武艷平，魏 岳，康昭風(fēng)，謝明貴，謝金防

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200)

由于我國(guó)各地經(jīng)濟(jì)文化和地理?xiàng)l件的不同，形成了許多各具特色的地方雞品種，這些地方雞資源有豐富的遺傳多樣性和很大的遺傳選擇潛力，為地方雞生產(chǎn)及品種改良提供了素材。江西及周邊地區(qū)地方雞品種豐富，江西地方雞品種有崇仁麻雞、安義瓦灰雞、泰和烏雞等8個(gè)地方雞品種；廣東省的地方雞有惠陽胡須雞、清遠(yuǎn)麻雞等，浙江省的仙居雞、江蘇省的狼山雞等，是我國(guó)地方雞品種資源的重要組成部分。這些地方雞品種各具特色，如泰和烏骨雞的藥用性、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞所產(chǎn)天然綠殼雞蛋、安義瓦灰雞有類似于烏骨雞的藥用價(jià)值等。地方雞品種在早熟性、肉質(zhì)風(fēng)味和適應(yīng)性等方面有突出的特點(diǎn)，但是地方雞大多生長(zhǎng)或繁殖性能較低，所以經(jīng)濟(jì)效益較差。為適應(yīng)市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)需求，生產(chǎn)和研究人員引進(jìn)了經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的外來品種，外來品種的利用和雜交改良提高了經(jīng)濟(jì)效益，但也導(dǎo)致了許多特色基因資源喪失、地方雞品種群體數(shù)量下降以及多樣性降低等。因此，開展地方雞的遺傳多樣性和系統(tǒng)關(guān)系的研究尤為迫切，通過提高資源研究的水平和完整性，可以加強(qiáng)地方雞遺傳資源的保護(hù)，為后續(xù)資源開發(fā)利用提供基礎(chǔ)和依據(jù)[1-5]。利用多種分子標(biāo)記對(duì)地方雞的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化的研究已有很多[6-9]。近年來，全基因組SNP芯片被應(yīng)用到農(nóng)業(yè)的各個(gè)方面，包括分子檢測(cè)、育種以及保種等[10-12]，劉彬等[13]利用SNP芯片分析青峪豬保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)表明,保種群體在閉鎖的繼代繁育過程中存在群體遺傳多樣性損失,需要加強(qiáng)選配或?qū)胪庋源_保青峪豬遺傳資源的長(zhǎng)期保存。蔡春波等[14]運(yùn)用SNP芯片評(píng)估馬身豬保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明馬身豬保種群體的遺傳多樣性較豐富,但近交程度高,家系少需擴(kuò)大保種群體數(shù)量,降低近交系數(shù)。許多學(xué)者利用雞的SNP 60K芯片開展遺傳多樣性分析[15-16]、繁殖、肉質(zhì)和生長(zhǎng)等性狀的研究[17-18]。SNP芯片工作原理是利用固定的標(biāo)記DNA序列與待測(cè)基因組發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而精準(zhǔn)鑒定遺傳變異信息。全基因組SNP芯片的出現(xiàn)為遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及遺傳進(jìn)化等研究提供了有效的途徑和方法，國(guó)內(nèi)外開展了很多基于全基因組的遺傳多樣性和系統(tǒng)關(guān)系的研究[19-24]。

本研究將就江西及周邊省份地方雞品種進(jìn)行全基因組SNP檢測(cè)，分析地方雞品種多樣性、群體結(jié)構(gòu)、網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化等。通過對(duì)檢測(cè)結(jié)果不同變異位點(diǎn)分析，了解品種的遺傳多樣性，確定品種間的遺傳關(guān)系，為地方雞品種資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

8個(gè)地方雞種共125個(gè)血樣分別采自各個(gè)地方雞保種場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)和保種中心。各品種樣本數(shù)量及產(chǎn)地見表1。每只雞翅靜脈采血，采用DNA提取試劑盒提取血液DNA, 利用DNA濃度儀檢測(cè)提取的DNA濃度，取部分樣稀釋至100 ng·mL-1,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

