曲紅盼 郝晴 韓雅蕾 劉蕾 成志偉

摘要：以烏拉爾甘草毛狀根為材料、總黃酮含量為指標(biāo)，采用超聲法提取，分別以提取溶劑、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為單因素，確定影響提取率的因素與水平，通過(guò)正交法優(yōu)化，確定提取工藝的最佳條件。采用比色法測(cè)定比較3種甘草毛狀根中總黃酮的含量，通過(guò)高效液相色譜法分析比較3種甘草毛狀根中甘草苷、異甘草苷和光甘草定的含量。通過(guò)紅細(xì)胞溶血和雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)、DPPH自由基與ABTS自由基清除試驗(yàn)和酪氨酸酶酶活抑制試驗(yàn)，分別比較3種甘草（烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草）毛狀根提取液的刺激性、體外抗氧化和抑制酪氨酸酶酶活的能力。結(jié)果表明，在溶劑為75%丙二醇、料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間40 min條件下，烏拉爾甘草毛狀根總黃酮提取率最高，為1.25%。在3種甘草毛狀根中，烏拉爾甘草毛狀根中異甘草苷的含量最高，光果甘草毛狀根中總黃酮、甘草苷和光甘草定的含量均最高;3種甘草毛狀根提取液（濃度≤625 mg/L）對(duì)紅細(xì)胞及雞胚絨毛尿囊膜均無(wú)刺激性;3種甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）依次為1 100、570、540 mg/L，清除ABTS自由基的IC50依次為740、230、590 mg/L;3種甘草毛狀根提取液（濃度為625 mg/L）對(duì)酪氨酸酶活性抑制率依次為（49.5±2.3）%、（76.6±3.5）%、（17.95±4.5）%。在3種甘草毛狀根中提取液光果甘草的抗氧化及美白護(hù)膚活性最好。

關(guān)鍵詞：甘草;毛狀根;總黃酮;刺激性;抗氧化;酪氨酸酶

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）04-0155-08

收稿日期：2021-10-07

基金項(xiàng)目：北京市教育委員會(huì)科技面上項(xiàng)目（編號(hào)：SQKM201710011010）。

作者簡(jiǎn)介：曲紅盼（1994—），女，河北武邑人，碩士研究生，主要從事甘草中次生代謝物的合成機(jī)制研究。E-mail：13146918700@163.com。

通信作者：成志偉，博士，副教授，主要從事植物次生代謝物的合成機(jī)制研究。E-mail：chengzhiwei@btbu.edu.cn。

甘草是豆科甘草屬多年生草本植物，收錄于2020年版《中國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《藥典》）的有3個(gè)品種：烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草[1]。甘草中的活性成分主要有黃酮類、三萜類及多酚類等化合物[2]，它們被廣泛應(yīng)用在工業(yè)產(chǎn)品中。在醫(yī)藥領(lǐng)域，甘草苷具有抗抑郁和降血糖等作用[3]，異甘草苷具有促進(jìn)血管生成的作用[4]，光甘草定具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[5]等;在煙草行業(yè)中，甘草根提取液可改善煙草的吸味與口感[6-7];在日化領(lǐng)域，甘草提取液及其化合物（光甘草定、甘草酸二鉀和甘草亭酸等）[8]具有抑制酪氨酸酶活性[9]、抗菌[10]、抗炎[11]和抗氧化[11]等功效。隨著工業(yè)（醫(yī)藥、食品和日化）生產(chǎn)對(duì)甘草原料需求的增長(zhǎng)，野生甘草的過(guò)度采挖及其生長(zhǎng)環(huán)境的惡化，導(dǎo)致野生甘草資源日漸枯竭，已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)瀕危珍稀物種（http：//www.iplant.cn/rep/protlist）。通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甘草產(chǎn)生毛狀根[12]是一種解決工業(yè)生產(chǎn)對(duì)甘草資源需求的有效途徑。

目前，對(duì)甘草毛狀根的研究主要集中在比較其與甘草藥材[13-15]中次生代謝物[12，16-17]含量差異等。但是，系統(tǒng)性地比較3種不同品種甘草（烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草）毛狀根的成分差異，以及甘草毛狀根提取液對(duì)皮膚的潛在護(hù)膚活性還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)超聲法提取甘草毛狀根中總黃酮條件進(jìn)行優(yōu)化，比較3種甘草毛狀根提取液中總黃酮及黃酮類化合物（甘草苷、異甘草苷和光甘草定）的含量差異，并對(duì)甘草毛狀根提取液的刺激性、抗氧化和抑制酪氨酶酶活能力進(jìn)行比較，以期為甘草毛狀根將來(lái)作為原料在工業(yè)產(chǎn)品中的運(yùn)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

