陳永杰，劉健新，李慧子，鐘文霞，李保建，皮墨霖，寧章勇,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes，STING)是胞質(zhì)DNA感受器，在機(jī)體的天然免疫中發(fā)揮著重要作用[1-2]。當(dāng)DNA病毒、細(xì)菌等侵入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)腺苷酸鳥(niǎo)苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，c GAS)與dsDNA結(jié)合，產(chǎn)生內(nèi)源性的環(huán)化二核苷酸cGAMP并介導(dǎo)STING構(gòu)象發(fā)生改變且被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，啟動(dòng)炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[3-4]。此外，STING自身也可以直接結(jié)合DNA并通過(guò)二聚化和易位激活STING-TBK-1-IRF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而觸發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)[5-6]。研究表明，腺病毒、牛痘病毒、乳頭瘤病毒和Ⅰ型皰疹病毒等均可以激活STING信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)拮抗病毒的增殖[7-11]。在敲除小鼠STING基因后，小鼠機(jī)體內(nèi)感染HBV的滴度明顯升高[12]，這提示STING具有限制DNA病毒增殖的作用。探索STING在不同病毒感染和增殖中的作用，為開(kāi)發(fā)基于STING蛋白的新型抗病毒藥物提供了可能。

羊口瘡(orf)是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)引起的一種急性、接觸性人畜共患傳染病，不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類(lèi)健康[13-16]。ORFV是痘病毒科副痘病毒屬dsDNA病毒[17]，該病毒及其編碼蛋白可以通過(guò)拮抗宿主的天然免疫，在同一動(dòng)物發(fā)生重復(fù)感染[18]。ORFV為什么可以反復(fù)突破機(jī)體的免疫系統(tǒng)？機(jī)體的天然免疫分子對(duì)ORFV的具有什么樣的作用？這些問(wèn)題是今后探索ORFV致病機(jī)制的重要研究方向。作為重要的天然免疫核心分子，STING在ORFV感染中的作用如何，該蛋白對(duì)ORFV的復(fù)制有何影響仍然未知，這也是人們希望探索的問(wèn)題。

本研究通過(guò)構(gòu)建ORFV感染OFTu細(xì)胞的模型，獲得了STING及其相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)數(shù)據(jù)，分析了OFTu細(xì)胞過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)STING對(duì)ORFV增殖的影響。研究結(jié)果可為深入理解STING在ORFV復(fù)制中的作用提供理論依據(jù)，也可為深入探索ORFV感染和致病的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及耗材

RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒、LATaqDNA聚合酶、E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、pMDTM18-T Vector、DL500 marker、DL2000 marker、DL5000 marker、限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ、EcoRI和HindⅢ，熒光定量SYBR Premix ExTaqⅡ等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。胎牛血清和MEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。L-谷氨酰胺、0.25%胰酶-EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗、RIPA裂解液等均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。兔抗β-actin IgG單克隆抗體購(gòu)自博士德生物有限公司。兔抗GFP IgG多克隆抗體購(gòu)自SANTA CRUZ生物有限公司。pEGFP載體、pSuper.Retro.Neo+GFP載體、OFTu細(xì)胞、GDZC株ORFV和兔抗羊STING多克隆抗體[19]由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理教研室保存。

1.2 STING過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提交至NCBI的山羊STING基因(KR060015)的mRNA序列[20]設(shè)計(jì)STING引物，上游：5′-ATATATAGATCTCGCCACCATGCCTCACTCCAGCC-3′(下劃線(xiàn)為BglⅡ酶切位點(diǎn))，下游：5′-GATCACGAATTCGGAAGACATCTGAGCGG-3′(下劃線(xiàn)為EcoR I酶切位點(diǎn))。采用50 μL 體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×LATaqBuffer Ⅱ 5 μL，dNTP Mixture 8 μL(2.5 μmol·L-1)，pMD-18T-STING質(zhì)粒1 μL(50 ng·μL-1)，上下引物各2 μL(10 μmol·L-1)，LATaqDNA聚合酶0.5 μL， 加ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè) 循環(huán)；72 ℃ 10 min。用BglⅡ和EcoRⅠ對(duì)回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并連接到具有相同酶切位點(diǎn)的pEGFP-N1載體中，構(gòu)建pEGFP-N1-STING重組質(zhì)粒。