質(zhì)檢合格的 DNA 樣品采用雞的Illumina 60K芯片進(jìn)行SNP分型，然后按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控：先去除性染色體上的位點(diǎn)，再選擇 SNP 檢出率大于 0.9 和最小等位基因頻率大于 0.01 的位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 PLINK v1.07軟件計(jì)算各品種多態(tài)性位點(diǎn)比例、SNP 位點(diǎn)期望雜合度(He)以及個(gè)體間遺傳距離，MEGA7.0軟件用于堿基變異位點(diǎn)、系統(tǒng)進(jìn)化分析[25]。GCTA v1.02[26]軟 件 用于主成分分析。分子差異等級(jí)分析(analysis of molecular variance，AMOVA)在ARLEQUIN 3.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算獲得[27]。使用powermarkerV3.25對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行雜合度及遺傳距離分析。

2 結(jié) 果

2.1 雞的60K芯片多態(tài)性分析

對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,選擇檢出率大于90%的樣本,并且MAF(minor allele frequency)大于5%的位點(diǎn)進(jìn)入后期分析，最終得到45 647個(gè)位點(diǎn)上的數(shù)據(jù)用于群體結(jié)構(gòu)分析, 為消除LD 的影響，使用plinkv1.07的IBS 聚類法對(duì)樣本進(jìn)行篩選，以25個(gè)SNP為一個(gè)窗口, 5個(gè)SNPs 為步長(zhǎng)，對(duì)常染色體上的SNP標(biāo)記進(jìn)行篩選，基予得到的獨(dú)立12 045個(gè)SNPs 計(jì)算樣本之間的IBS 距離，并進(jìn)行MDS(多維度)分析，見圖1。不同地區(qū)的地方雞沒有明顯的地域差異，崇仁麻雞與其它品種距離較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)檫x擇了崇仁麻雞的選育品種，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的選育，與其它未選育的地方雞距離越來越遠(yuǎn)。

2.2 芯片遺傳多樣性分析

選擇MAF>0.2的位點(diǎn)，共31 943個(gè)。使用powermarkerV3.25對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行雜合度及遺傳距離分析。雜合度是從一個(gè)基因庫(kù)中隨機(jī)抽出的一個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè)拷貝為非純合基因的概率。遺傳雜合度的大小可近似反映出遺傳結(jié)構(gòu)變異的高低，遺傳雜合度越大，表示品種變異程度越大。本研究的各位點(diǎn)的平均基因多樣度0.442 1和平均遺傳雜合度0.382 1。多態(tài)信息含量值是衡量基因變異程度高低、反映遺傳信息的多少的指標(biāo)。多態(tài)信息含量是等位基因頻率和等位基因數(shù)的變化函數(shù)。當(dāng)位點(diǎn)PIC>0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)位點(diǎn)0.25

2.3 遺傳距離分析

本研究利用 PLINK 軟件計(jì)算所有兩兩個(gè)體間的遺傳距離，8個(gè)地方雞種個(gè)體間的遺傳距離范圍在 0.000～0.415。品種內(nèi)部的個(gè)體的遺傳距離要小于 2 個(gè)品種間的個(gè)體的遺傳距離，同一品種的所有個(gè)體能夠聚在一起。品種間的遺傳距離見表4，品種間的遺傳距離在 0.254 9～0.360 9，修水黃羽烏雞和泰和烏雞的遺傳距離0.254 9，東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和崇仁麻雞的遺傳距離0.306 9。安義瓦灰雞與其它品種的遺傳距離在0.274 7和0.340 8之間，其中和修水黃羽烏雞遺傳距離最近，和崇仁麻雞遺傳距離最遠(yuǎn)。修水黃羽烏雞與其它品種有相對(duì)較近的遺傳距離。

表2 部分位點(diǎn)雜合度及PIC統(tǒng)計(jì)

