。將陽性雜交瘤細胞株連續(xù)傳代15代；各代次凍存6個月后復蘇，并采用上述IFA檢測雜交瘤細胞中的mAb。

1.5 單抗腹水制備以及效價測定

取8周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射石蠟油500 μL·只-1，2周后腹腔注射雜交瘤細胞，每天觀察腹部變化，待腹部明顯膨大后，采集腹水。以rBac-CIAV-VP2感染的Sf9細胞為檢測抗原，將腹水倍比稀釋作為一抗，進行IFA效價檢測。

1.6 Western blot鑒定

參考文獻[21]中的方法進行Western blot的鑒定，將感染rBac-CIAV-VP2的Sf9細胞裂解產物、轉染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細胞裂解產物以及原核表達的His-VP2蛋白分別與5×SDS Loading Buffer以4∶1混勻并煮沸5 min作為蛋白樣品，進行SDS-PAGE并轉印至硝酸纖維素膜上。轉印結束后，將硝酸纖維素膜置于5%脫脂乳中，37 ℃封閉1.5 h；以雜交瘤上清(1∶5稀釋)為一抗，37℃孵育1 h，PBST洗4遍；再以HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶30 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗5遍后,經ECL發(fā)光顯色液顯色觀察。

1.7 mAb特異性鑒定

將感染ALV-J的DF1細胞、感染LPAIV的MDCK細胞、感染MDV的CEF細胞固定作為檢測原，IFA鑒定mAb的特異性，同時設置針對相應病毒的抗體5D3(ALV-J)、2A8(LPAIV)、BA4(MDV)為陽性對照。

1.8 mAb識別抗原表位的鑒定

參考文獻[20]進行表位鑒定：以PCR擴增CIAVVP2基因的截短片段并連接入pET-32a表達載體，轉入BL21(DE3)后經IPTG誘導表達截短蛋白，裂解菌體用于抗原表位的鑒定。參照“1.6”方法進行Western blot分析，鑒定截短蛋白與mAb的反應性，同時以鼠抗His標簽抗體檢測蛋白是否成功表達。所用到的截短蛋白引物見表1。

1.9 mAb識別表位的保守性分析

參照GenBank中23株國內外CIAV毒株VP2的氨基酸序列，登錄號分別為AAA91822.1、AAB06180.1、AAC58476.1、AAD09422.1、BAA77832.1、AAG34179.1、AAM20897.1、AAL79913.1、AAL99895.1、AAK83006.1、ABJ90437.1、AAZ73182.1、ADJ18276.1、AEN71111.1、AFZ94856.1、AGW323371、AID81956.1、AIZ75615.1、AIV09094.1、ANA51883.1、APQ44720.1、ASL68907.1、ATG84571.1，利用DNAStar分析以上序列，對抗體識別氨基酸序列進行保守性分析。

表1 截短表達CIAV VP2蛋白引物設計

2 結 果

2.1 His-VP2融合蛋白的表達

按照“1.2”中引物PCR擴增CIAV的VP2基因，經過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果成功擴增出目的基因，大小約為648 bp(圖1A)。與pET-32a連接并轉化BL21細菌，經SDS-PAGE結果顯示，成功獲得His-VP2融合蛋白，相對分子質量約50 ku(圖1B)。

2.2 mAb的制備

取免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，經過多次IFA篩選，結果成功篩選到1株穩(wěn)定分泌針對CIAV VP2蛋白mAb的雜交瘤細胞株，命名為CIAV-VP2-4A12。該細胞株分泌的mAb可以與轉染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細胞以及感染桿狀病毒rBac-CIAV-VP2后表達VP2蛋白的Sf9細胞反應(圖2)。經過亞類鑒定試劑盒鑒定mAb CIAV-VP2-4A12重鏈為IgG1型，輕鏈為kappa鏈。經測定，腹水的IFA效價為1∶12 800。