1.3 STING抑制表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

參考shRNA設(shè)計(jì)原則[21]，使用Oligoengine Workstation 2.0設(shè)計(jì)2條特異性靶向STING基因的shRNA，分別命名為shRNA-ST-1和shRNA-ST-2，同時(shí)設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照序列即shRNA-ST-0，并用BLAST驗(yàn)證其特異性。寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

表1 shRNA-STING寡核苷酸序列

合成的2對(duì)shRNA和1對(duì)陰性對(duì)照shRNA單鏈模板用超純水稀釋為2 mg·L-1，shRNA上下游引物各取1 μL與48 μL的退火緩沖液(100 mmol·L-1乙酸鈉，30 mmol·L-1HEPES-KOH pH7.4，2 mmol·L-1乙酸鎂)混合，退火條件為90 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，冷卻至10 ℃，用BglⅡ和Hind Ⅲ酶切pSuper.Retro.Neo+GFP質(zhì)粒并膠回收，然后將退火產(chǎn)物與膠回收產(chǎn)物連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒用BglⅡ和Hind Ⅲ酶切鑒定，然后將陽(yáng)性質(zhì)粒送公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IL-1β、IFN-β、IFN-α、RIG-1、DDX41、IFI16和TNF-α的轉(zhuǎn)錄情況，引物序列見(jiàn)表2。mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量采用2-ΔΔct方法計(jì)算，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照基因。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

OFTu細(xì)胞的培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[22]進(jìn)行。將OFTu以2×105～3×105個(gè)·孔-1接種于6孔板，細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)使用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過(guò)表達(dá)組，使用2.5 μg pEGFP-N1-STING質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對(duì)照；干擾表達(dá)組，使用2.5 μg shRNA-ST-1、shRNA-ST-2和shRNA-ST-0進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基，24 h時(shí)觀(guān)察熒光強(qiáng)度。

1.6 Western blot蛋白檢測(cè)

將細(xì)胞樣本經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫孵育1.5 h，TBST洗滌硝酸纖維膜3次后，加入STING一抗(1∶500)，β-actin一抗(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，洗滌后置于Tanon-5200化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行曝光。以β-actin蛋白為內(nèi)參，使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

表2 用于實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物

1.7 不同STING表達(dá)狀態(tài)的OFTu細(xì)胞病毒滴度的測(cè)定

將OFTu接種于含10%胎牛血清MEM的6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒(2.5 μg·孔-1)。為了評(píng)估ORFV在具有STING過(guò)量表達(dá)或干擾表達(dá)的細(xì)胞模型中的復(fù)制情況，將pEGFP-N1-STING和pEGFP-N1或shRNA-ST-1、shRNA-ST-2和shRNA-ST-0轉(zhuǎn)染的OFTu細(xì)胞用ORFV感染(MOI=1)。分別在感染后6、12、24、36、48、72 h收集病毒上清液和細(xì)胞樣品，使用Reed-Muench方法檢測(cè)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒上清液的TCID50。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 ORFV感染OFTu細(xì)胞對(duì)STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄的影響

ORFV(MOI=1)感染OFTu細(xì)胞后，real-time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示：這些基因的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)出不同程度的升高。STING、cGAS、TBK1、IL-6的轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞被感染后24、36和48 h顯著上升(P<0.01或P<0.05)，而IRF3、IRF7、IFN-β、IL-1β和TNF-α在病毒感染細(xì)胞后36和48 h顯著上升(P<0.01或P<0.05，圖1)。

a. STING; b. cGAS; c. TBK1; d. IRF3; e. IRF7; f. IL-6; g. IFN-β; h. IL-1β; i. TNF-α圖1 ORFV感染OFTu細(xì)胞后相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄Fig.1 Gene transcription of related genes in OFTu cells infected with ORFV