甘草毛狀根材料由筆者所在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)構(gòu)建，材料的誘導(dǎo)和品種背景鑒定參考Khazaei等的方法[18-19]。液態(tài)條件下培養(yǎng)收獲的甘草毛狀根材料經(jīng)真空冷凍干燥后，研磨成粉，100目過(guò)篩備用。

烏拉爾甘草與光果甘草藥材購(gòu)置于河北省安國(guó)中藥材專業(yè)市場(chǎng)，甘草品種背景鑒定參考楊瑞等的方法[19]，甘草藥材研磨成粉，100目過(guò)篩備用。

甘草苷、異甘草苷、光甘草定，色譜純，上海源葉生物科技有限公司;乙腈，色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);蕓香苷、2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦肼基自由基（DPPH自由基）、維生素C，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn);亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉，分析純，北京化工廠生產(chǎn);丙二醇、過(guò)硫酸鉀，分析純，上海麥克林生化科技有限公司;奎諾二甲基丙烯酸酯（trolox）、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酪氨酸酶、L-酪氨酸，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)。

U3000高效液相色譜，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司生產(chǎn);Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司;CK2000高通量組織研磨儀，北京托摩根生物科技有限公司生產(chǎn);LGJ-18型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司生產(chǎn);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司生產(chǎn);QB-206 多用途旋轉(zhuǎn)搖床，其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn);Centrifuge 5424R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

2020年5月至2021年9月，于北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.1 超聲法提取率的影響因素及其水平的確定

取1 g烏拉爾甘草毛狀根粉末，在不同提取溶劑、料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間下進(jìn)行提取，10 000 g離心10 min，取上清溶液用于總黃酮提取率的測(cè)定。根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，用正交試驗(yàn)對(duì)其工藝參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以明確該提取方法的最佳技術(shù)參數(shù)。

1.2.2 成分測(cè)定

1.2.2.1 總黃酮含量的測(cè)定 采用Al（NO3）3-NaNO2法[20]測(cè)定甘草毛狀根總黃酮含量。精確量取0、25、50、100、150、200 μL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于2 mL 離心管，加入5% NaNO2溶液 50 μL，混勻后靜置6 min;加入10% Al（NO3）3溶液 50 μL，混勻后靜置6 min;加入5% NaOH溶液 500 μL，混勻后靜置15 min;反應(yīng)體系終體積用75%乙醇溶液定容至1 mL。在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蕓香苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取3種甘草毛狀根提取液，按照上述步驟操作，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程為：y=0.007 6x+0.037 3，r2=0.998 9，表明線性關(guān)系良好，線性范圍25～200 mg/L）分別計(jì)算出3種甘草毛狀根提取液中的總黃酮含量。

1.2.2.2 甘草苷、異甘草苷和光甘草定含量的測(cè)定 甘草苷、異甘草苷和光甘草定的HPLC檢測(cè)條件參考周逸芝等的方法[21]。色譜柱：Thermo Hypersil-Keystone C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈（M）-0.05%磷酸溶液（N），流動(dòng)相比例0～15 min，20%～25% M;15～30 min，25%～40% M;30～40 min，40%～60% M;40～41 min，65%～95% M;檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（甘草苷回歸方程為：y=1.914 4x+4.932 9，r2=0.999 8，表明線性關(guān)系良好，線性范圍 2～20 mg/L;異甘草苷回歸方程為：y=1.004 9x-0.140 4，r2=0.999 7，表明線性關(guān)系良好，線性范圍1～12 mg/L;光甘草定回歸方程為：y=0.351 5x-0.137 5，r2=0.998 7，表明線性關(guān)系良好，線性范圍3～50 mg/L;）分別計(jì)算出3種甘草毛狀根提取液中的甘草苷、異甘草苷和光甘草定含量。

1.2.3 刺激性評(píng)價(jià)

