魏雅靜

阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新推廣中心（阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院）（阜新 123000）

近年來，隨著人們生活水平的提高，對食物的營養(yǎng)品質(zhì)也越來越關(guān)注。一般可通過對食物中蛋白質(zhì)的含量、蛋白質(zhì)中各成分的含量及比例以及組成蛋白質(zhì)的氨基酸含量和氨基酸組成三部分的綜合評定來評價食物的營養(yǎng)品質(zhì)。而必需氨基酸的含量是決定食物營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

目前，國內(nèi)外對榛子的研究主要集中在榛子油的提取方法[1-2]、榛子油脂成分分析[3]、榛子殼[4]以及榛子過敏原[5]等方面，榛子蛋白質(zhì)資源、產(chǎn)品加工等研究的深度不夠，這就會對榛子蛋白的深度應(yīng)用開發(fā)產(chǎn)生一定的局限性。我們需要加深對榛子蛋白質(zhì)的研究，為榛子蛋白進一步開發(fā)利用提供技術(shù)和理論支持。

平歐榛子分別以我國野生平榛和歐洲榛為母本、父本，通過種間遠源雜交產(chǎn)生的集具平榛與歐洲榛優(yōu)良特性的新種[6]。平歐榛子蛋白含有人體所需的各種必需氨基酸，屬于完全蛋白質(zhì)，其營養(yǎng)價值高且易于人體吸收。因此，可對平歐榛子的蛋白粉和氨基酸產(chǎn)品進行開發(fā)利用，以滿足特定人群對高品質(zhì)蛋白或氨基酸的需要，與此同時也可能成為蛋白質(zhì)的重要來源。

1 試驗材料與方法

1.1 主要材料和試劑

平歐榛子（本溪縣三陽大果榛子專業(yè)生產(chǎn)合作社）。木瓜蛋白酶、巰基乙酸鈉、色氨酸（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙醇、硫酸銨、冰醋酸（分析純，購于國藥集團）。平歐榛子脫脂粉：榛子去殼、去皮，烘干、粉碎、過篩、脫脂、分裝，在-20 ℃冰箱中備用。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FD-IC-80真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；TDL-40B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；L-8800全自動氨基酸分析儀（日立公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 榛子蛋白分離方法

采用堿溶酸沉法制備榛子分離蛋白[7-8]：將脫脂榛子粉與去離子水以一定比例混合均勻，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，在恒溫振蕩水浴中浸提一段時間，以5 000 r/min離心20 min，收集上清液，用1 mol/L的HCl調(diào)至等電點，以5 000 r/min離心20 min，棄上清液，冷凍干燥得榛子分離蛋白。

參照Osborne蛋白分級法[9]，分級提取制備榛子的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白，計算各蛋白所占的相對百分比。

清蛋白：取100 g脫脂榛子粉與去離子水（1∶15 g/mL）混合均勻，室溫下攪拌提取1 h，以10 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照上述步驟將沉淀重復(fù)提取一次，兩次上清液合并后濃縮，4 ℃透析48 h，其間換水5次，然后冷凍干燥得清蛋白。

球蛋白：將提取清蛋白后的沉淀與0.2 mol/L的NaCl（1∶15 g/mL）混合均勻，室溫下攪拌提取1 h，以10 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照上述步驟將沉淀重復(fù)提取一次，兩次上清液合并后濃縮，于4 ℃透析48 h，其間換水5次，然后冷凍干燥得球蛋白。

醇溶蛋白：將提取球蛋白后的沉淀與75%的乙醇溶液（1∶15 g/mL）混合均勻，室溫下攪拌提取1 h，以10 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照上述步驟將沉淀重復(fù)提取一次，兩次上清液合并后濃縮，4 ℃透析48 h，其間換水5次，然后冷凍干燥得醇溶蛋白。

谷蛋白：將提取醇溶蛋白后的沉淀與0.012 5 mol/L的NaOH溶液（1∶15 g/mL）混合均勻，室溫下攪拌提取1 h，以10 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照上述步驟將沉淀重復(fù)提取一次，兩次上清液合并后加入三氯乙酸使蛋白質(zhì)沉淀，以10 000 r/min離心10 min，冷丙酮洗滌沉淀3次，于4 ℃透析48 h，其間換水5次，然后冷凍干燥得谷蛋白。