表3 部分位點(diǎn)等位基因統(tǒng)計(jì)

表4 8個(gè)品種間的遺傳距離

3 討 論

3.1 江西省及周邊地區(qū)地方雞遺傳多樣性

江西省及周邊地區(qū)地方雞遺傳資源豐富，是遺傳多樣性的重要組成部分,蘊(yùn)藏著許多獨(dú)特的性狀。遺傳多樣性越高，種群選擇潛力就越大。賈曉旭等[28]對(duì)5個(gè)江蘇省地方雞品種進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示有些群體遺傳多樣性較低，品種間分化不顯著，推測(cè)可能受到了外來品種的侵入。該研究結(jié)果為江蘇地方雞遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供了遺傳背景信息。王珍珍等[29]通過對(duì)浙江省境內(nèi)6個(gè)雞品種的遺傳多樣性研究，分析了品種間的遺傳距離，結(jié)果顯示6個(gè)群體遺傳多樣性均較高，其中遺傳多樣性最高是白耳黃雞，通過多樣性研究完善了浙江省主要雞品種的遺傳信息，為地方雞遺傳資源的保護(hù)及開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。黃玲玲[30]對(duì)浙江省地方雞品種進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化研究，結(jié)果表明7個(gè)群體分為兩支,第1分支為白耳黃雞和鵲山雞，第2分支為仙居雞與龍游麻雞聚合后,再與宮廷黃雞、絲羽烏骨和雞蕭山雞聚為一起。7個(gè)地方雞品種群體分化程度較低，群體間基因交流水平較高，推測(cè)浙江品種雞群體之間基因流動(dòng)頻繁，從而抑制群體遺傳分化。唐修君等[31]利用Cytb基因全序列分析江西4個(gè)地方雞品種多態(tài)性和遺傳起源，結(jié)果顯示白耳黃雞和安義瓦灰雞的遺傳多樣性較為豐富，泰和烏雞群體相對(duì)較為穩(wěn)定。李國(guó)輝等[32]基于RAD-seq技術(shù)分析邊雞保種群體的遺傳進(jìn)化，結(jié)果表明,邊雞與大骨雞、安義瓦灰雞及狼山雞聚為一類,親緣關(guān)系較近。基因功能分析的結(jié)果有助于了解地方雞的特性，為我國(guó)地方雞種的遺傳進(jìn)化、種質(zhì)特性評(píng)價(jià)及品種保護(hù)提供理論依據(jù)。本研究利用60 KSNP芯片分析江西及部分周邊省份的8個(gè)地方雞品種的遺傳多樣性，多態(tài)信息含量大于0.25，屬于中度多態(tài)，表明地方雞有豐富的遺傳多樣性，泰和烏雞和修水黃羽烏雞這兩個(gè)烏雞品種相較于其它品種有較近的遺傳距離,與王海龍等[33]研究結(jié)果一致，其利用線粒體DNA分析了四川3個(gè)地方雞品種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)品種有較高遺傳多樣性，并且2個(gè)烏骨雞品種聚在一起。