1.2.3.1 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn) 紅細(xì)胞（RBC）溶血試驗(yàn)可替代德萊塞測(cè)試（Draize test）眼刺激性試驗(yàn)，用于檢測(cè)化妝品原料的眼刺激性[22]。檢測(cè)RBC的完整性樣品a1：用PBS（pH值=7.4）配制系列梯度的SDS溶液（0～80 mg/L）;檢測(cè)對(duì)RBC刺激性的樣品a2：用PBS（pH值=7.4）將待測(cè)樣品（75%丙二醇和甘草毛狀根提取液）稀釋系列濃度;陽(yáng)性對(duì)照樣品b：蒸餾水（溶血率100%）;陰性對(duì)照樣品c：PBS（溶血率為0）。取上述樣品溶液750 μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液250 μL混勻，150 r/min搖床孵育1 h。在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定溶液吸光度Da1、Da2、Db和Dc，紅細(xì)胞溶血率計(jì)算公式如下[23]：

溶血率=（Dai-Db）/（Db-Dc）×100%（i=）。（1）

1.2.3.2 雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn) 參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT 2329—2009《化妝品眼刺激性 腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)》[24]，采用反應(yīng)時(shí)間法進(jìn)行試驗(yàn)：隨機(jī)選取5枚雞胚，依次將300 μL的3種甘草毛狀根提取液、0.9%氯化鈉溶液（陰性對(duì)照）和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（陽(yáng)性對(duì)照）滴加到雞胚絨毛尿囊膜表面，反應(yīng)5 min，評(píng)估樣品刺激性。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用刺激評(píng)分（IS）法：sH（出血時(shí)間）即尿囊膜上觀察到開(kāi)始發(fā)生出血的時(shí)間，s;sL（血管融解時(shí)間）即尿囊膜上觀察到開(kāi)始發(fā)生血管融解的時(shí)間，s;sC（凝血時(shí)間）即尿囊膜上觀察到開(kāi)始發(fā)生凝血的時(shí)間，s。刺激評(píng)分公式如下：

IS=[（301-sH）×5+（301-sL）×7+（301-sC）×9]/300。（2）

1.2.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)試 樣品組A1：取500 μL甘草毛狀根提取液與500 μL DPPH無(wú)水乙醇溶液（2×10-4 mol/L）混合均勻;陰性對(duì)照A2：取500 μL的75%丙二醇與DPPH溶液混合均勻;樣品對(duì)照A3：取500 μL甘草毛狀根提取液與無(wú)水乙醇混合均勻。A1、A2和A3室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度D1、D2和D3[25]。對(duì)DPPH自由基的清除率的計(jì)算公式如下：

清除率=（D2+D3-D1）/A2 ×100%。（3）

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測(cè)試 量取ABTS儲(chǔ)備液（7.4 mmol/L）與K2S2O8儲(chǔ)備液（2.6 mmol/L）各3 mL，混合，避光靜置12 h，作為母液備用。用無(wú)水乙醇將母液稀釋，使其在波長(zhǎng)734 nm下的吸光度值在0.7±0.02范圍內(nèi)，即為ABTS自由基工作液。樣品組A4：取0.8 mL的ABTS自由基工作液和 0.2 mL 的甘草毛狀根提取液，混合均勻;陽(yáng)性組A5：取 0.8 mL 的ABTS自由基工作液和0.2 mL的Trolox，混合均勻;空白組A0：取0.8 mL的ABTS自由基工作液和0.2 mL的無(wú)水乙醇，混合均勻。上述各組溶液室溫靜置10 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值D4、D5和D0[26]。對(duì)ABTS自由基的清除率計(jì)算公式如下：

清除率=（D0-Di）/D0 ×100%（i=4，5）。（4）

1.2.5 美白功效評(píng)價(jià)

1.2.5.1 體外抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn) 參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)T/SHRH 015—2018《化妝品-酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)方法》[27]，對(duì)3種甘草毛狀根提取液的酪氨酶活性抑制率進(jìn)行測(cè)定。采用固定反應(yīng)時(shí)間法，按表1在10 mL離心管中依次加入L-酪氨酸（0.05%）、提取液和PBS緩沖液（pH值6.8），37 ℃孵育10 min;再依次加入酪氨酸酶（200 U/mL），混勻，37 ℃孵育30 min，在475 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[28]。酪氨酸酶活性抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率=[1-（DC-DD）/（DA-DB）]×100%。（5）

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲法提取率的影響因素及其水平的確定

選用研磨好的烏拉爾甘草毛狀根作為材料，確定超聲法中溶劑、料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間各因素對(duì)總黃酮的提取率影響水平，優(yōu)化總黃酮的提取條件。