2.2 OFTu細(xì)胞過(guò)表達(dá)STING對(duì)RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β基因轉(zhuǎn)錄的影響

將pEGFP-N1-STING質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至OFTu細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，pEGFP-N1-STING組的STING蛋白水平顯著高于pEGFP-N1對(duì)照組(圖2a)，過(guò)表達(dá)率為225%(圖2b)。STING的過(guò)表達(dá)使RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄顯著升高(P<0.01)(圖2c)。與轉(zhuǎn)染空載體組相比，TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平升高了54.6倍(P<0.01)，IFN-β升高43.5倍(P<0.01)，IFN-α升高41.7倍(P<0.01)，IL-6升高33倍(P<0.01)，IRF7升高29.2倍(P<0.01)，IRF3增加23.5倍(P<0.01)，RIG-1增加6.7倍(P<0.01)，IFI16增加4.9倍(P<0.01)，而DDX41增加4.3倍(P<0.01)。

2.3 ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞對(duì)TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄以及ORFV增殖的影響

ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的細(xì)胞后，TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比變化明顯。TBK1在6 h時(shí)顯著下降(P<0.01)，但在48 h時(shí)顯著增加(P<0.01)；IRF3在12、24和48 h時(shí)顯著增加；IFN-β在6 h時(shí)顯著增加(P<0.01)，而在12 h后顯著降低(P<0.05)；TNF-α在6 h時(shí)顯著升高(P<0.01)， 而在12 h時(shí)顯著降低(P<0.01)，并在12 h后顯示出增加的趨勢(shì)，在48 h時(shí)顯著增加(P<0.01) (圖2 d～g)。ORFV感染過(guò)表達(dá)STING細(xì)胞后，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上，過(guò)表達(dá)STING組的ORFV 滴度均低于陰性對(duì)照組的滴度，尤其是在48 h (P<0.05)和72 h(P<0.01)(圖2h)。

a. Western blot檢測(cè)OFTu細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后STING蛋白表達(dá)水平；b. Image J分析STING蛋白過(guò)表達(dá)效率； c.OFTu細(xì)胞過(guò)表達(dá)STING后RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β的mRNA表達(dá)水平；d～g. ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞對(duì)TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響；h. ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞后病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn)a. The expression of STING protein was detected by Western blot in OFTu cells transfected with overexpressed plasmid; b. The overexpression efficiency of STING protein was analyzed by Image J; c. The mRNA expression levels of RIG-1, DDX41, IFI16, IRF3, IRF7, IL-6, TNF-α, IFN-α and IFN-β in OFTu cells after overexpression of STING; d-g. Effect of ORFV infection of overexpressing STING OFTu cells on mRNA expression of TBK1, IRF3, IFN-β and TNF-α; h. The growth curve of ORFV virus after infection with STING overexpressing OFTu cells圖2 ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞后增強(qiáng)了TBK-1、IRF3、IFN-β、TNF-α的表達(dá)并抑制ORFV的復(fù)制Fig.2 ORFV infection of the OFTu cell overexpressing STING enhanced the expression of TBK-1, IRF3, IFN-β and TNF-α and inhibited the replication of ORFV

2.4 ORFV感染干擾表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞對(duì)TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α基因轉(zhuǎn)錄以及ORFV增殖的影響

核苷酸測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒sh-RNA-ST-0、sh-RNA-ST-1和sh-RNA-ST-2已成功構(gòu)建(圖3a)。將重組質(zhì)粒shRNA-ST-0、shRNA-ST-1和shRNA-ST-2轉(zhuǎn)染到OFTu細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)STING蛋白，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA-ST-1和shRNA-ST-2組的STING蛋白水平均低于shRNA-ST-0對(duì)照組，說(shuō)明構(gòu)建的質(zhì)粒可以有效對(duì)STING蛋白表達(dá)進(jìn)行干擾(圖3b)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)shRNA-ST-1干擾了70%的蛋白表達(dá)，shRNA-ST-2則為40%(圖3c)，基于此，后續(xù)選擇shRNA-ST-1進(jìn)行試驗(yàn)。