1.3.2 平歐榛子蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成分析

參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》標(biāo)準(zhǔn)檢測。

酸水解法處理樣品[10-11]：取20～30 mg的蛋白樣品、10 mL 6 mol/L HCl溶液、一滴正辛醇于水解管中，水解管抽真空脫氣后氮氣封管，于110 ℃水解24 h，用濾紙反復(fù)過濾水解液，水沖洗水解管，合并之前的濾液，定容到50 mL，吸取2 mL溶液在水浴鍋上蒸干，2 mL水溶解殘留物，再蒸干，重復(fù)3次，之后用2.5 mL 0.02 mol/L的HCl溶液溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，空氣中放置30 min后裝瓶備用。利用全自動氨基酸分析儀對平歐榛子蛋白組分進行測定（色氨酸除外）。

全自動氨基酸分析儀色譜條件：分析柱溫57 ℃；反應(yīng)柱溫135 ℃，蛋白質(zhì)水解液流速0.4 mL/min，泵一；茚三酮和茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min，泵二；進樣量20 μg，檢測波長：其他氨基酸570 nm，谷氨酸440 nm。

色氨酸測定采用熒光法[12]，稱取含10 mg蛋白質(zhì)的樣品，加入5 mL木瓜蛋白酶，在37 ℃振蕩，堿水解24 h后離心取上清液待測。吸取2 mL熒光空白液放入石英池中，調(diào)節(jié)熒光分光計，激發(fā)波長288 nm，發(fā)射波長348 nm，熒光調(diào)數(shù)為0，向石英比色皿中添加100 μL樣品制備液，充分混勻，讀出熒光值A(chǔ)1，再添加10 μL質(zhì)量濃度為0.08 μg/μL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液充分混勻，讀熒光值A(chǔ)2。按式（1）計算：

式中：W為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.3 平歐榛子蛋白質(zhì)組分的營養(yǎng)指標(biāo)估算

參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）于1973年提出的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜，根據(jù)氨基酸分析結(jié)果計算平歐榛子蛋白及其組分的營養(yǎng)價值指標(biāo)[13-14]。

（1）必需氨基酸與總氨基酸之比，即E/T（%）。

（2）氨基酸評分（AAS）按式（2）計算。

（3）預(yù)測蛋白質(zhì)的功效比值（PER）[15]，按式（3）～（5）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子蛋白質(zhì)組分的分級制備

由圖1可知，清蛋白占榛子蛋白比值最大，為67.18%，球蛋白占17.62%，谷蛋白占6.53%，最低的是醇溶蛋白，僅為3.17%。因為榛子蛋白具有豐富的水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白，所以榛子蛋白具有較好的溶解性[16]。

圖1 榛子蛋白質(zhì)組分的構(gòu)成及含量

2.2 平歐榛子蛋白及其組分的氨基酸組成分析

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論認為，蛋白質(zhì)中氨基酸組成與蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值密切相關(guān)，食物蛋白質(zhì)中氨基酸組成越接近人體蛋白質(zhì)的組成，越容易被人體消化吸收，其營養(yǎng)價值才越高[17]。平歐榛子蛋白及其組分的氨基酸分析見表1和圖2～圖6。

圖2 平歐榛子分離蛋白氨基酸分析

圖6 平歐榛子谷蛋白氨基酸分析

統(tǒng)計分析平歐榛子分離蛋白和四種蛋白組分的不同氨基酸含量，結(jié)果如表1所示。分離蛋白和四種蛋白組分均含有18種氨基酸，其中包括9種必須氨基酸和9種非必須氨基酸。榛子分離蛋白中的賴氨酸（Lys），清蛋白中賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu），球蛋白中亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val），醇溶蛋白中的蘇氨酸蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸Val）、賴氨酸（Lys），谷蛋白中賴氨酸（Lys）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）含量低于FAO/WHO的小孩需要量，但高于FAO/WHO的成人需要量。