2.1.1 溶劑對(duì)提取率的影響 提取溶劑對(duì)烏拉爾毛狀根中總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1-A。在料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間 30 min 的條件下，不同溶劑對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率差異顯著（P<0.05），從高到低依次為75%丙二醇>75%丁二醇>75%乙醇>水。因此，選擇75%丁二醇、75%乙醇和75%丙二醇3種溶劑用于后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間30 min的條件下，不同料液比對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-B）差異顯著（P<0.05），隨著溶劑的增加，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1 g ∶15 mL時(shí)，總黃酮提取率最高，為0.794%。因此，選擇1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL和 1 g ∶20 mL等3個(gè)料液比進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、料液比1 g ∶15 mL、超聲時(shí)間30 min的條件下，不同超聲溫度對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-C）差異顯著（P<0.05），隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮提取率最高，為0.905%。因此，選擇40、50、60 ℃等3個(gè)不同溫度進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃的條件下，不同超聲時(shí)間對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-D）差異顯著（P<0.05），隨著超聲時(shí)間的增加，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮提取率最高，為0.785%。因此，選擇20、30、40 min等3個(gè)超聲時(shí)間進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.5 正交優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，因素A（提取溶劑）、B（料液比）、C（超聲溫度）、D（超聲時(shí)間）均會(huì)影響烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率，所以選擇以上4種因素進(jìn)行正交試驗(yàn)（表2），試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。不同因素對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)镃>D>B>A，即對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率影響最大的因素為超聲溫度，其次是超聲時(shí)間、料液比和提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，對(duì)同一因素的3個(gè)水平進(jìn)行比較，對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的影響依次為A2>A1>A3、B2>B3>B1、C2>C3>C1、D3>D2>D1。綜上所述，對(duì)烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的最佳水平組合為A2B2C2D3，即在超聲提取中，溶劑為75%丙二醇，料液比1 g ∶15 mL，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min。

按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，烏拉爾甘草毛狀根總黃酮提取率為1.25%，高于正交試驗(yàn)中的9個(gè)組合試驗(yàn)結(jié)果，表明試驗(yàn)方案可行。

2.2 3種甘草毛狀根中成分含量的比較

2.2.1 總黃酮含量比較 按照“2.1.5”節(jié)正交優(yōu)化條件，分別對(duì)3種甘草毛狀根中的總黃酮進(jìn)行提取，比較提取液中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。烏拉爾甘草（簡(jiǎn)稱“烏拉爾”）、光果甘草（簡(jiǎn)稱“光果”）和脹果甘草（簡(jiǎn)稱“脹果”）3種甘草毛狀根中的總黃酮含量依次為（12.48±1.26）、（42.03±1.47）、（30.32±1.67） mg/g。總黃酮在3種甘草毛狀根中的含量存在顯著差異（P<0.05），其中光果中的總黃酮含量最高，分別比烏拉爾和脹果中的總黃酮含量高236.78%、38.62%。表明3種甘草毛狀根中總黃酮含量從高到低依次為光果>脹果>烏拉爾。

2.2.2 甘草苷、異甘草苷和光甘草定黃酮類成分含量比較 在比較甘草毛狀根總黃酮含量的基礎(chǔ)上，選取了具有代表性的甘草黃酮類成分進(jìn)行比較，其中甘草苷[29]和異甘草苷[30]具有良好的抗氧化活性，光甘草定具有抑制酪氨酸酶活性調(diào)控黑色素生成的活性[31]。

采用HPLC分別測(cè)定它們?cè)?種甘草毛狀根提取液中的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，甘草苷在3種甘草毛狀根中含量依次為（5.57±1.96）、（5.92±1.77）、（0.89±0.10） mg/g，其在3種甘草毛狀根中的含量存在顯著差異（P<0.05），光果中的甘草苷含量最高，分別比烏拉爾、脹果中甘草苷含量高6.28%、565.17%。異甘草苷在3個(gè)甘草毛狀根中含量依次為（3.8±0.07）、（0.71±0.09）、（0.73±0.03） mg/g，烏拉爾中的異甘草苷顯著高于其他甘草毛狀根，分別比光果、脹果中的異甘草苷含量高435.21%、420.55%。光甘草定在3種甘草毛狀根中含量依次為（0.49±0.02） mg/g、（13.71±0.86） mg/g、N.D.（未檢出），光甘草定在3種甘草毛狀根中的含量差異顯著（P<0.05），光果中的光甘草定含量最高，比烏拉爾中的光甘草定含量高 2 697.95%，脹果中光甘草定含量低于儀器檢出量。