3.2 地方雞的保種和利用

現(xiàn)在地方雞品種資源主要根據(jù)地理位置、表型性狀及分布特點(diǎn)來確定,對(duì)地方雞的起源、遺傳多樣性信息及遺傳關(guān)系并沒有進(jìn)行充分研究。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，研究生物遺傳信息的手段有了極大的豐富,通過遺傳背景的研究可以幫助研究人員準(zhǔn)確地掌握和科學(xué)地分析生物遺傳特點(diǎn)和特性，為更好地研究生物本質(zhì)提供了依據(jù)。利用分子生物技術(shù)分析種質(zhì)資源遺傳信息,為有效地保護(hù)生物多樣性提供科學(xué)的依據(jù)和手段。Guo等[34]基于表型和基因組信息評(píng)價(jià)北京油雞保種群保種情況，結(jié)果顯示，1979—2019年以來,北京油雞保種群體鳳冠、脛?dòng)?、五趾等典型的外貌特征明顯且百分比穩(wěn)定;近交系數(shù)增長(zhǎng)緩慢,國(guó)家級(jí)北京油雞保種場(chǎng)隨機(jī)交配保種群體的保種工作是十分有效的。Liu等[35]開發(fā)了一個(gè)55K基因芯片，適用于地方雞和商業(yè)配套系，該芯片可以有廣泛的應(yīng)用，如基因組選擇育種，特定性狀選育以及雞種的多樣性研究等。將芯片用于地方雞的保種和利用已有報(bào)道，李凱航等[36]采用“京芯一號(hào)”SNP芯片對(duì)現(xiàn)有60個(gè)家系的浦東雞群體進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，浦東雞群體遺傳多樣性較低，選育程度較高，通過聚類分析劃分家系，提出適合的配種方案。Li等[37]利用全基因組SNP相互作用分析雞的體重生長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果表明，雞體重遺傳網(wǎng)絡(luò)具有動(dòng)態(tài)性和時(shí)間依賴性。韓威等[38]利用全基因組SNP標(biāo)記分析9個(gè)地方雞種的遺傳進(jìn)化，研究結(jié)果在全基因組水平上揭示了部分地方雞種遺傳結(jié)構(gòu)和選擇馴化，也為進(jìn)一步發(fā)掘重要功能基因奠定了基礎(chǔ)。Mao 等[39]利用全基因組SNP數(shù)據(jù)研究江西地方雞種黑羽選擇的群體結(jié)構(gòu)和特征，發(fā)現(xiàn)了黑色羽毛的候選基因，為進(jìn)一步鑒定雞黑色羽毛突變提供了依據(jù)。莫國(guó)東等[40]利用微衛(wèi)星和線粒體DNA分子標(biāo)記分析了廣西三黃雞的遺傳多樣性并對(duì)其保種效果進(jìn)行了分析,結(jié)果表明，廣西三黃雞具有較為豐富的遺傳多樣性,有些保種場(chǎng)需進(jìn)一步提純保種。本研究利用60K SNP芯片分析了8個(gè)地方雞品種的遺傳多樣性以及品種的遺傳距離等，分析各個(gè)雞品種多態(tài)位點(diǎn)和特異單倍型，通過對(duì)各個(gè)雞品種遺傳信息的分析，探討可能的來源和遺傳關(guān)系，為地方雞品種的保種以及專門化品系的培育提供參考。修水黃羽烏雞是新發(fā)現(xiàn)的品種，還未經(jīng)選育的傳統(tǒng)原始品種，遺傳多樣性高，在保護(hù)好特異性品種資源的同時(shí)，可以進(jìn)一步完善良種繁育體系，加強(qiáng)品系選育。泰和烏雞與修水黃羽烏雞和安義瓦灰雞有較近的遺傳關(guān)系，在后續(xù)的研究中，可以針對(duì)烏骨雞進(jìn)行專門的研究，進(jìn)一步了解烏骨雞的起源進(jìn)化，為烏骨雞的保種和開發(fā)利用提高理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過對(duì)8個(gè)地方雞品種的全基因組SNP分析，發(fā)現(xiàn)各個(gè)品種在各位點(diǎn)的基因多樣度和遺傳雜合度較高，多態(tài)信息含量為中度多態(tài)，表明8個(gè)地方雞品種有較豐富的遺傳多樣性,可為以后品種開發(fā)利用提供遺傳素材；MDS(多維度)分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的地方雞沒有明顯的地域差異，可能存在不同程度的基因交流；遺傳距離分析表明兩個(gè)烏雞品種(泰和烏雞和修水黃羽烏雞)和安義瓦灰雞品種有相對(duì)較近的遺傳關(guān)系，為進(jìn)一步研究烏雞的起源進(jìn)化提供了理論基礎(chǔ)。