表1 平歐榛子蛋白及其組分的氨基酸分析 單位：%

與FAO/WHO推薦的氨基酸模式相比，平歐榛子分離蛋白和四種蛋白組分必需氨基酸中芳香族氨基酸（Tyr+Phe）含量高于FAO/WHO的小孩需要量和成人需要量。在非必需氨基酸中，榛子分離蛋白及其他四種蛋白質(zhì)組分的精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）及谷氨酸（Glu）含量較高，食物中含有豐富的谷氨酸能提高免疫細胞的免疫功能和運動能力[18]，谷氨酸還能夠參與學(xué)習(xí)記憶過程從而促進小孩的大腦發(fā)育，興奮大多數(shù)區(qū)域的神經(jīng)元，調(diào)節(jié)細胞骨架的形成及功能[19]。食物中含有豐富的精氨酸對預(yù)防心臟病有一定的效果，天冬氨酸能夠保護心臟和肝臟，還對消除疲勞有幫助[20]。平歐榛子分離蛋白中谷氨酸（Glu）含量最高，其次是精氨酸（Arg）和天冬氨酸（Asp），分別為23.37%，14.20%和11.04%。平歐榛子清蛋白和球蛋白中谷氨酸（Glu）含量最高，其次是精氨酸（Arg）和天冬氨酸（Asp），醇溶蛋白和谷蛋白中谷氨酸（Glu）含量最高，其次是天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）。

圖3 平歐榛子清蛋白氨基酸分析

圖4 平歐榛子球蛋白氨基酸分析

圖5 平歐榛子醇溶蛋白氨基酸分析

根據(jù)蛋白質(zhì)中氨基酸的疏水性及酸堿性對平歐榛子分離蛋白和其他蛋白組分中的氨基酸進行了分類，表2可以看出平歐榛子蛋白及其組分的氨基酸以疏水性氨基酸和酸性氨基酸為主，氨基酸的這種組成模式會略微影響平歐榛子蛋白質(zhì)的溶解性，蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)中占的比重大，蛋白質(zhì)具有較好的抗氧化活性[21]。平歐榛子分離蛋白的堿性氨基酸的含量低于其他蛋白組分，不帶電極性氨基酸含量略低于平歐榛子清蛋白、球蛋白，酸性氨基酸含量略低于醇溶蛋白、谷蛋白。

表2 平歐榛子蛋白及其組分的氨基酸種類分布單位：%

2.3 平歐榛子蛋白及其組分的營養(yǎng)價值評價

由表3可知，平歐榛子分離蛋白的E/T（32.55%）最高，其次是清蛋白（30.99%）、球蛋白（30.15%）、谷蛋白（29.04%），醇溶蛋白的E/T值（26.20%）含量最低，平歐榛子分離蛋白的E/T值略低于WHO衡量理想蛋白資源的需要量（36%），氨基酸評分中賴氨酸的評分最低（72.18）為平歐榛子分離蛋白的第一限制氨基酸，其氨基酸評分大于四種平歐榛子蛋白組分。平歐榛子分離蛋白的PER值也是最高的，其次是清蛋白、谷蛋白、球蛋白，醇溶蛋白的PER值最低。優(yōu)質(zhì)蛋白的PER衡量標(biāo)準(zhǔn)值為2.00，平歐榛子的分離蛋白、清蛋白、谷蛋白的PER微高于標(biāo)準(zhǔn)值，因此是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。

表3 平歐榛子蛋白及其組分的營養(yǎng)價值分析

3 結(jié)論

研究對平歐榛子蛋白質(zhì)組分進行了分級制備得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別占榛子粗蛋白的67.18%，17.62%，3.17%和6.53%。平歐榛子分離蛋白及四種蛋白組分均含有18種氨基酸，并且組成比較接近FAO/WHO推薦的氨基酸模式，必需氨基酸中芳香族氨基酸（Tyr+Phe）含量最高，非必需氨基酸中谷氨酸（Glu）最高，精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）含量也十分豐富。賴氨酸和亮氨酸分別為他們的第一限制氨基酸。平歐榛子分離蛋白E/T值比較接近WHO需要量，其具有較高的氨基酸評分和PER值，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，可以作為良好的蛋白補充劑進行深度開發(fā)和利用。