表明3種甘草毛狀根中甘草苷含量依次表現(xiàn)為光果≈烏拉爾>脹果;異甘草苷含量依次表現(xiàn)為烏拉爾>光果≈脹果;光甘草定含量依次表現(xiàn)為光果>烏拉爾>脹果。

2.3 甘草毛狀根的刺激性

2.3.1 甘草毛狀根提取液對(duì)紅細(xì)胞的溶血率 首先采用紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)測(cè)定提取溶劑丙二醇的安全濃度，當(dāng)丙二醇終濃度≤15%時(shí)，紅細(xì)胞溶血率低于5%，無(wú)刺激性（圖4）。因此，對(duì)甘草毛狀根提取液進(jìn)行稀釋，即將甘草毛狀根提取液稀釋后使丙二醇的終濃度≤15%。

分別對(duì)濃度為2 000 mg/L（丙二醇濃度為15%）、1 250 mg/L（丙二醇濃度為9.38%）、625 mg/L（丙二醇濃度為4.69%）的甘草毛狀根提取液進(jìn)行紅細(xì)胞溶血率測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)甘草毛狀根提取液濃度為2 000 mg/L時(shí)，烏拉爾、光果和脹果提取液對(duì)紅細(xì)胞的溶血率依次為（82.32±4.83）%、（90.49±2.43）%、（76.11±4.48）%，對(duì)紅細(xì)胞的溶血率均高于5%，有強(qiáng)刺激性;當(dāng)甘草毛狀根提取液濃度為1 250 mg/L時(shí)，烏拉爾、光果、脹果提取液對(duì)紅細(xì)胞的溶血率依次為（3.58±1.21）%、（6.24±0.86）%、（7.95±1.52）%，光果、脹果對(duì)紅細(xì)胞的溶血率均高于5%，有刺激性;當(dāng)甘草毛狀根提取液濃度為625 mg/L時(shí)，烏拉爾、光果、脹果提取液對(duì)紅細(xì)胞的溶血率依次為（2.19±1.05）%、（2.55±0.39）%、（3.95±1.19）%，對(duì)紅細(xì)胞的溶血率都低于5%，無(wú)刺激性。

2.3.2 甘草毛狀根提取液對(duì)雞胚絨毛尿囊膜的刺激性

在紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，評(píng)測(cè)甘草毛狀根提取液（濃度為625 mg/L）對(duì)雞胚絨毛尿囊膜的刺激性，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。供試溶液刺激雞胚尿囊膜血管5 min后，陽(yáng)性對(duì)照（0.1 mol/L氫氧化鈉）出現(xiàn)嚴(yán)重溶血、重度凝血及重度血管溶解現(xiàn)象;而供試樣品（濃度為625 mg/L的3種甘草毛狀根提取液）與陰性對(duì)照（0.9%氯化鈉溶液）均無(wú)出血、凝血和血管融解現(xiàn)象。根據(jù)刺激評(píng)分IS數(shù)值，IS<1為無(wú)刺激性，1≤IS<5為輕刺激性，5≤IS<9為中度刺激性，IS≥10為強(qiáng)刺激性。通過(guò)計(jì)算，IS計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5，陰性對(duì)照的IS為0，表現(xiàn)為無(wú)刺激性;陽(yáng)性對(duì)照的IS為18.59，表現(xiàn)為強(qiáng)刺激性，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期是可接受的。3種甘草毛狀根提取液的IS值均小于1，說(shuō)明濃度在625 mg/L，時(shí)甘草毛狀根提取液對(duì)雞胚絨毛尿囊膜均無(wú)刺激性。

2.4 甘草毛狀根提取液的抗氧化的能力

為了闡明甘草毛狀根提取液的抗氧化護(hù)膚功效，采用DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗(yàn)對(duì)3種甘草毛狀根提取液的抗氧化能力進(jìn)行體外評(píng)測(cè)。

2.4.1 甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的能力 3種甘草毛狀根提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力結(jié)果見(jiàn)圖6，烏拉爾、光果、脹果提取液清除DPPH自由基的IC50依次為1 100、570、540 mg/L，3種甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的能力具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為脹果>光果>烏拉爾。與同提取條件制備的烏拉爾甘草藥材提取液相比較，3種甘草毛狀根提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力均更強(qiáng)（IC50=1 310 mg/L）。