在STING干擾表達(dá)的感染細(xì)胞中，TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的表達(dá)顯著降低(圖3 d～g)。TBK1、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄在6～48 h顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而IRF3在24～48 h時(shí)顯著降低(P<0.01)。ORFV感染干擾表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞后，在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，STING干擾組的ORFV的滴度均高于陰性對(duì)照組的滴度(圖3h)，但差異不顯著(P>0.05)。

a.重組干擾STING表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定,1、2、3、4泳道分別為pSUPER.retro.neo+GFP載體、shRNA-ST-0、shRNA-ST-1、shRNA-ST-2；b. Western blot檢測(cè)干擾STING表達(dá)后STING蛋白的表達(dá)水平；c. Image J分析STING蛋白干擾效率；d～g. ORFV感染干擾表達(dá)STING后的OFTu細(xì)胞對(duì)TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響；h. ORFV感染干擾STING的OFTu細(xì)胞后病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn)a. Identification of recombination interference STING expression plasmid with double enzyme digestion, Lanes 1, 2, 3 and 4 were pSUPER.retro.neo+GFP vector, shRNA-ST-0, shRNA-ST-1, shRNA-ST-2 respectively；b. STING protein expression level was detected by Western blot after interference with STING expression; c. The interference efficiency of STING protein was analyzed by Image J; d-g. Effects of interfering expression of STING OFTu cells infected with ORFV on mRNA expression of TBK1, IRF3, IFN-β and TNF-α; h. The growth curve of ORFV virus after infection with OFTu cells interfering with STING圖3 ORFV感染干擾表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞后下調(diào)了TBK-1、IRF3、IFN-β、TNF-α的表達(dá)并促進(jìn)ORFV的復(fù)制Fig.3 ORFV infection with the OFTu cells with interference expression of STING downregulated the expression of TBK-1, IRF3, IFN-β and TNF-α and promoted the replication of ORFV

3 討 論

宿主的天然免疫系統(tǒng)可以有效地識(shí)別侵入的病原體并啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)，進(jìn)而在病原清除和免疫中發(fā)揮重要作用。宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pathogen-recognition receptors, PRRs)激活宿主的天然免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)干擾素、抗病毒因子和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而限制病原的擴(kuò)散[2,23-28]。STING作為機(jī)體天然免疫信號(hào)通路中重要的核心蛋白，在防御病原體入侵、介導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，但STING在ORFV感染中的作用仍然不清楚。

本研究通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞感染模型，分析了ORFV感染細(xì)胞后對(duì)STING及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，探索了STING基因在干擾表達(dá)和過(guò)表達(dá)狀態(tài)下對(duì)ORFV在細(xì)胞上增殖的影響。結(jié)果顯示，ORFV感染OFTu細(xì)胞后顯著增加了STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，這與HBV感染Li23細(xì)胞、HSV-1感染小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)STING及相關(guān)基因表達(dá)顯著上升相一致[5, 7-8 ]。TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α是cGSA-STING信號(hào)通路中的重要表達(dá)因子，ORFV感染過(guò)表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞后可以顯著增加TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，ORFV感染干擾表達(dá)STING的OFTu細(xì)胞可以顯著減少TBK1、IRF3、IFN-β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，這與之前研究HIV感染干擾表達(dá)STING蛋白的THP-1細(xì)胞可以抑制TBK-1-IRF3通路的結(jié)果相一致[11]。OFTu細(xì)胞在STING過(guò)表達(dá)狀態(tài)下感染ORFV，可以顯著抑制ORFV的復(fù)制，這與以前研究STING的過(guò)表達(dá)可以有效抑制巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中乙型肝炎病毒復(fù)制的報(bào)道相一致[29]。同時(shí)，在STING干擾表達(dá)狀態(tài)下感染ORFV，則有助于病毒的復(fù)制，這也與敲除STING后則有助于人類(lèi)巨細(xì)胞病毒[30]、單純皰疹病毒1[31]和乳頭瘤病毒[32]的增殖報(bào)道相一致。

4 結(jié) 論

STING通過(guò)上調(diào)OFTu細(xì)胞抗病毒因子的表達(dá)抑制了羊口瘡病毒的增殖，這進(jìn)一步豐富了STING蛋白的抗病毒譜，也為深入探究STING蛋白在ORFV感染和復(fù)制中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。