2.3 Western blot鑒定

Western blot結果顯示，mAb CIAV-VP2-4A12能與原核表達、桿狀病毒系統(tǒng)表達以及轉染DF1細胞表達的VP2蛋白反應，產生特異性條帶(圖3)，桿狀病毒表達的VP2蛋白經過加工修飾大小約為38 ku，轉染pCAGGS-VP2-Flag(Flag標簽大小為0.9 ku)的DF1細胞所表達的VP2大小約為35 ku。

A. CIAV VP2基因的PCR擴增結果(M. DL10000 DNA相對分子質量標準；1. VP2基因；2. 陰性對照)；B. 原核表達VP2蛋白的SDS-PAGE分析(M. 蛋白質相對分子質量標準；1. pET-32a誘導后的上清；2. pET-32a誘導后的沉淀；3. pET-32a-VP2誘導后的上清；4. pET-32a-VP2誘導后的沉淀)A. PCR amplification result of CIAV VP2 gene (M. DL10000 DNA marker; 1. VP2 gene; 2. Negative control); B. SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression of VP2 protein (M. Protein marker; 1. Supernatant of induced pET-32a lysate; 2. Precipitation of induced pET-32a lysate; 3. Supernatant of induced pET-32a-VP2 lysate; 4. Precipitation of induced pET-32a-VP2 lysate)圖1 CIAV VP2基因的PCR擴增及原核表達VP2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 Amplification of CIAV VP2 and SDS-PAGE analysis of recombinant protein His-VP2 expressed in E. coli

A. 感染rBac-CIAV-VP2的Sf9細胞；B. 感染野生型桿狀病毒的Sf9細胞；C. 轉染pCAGGS-VP2-Flag的DF1細胞；D. 轉染pCAGGS的DF1細胞A. Sf9 cells infected with rBac-CIAV-VP2; B. Sf9 cells infected with wild baclovirus; C. DF1 cells transfected with pCAGGS-VP2-Flag; D. DF1 cells transfected with pCAGGS圖2 mAb CIAV-VP2-4A12的IFA鑒定(400×)Fig.2 IFA Identification of mAb CIAV-VP2-4A12(400×)

2.4 特異性鑒定

將LPAIV、ALV-J、MDV感染的細胞經過固定后以mAb CIAV-VP2-4A12以及針對各自病毒的mAb為一抗，進行IFA鑒定，結果顯示，陽性對照組均出現(xiàn)了特異性熒光，而mAb CIAV-VP2-4A12不與3種病毒反應(圖4)，說明mAb的特異性較好。

2.5 抗原表位的鑒定

將截短表達CIAV VP2蛋白作為抗原，以mAb CIAV-VP2-4A12和His標簽抗體為一抗進行Western blot鑒定。結果顯示，當VP2蛋白分為兩段(aa1～aa130和aa111～aa216)表達時，mAb可以識別aa111～aa216(圖5)；將該區(qū)域分成兩段，發(fā)現(xiàn)mAb識別的區(qū)域為aa111～aa170，而不與aa156～aa216反應(圖5)，說明mAb識別表位的N端位于aa111～aa156；再將VP2蛋白N端從aa111逐步截短表達，進一步確定mAb識別表位的N端位于aa147～aa156片段(圖5)。為精確定位mAb識別序列的N端位置，將VP2蛋白N端從aa148開始逐個缺失表達，結果發(fā)現(xiàn),mAb與片段aa155～aa216仍可以反應(圖5)，由上述結果可知,mAb不與aa156～aa216反應，故mAb CIAV-VP2-4A12識別表位的N端為aa155；之后將VP2蛋白C端從aa165逐個截短表達，發(fā)現(xiàn)mAb可以識別截短片段aa1～aa159而不識別aa1～aa158，說明mAb CIAV-VP2-4A12識別的最短序列aa155～aa159，該區(qū)域的氨基酸序列為155KTVRW159(圖5)。