2.4.2 甘草毛狀根提取液清除ABTS自由基的能力 3種甘草毛狀根提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力結(jié)果見(jiàn)圖7，烏拉爾、光果、脹果提取液對(duì)清除ABTS自由基的IC50依次為740、230、590 mg/L，3種甘草毛狀根提取液對(duì)清除ABTS自由基的能力具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為光果>脹果>烏拉爾。與同提取條件制備的烏拉爾甘草藥材提取液相比較，3種甘草毛狀根提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力均更強(qiáng)（IC50=2 110 mg/L）。

2.5 甘草毛狀根提取液抑制酪氨酸酶的能力

根據(jù)“2.3”節(jié)篩選出的甘草毛狀根提取液安全濃度（625 mg/L）進(jìn)行抑制酪氨酸酶能力的測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。烏拉爾、光果和脹果3種甘草毛狀根提取液對(duì)酪氨酸酶活性抑制率依次為（49.5±2.3）%、（76.6±3.5）%、（17.95±4.5）%。3種甘草毛狀根提取液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為光果>烏拉爾>脹果。選用已有報(bào)道光甘草定含量最高的光果甘草藥材作為對(duì)照[32]，在相同提取條件下制備光果甘草藥材提取液，結(jié)果見(jiàn)圖8，光果提取液濃度為 625 mg/L 的抑制率為（76.6 ± 3.5）%對(duì)酪氨酸酶的抑制率顯著高于光果甘草藥材提取液濃度為 625 mg/L，抑制率為（44.4±5.9）%。表明3種甘草毛狀根提取液中光果對(duì)酪氨酸酶的抑制能力最強(qiáng)。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定甘草毛狀根的最佳提取條件：提取溶劑為75%丙二醇，料液比為1 g ∶15 mL，超聲溫度為50 ℃，超聲時(shí)間為 30 min。3種甘草毛狀根中的總黃酮含量存在顯著差異（P<0.05），光果中總黃酮含量最高，脹果次之，烏拉爾中含量最低。其次，光果與烏拉爾中的甘草苷含量相當(dāng)，均高于脹果;脹果與光果中的異甘草苷含量相當(dāng)，均低于烏拉爾;光果中的光甘草定含量最顯著高于烏拉爾和脹果。

3種甘草毛狀根提取液濃度不高于625 mg/L時(shí)，提取液對(duì)紅細(xì)胞與雞胚絨毛尿囊膜均無(wú)刺激性。3種甘草毛狀根提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力由強(qiáng)到弱依次為脹果、光果、烏拉爾;對(duì)ABTS自由基的清除能力由強(qiáng)到弱依次為光果、脹果、烏拉爾，光果和脹果對(duì)DPPH和ABTS自由基具有較好的清除能力。3種甘草毛狀根提取液抑制酪氨酸酶能力從高到低依次為光果、烏拉爾、脹果，光果對(duì)酪氨酸酶的抑制能力優(yōu)于光果甘草藥材，說(shuō)明光果提取液具有較好的美白護(hù)膚功效。

本研究結(jié)果顯示，3種甘草毛狀根提取液中光果在抗氧化及美白護(hù)膚活性上均優(yōu)于烏拉爾和脹果。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]Bao F，Bai H Y，Wu Z R，et al. Phenolic compounds from cultivated Glycyrrhiza uralensis and their PD-1/PD-L1 inhibitory activities[J]. Natural Product Research，2021，35（4）：562-569.

[3]劉 鵬，田俊生.甘草苷治療抑郁癥和糖尿病共病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2019，31（11）：1880-1886，1918.

[4]Liu Y Y，Wu J Q，F(xiàn)an R Y，et al. Isoliquiritin promote angiogenesis by recruiting macrophages to improve the healing of zebrafish wounds[J]. Fish & Shellfish Immunology，2020，100：238-245.

[5]劉亮亮，陳 姬，張 波，等. 異甘草素與光甘草定抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：245-250.

[6]卓漢強(qiáng).一種含有植物精油的煙草加料香精配方：CN110527595A[P]. 2019-12-03.

[7]Palmatier M I，Smith A L，Odineal E M，et al. Nicotine self-administration with tobacco flavor additives in male rats[J]. Nicotine & Tobacco Research，2020，22（2）：224-231.

[8]曲紅盼，孔德承，成志偉.甘草次生代謝物在化妝品中的功效作用[J]. 中國(guó)化妝品，2020（8）：109-112.

[9]Chen J M，Yu X J，Huang Y F.Inhibitory mechanisms of glabridin on tyrosinase[J]. Spectrochimica Acta，2016，168：111-117.

[10]Tanaka Y，Kikuzaki H，F(xiàn)ukuda S，et al. Antibacterial compounds of licorice against upper airway respiratory tract pathogens[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2001，47（3）：270-273.

[11]Reigada I，Moliner C，Valero M S，et al. Antioxidant and antiaging effects of licorice on the Caenorhabditis elegans model[J]. Journal of Medicinal Food，2020，23（1）：72-78.

[12]楊世海，劉曉峰，沈 昕，等. 甘草Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及不同理化因子對(duì)甘草毛狀根生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志，2006，31（11）：875-878.

[13]杜 旻，向德軍，丁家宜，等. 甘草毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及化學(xué)成分分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，10（1）：7-10.

[14]盧虹玉，劉 義，張海超，等. 甘草毛狀根中甘草總黃酮和甘草酸的檢測(cè)和分析[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（1）：43-46.

[15]王裔惟，丁家宜，周倩耘，等. 光果甘草毛狀根培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)活性氧清除能力和總黃酮含量的變化[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2004，13（2）：6-9.

[16]盧虹玉，劉敬梅，張海超，等. 甘草毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)及其黃酮含量檢測(cè)的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（11）：814-818.

[17]姚慶收，陳向明，丁 斐，等. 甘草毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及甘草酸和總黃酮含量的測(cè)定[J]. 中藥材，2018，41（9）：2035-2038.

[18]Khazaei A，Bahramnejad B，Mozafari A A，et al. Hairy root induction and Farnesiferol B production of endemic medicinal plant Ferula pseudalliacea[J]. 3 Biotech，2019，9（11）：407.

[19]楊 瑞，李文東，馬永生，等. 不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（2）：318-326.

[20]苗永美，簡(jiǎn) 興，汪 雁，等. 廣東石豆蘭不同溶劑提取物抗氧化及與總黃酮、總酚含量的關(guān)系[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（5）：1038-1046.

[21]周逸芝，劉訓(xùn)紅，許 虎，等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定龍柴方及其組成藥甘草中甘草苷等5種指標(biāo)成分的含量[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（2）：139-142.

[22]Okamoto Y，Ohkoshi K，Itagaki H，et al. Interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients.（3） Evaluation of the haemolysis test[J]. Toxicology in Vitro，1999，13（1）：115-124.

[23]王 東，馬金鳳，蔡明旭，等. 咖啡酰氨基酸乙酯的合成及其抗氧化活性[J]. 精細(xì)化工，2019，36（3）：494-498.

[24]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊試驗(yàn)：SN/T 2329—2009[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[25]賈冬英，曹冬冬，姚 開(kāi).荸薺皮提取物對(duì)DPPH自由基清除活性[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19（5）：745-747.

[26]Zou J，Huang Y X，Zhu L R，et al. Multi-wavelength spectrophotometric measurement of persulfates using 2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate） （ABTS） as indicator[J]. Spectrochimica Acta，2019，216：214-220.

[27]上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì). 化妝品-酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)方法：T/SHRH 015—2018[S]. 上海：上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)，2018.

[28]Chaves O A，de Oliveira M C C，de Salles C M C，et al. In vitro tyrosinase，acetylcholinesterase，and HSA evaluation of dioxidovanadium （V） complexes：An experimental and theoretical approach[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2019，200：110800.

[29]張麗宏，傅 云，廖 建，等. 甘草苷抑制UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的體外研究[J]. 中藥材，2017，40（11）：2672-2676.

[30]劉靖麗，權(quán) 彥，閆 浩，等. 基于DFT方法研究甘草中黃酮類化合物的抗氧化活性[J]. 當(dāng)代化工，2020，49（10）：2163-2166，2170.

[31]Chen J M，F(xiàn)ang Q Y，Liu S Q，et al. Influences of several factors on the photolysis of glabridin under UV irradiation[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology，2017，339：12-18.

[32]張興琪，何敬愉，龔盛昭，等. 不同種類甘草成分及美白抗敏活性差異研究[J]. 日用化學(xué)工業(yè)，2021，51（7）：648-654.

3644501908244