陽性對照所用抗體為2A8(LPAIV)、5D3(ALV-J)和BA4(MDV)The antibodies used in positive control were 2A8 (LPAIV),5D3(ALV-J) and BA4(MDV)圖4 mAb CIAV-VP2-4A12 特異性鑒定(200×)Fig.4 Specific identification of mAb CIAV-VP2-4A12(200×)

A. Western blot分析；B. 截短片段示意圖A. Western blot analysis; B. Schematic diagram of the truncated fragments圖5 mAb CIAV-VP2-4A12識別表位的定位Fig.5 Identification of antigen epitope recognized by mAb CIAV-VP2-4A12

2.6 抗原表位的保守性分析

在GenBank下載國內外的23株CIAV VP2氨基酸序列，并使用DNAStar軟件分析mAb識別區(qū)域在不同毒株中的保守性，結果顯示,CIAV的VP2蛋白在aa155～aa159處沒有發(fā)生氨基酸突變(圖6)，表明mAb CIAV-VP2-4A12識別的氨基酸序列在各毒株間高度保守。

圖6 mAb CIAV-VP2-4A12識別表位的保守性分析Fig.6 Conservative analysis of antigen epitope recognized by mAb CIAV-VP2-4A12

3 討 論

CIAV是一種重要的禽類免疫抑制病，自1979年被發(fā)現(xiàn)以來，包括我國在內的多個國家陸續(xù)分離到該病原體[22-25]，目前商品化疫苗防止該病的效果有限，且沒有特效藥可用于CIAV的治療，對于該病及時準確的監(jiān)測是防控中的重要環(huán)節(jié)[26-27]。

近年來，mAb以及抗原表位的研究成為疾病的防控的熱門研究領域。通過病毒抗原及其mAb建立的阻斷ELISA，相比于常規(guī)的ELISA，不會受到血清中的細胞因子等雜質的影響，極大提高了檢測的特異性[16-18]。因此制備針對病毒蛋白的mAb并對其進行表位研究具有應用前景。CIAV目前只有1個血清型，在病毒的3個蛋白中，VP2蛋白在不同毒株中具有較高的保守性[28]，是建立檢測方法的理想抗原。鑒于CIAV生長速度緩慢，難以獲得滴度較高的病毒，利用外源表達的病毒蛋白免疫小鼠制備mAb是制備CIAV mAb的主要途徑[29-31]。本研究在制備VP2蛋白mAb時選擇原核表達的VP2重組蛋白為免疫原，并嘗試使用切膠純化直接免疫小鼠，省去了變性純化等步驟，節(jié)約了時間與成本。在篩選mAb時，為了避免非特異性抗體的產生，不同于陸桂麗等[30]和陳延飛[31]使用原核表達的抗原進行間接ELISA篩選，本研究采用真核系統(tǒng)表達的VP2蛋白進行IFA篩選，提高了篩選方法的特異性，最終獲得了高效價的特異性mAb。

目前，與VP2蛋白抗原表位的相關研究較少，陳延飛等[31]和王曉燕等[32]制備了VP2蛋白的mAbs并初步定位識別表位，發(fā)現(xiàn)所制備mAbs的識別區(qū)域分別位于VP2蛋白的aa21～aa36、aa111～aa126、aa121～aa136以及aa20～aa40，但均未精確定位具體識別的氨基酸。為了研究已制備的mAb針對的抗原表位與先前報道是否存在差異，本研究通過逐步截短表達VP2蛋白，采用Western blot方法檢測與不同截短蛋白的反應性，對表位進行精確定位，確定該mAb識別抗原表位為aa155～aa159，發(fā)現(xiàn)了不同于前人鑒定的新的抗原表位并定位至5個氨基酸，經過同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)國內外不同毒株在該識別區(qū)域十分保守，具有潛在應用前景。

4 結 論

成功制備針對CIAV VP2蛋白的mAb，確定其識別表位為155KTVRW159，為VP2蛋白結構與功能的研究以及CIAV檢測方法的建立奠定了基礎。