潘亞菲，趙志軍，黨甜甜，陳 梅，馬 苗，賈 偉

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，銀川 750004；3.寧夏病原微生物重點實驗室，銀川 750004）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella.peneumoniae，Kpn）作為臨床常見的條件致病菌，在宿主免疫力低下或伴發(fā)基礎(chǔ)疾病時可以引起呼吸道、消化道和泌尿生殖道等感染，分布廣泛?，F(xiàn)今，Kpn的耐藥問題變得愈加嚴(yán)峻[1]，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP）因傳播效率高、難以治愈且致死率高等特點受到廣泛關(guān)注。根據(jù)我國最新耐藥監(jiān)測結(jié)果報道[2]，Kpn對碳青霉烯類藥物的耐藥率已超過20%。由細菌合成和分泌的一種低分子量分子稱為鐵載體，它可以通過周圍環(huán)境螯合鐵，促進細菌對鐵的吸收，進而參與細菌代謝與生長[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，鐵載體可作為受體將抗生素分子轉(zhuǎn)入細菌內(nèi)，從而影響細菌的耐藥性。據(jù)報道[5]，Kpn對喹諾酮類、頭孢類耐藥程度與鐵載體產(chǎn)量相關(guān)。探究Kpn鐵載體與碳青霉烯類藥物耐藥性的研究仍較少[6]。因此，本研究通過對Kpn產(chǎn)鐵載體能力分析、常見耐藥基因和鐵載體基因的檢測以及CRKP菌株產(chǎn)酶型的鑒定等，探討目前CRKP菌株的流行情況，并分析碳青霉烯類抗生素耐藥性與Kpn產(chǎn)鐵載體能力的關(guān)系，以期為臨床解決抗生素耐藥問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本研究所使用的60株Kpn均來自2019年寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床收集，全部菌株分離純化。使用的所有菌株都通過了VITEK2Compact全自動微生物分析系統(tǒng)的鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 鉻天青S（CAS）平板檢測

將CAS平板四分區(qū)，分別加入10 μL菌液在CAS檢測板上，待菌液干燥后放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)18～24 h。若經(jīng)過培養(yǎng)后的菌落周圍呈現(xiàn)橘黃色分泌環(huán)，表明有鐵載體的產(chǎn)生。

1.3 嗜鐵素相對含量測定

制備菌懸液，紫外分光光度法檢測得到鐵載體的相對含量。將臨床分離的60株Kpn以10 000 r·min-1速度離心10 min，再取上清3 mL與CAS檢測液等體積混合，在黑暗中放置30 min，以雙蒸水為對照，將630 nm處的吸光度（As）調(diào)整為零。將空白介質(zhì)與等量的CAS檢測液混合，以其吸光度（Ar）值為參比，按公式［（Ar-As）/Ar］×100%計算，得到不同的鐵載體含量。根據(jù)鐵載體總含量的中位數(shù)，將菌株分為高產(chǎn)鐵載體組和低產(chǎn)鐵載體組，每組細菌均為30株。實驗重復(fù)3次。

1.4 基因擴增

通過煮沸法提取細菌DNA，PCR檢測相應(yīng)的鐵載體基因和碳青霉烯類耐藥基因。本研究中所使用引物由上海生工生物工程有限公司合成，其擴增體系為20 μL，在這其中包括2×Taq DNA Mix酶10 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：94℃下5 min，94℃下60 s，退火60 s（見表1），72℃下60 s，循環(huán)32次，72℃下10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物。

表1 PCR引物序列

1.5 藥敏實驗

根據(jù)CLSI 2018年M100-S28文件檢測步驟，將美羅培南藥敏紙片浸沒于菌懸液中，以浸于無菌水中的美羅培南藥敏紙片作為空白對照。以KpnATCC BAA-1705菌液中的美羅培南藥敏紙片作為絲氨酸碳青霉烯酶陽性對照，KpnATCC BAA-1706作為碳青霉烯酶陰性對照。測量抑菌圈大小，進行結(jié)果判讀。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。60株Kpn鐵載體含量呈偏態(tài)分布，根據(jù)中位數(shù)進行分組，兩組Kpn鐵載體含量分別呈正態(tài)分布，組間比較采用雙樣本獨立t檢驗；高產(chǎn)鐵載體組與低產(chǎn)鐵載體組對碳青霉烯類抗生素耐藥性的差異、耐藥基因和鐵載體基因陽性率差異比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kpn鐵載體產(chǎn)量結(jié)果

鐵載體含量測定表明，60株Kpn均產(chǎn)生橘黃色分泌環(huán)，說明都產(chǎn)生鐵載體，且由于分泌環(huán)的直徑不同，各菌株產(chǎn)生的鐵載體數(shù)量也不同。用酶標(biāo)儀定量檢測細菌鐵載體含量，獲得60株Kpn鐵載體含量范圍為（-41.1±0.1）%～（45.8±0.2）%。鐵載體總含量的中位數(shù)為21.69%，將60株Kpn分為高產(chǎn)鐵載體組（鐵載體含量＞21.69%）和低產(chǎn)鐵載體組（鐵載體含量＜21.69%），見表2。低產(chǎn)鐵載體組的鐵載體產(chǎn)量低于高產(chǎn)鐵載體組（t=9.530，P＜0.01），見圖1。

表2 60株Kpn鐵載體產(chǎn)量結(jié)果（%）

圖1 肺炎克雷伯菌鐵載體產(chǎn)量比較

2.2 鐵載體基因與耐藥基因篩選結(jié)果

Kpn鐵載體基因型檢測結(jié)果見圖2，60株Kpn中，鐵載體基因檢出情況為:ent B85.0%（51/60）、iron B11.7%（7/60）、ybt S28.3%（17/60）。

圖2 Kpn鐵載體基因型檢測結(jié)果

60株Kpn中CRKP的檢出率為50.0%，有3株未檢出耐藥基因，27株碳青霉烯類耐藥基因陽性。其中攜帶B類碳青霉烯酶基因（blaNDM）16株、B類碳青霉烯酶基因（blaIMP）9株、A類碳青霉烯酶基因（blaKPC）10株、D類碳青霉烯酶基因（blaOXA-48）15株，陽性率分別為26.7%、15.0%、16.7%和25.0%。27株CRKP中，10株僅攜帶blaKPC，2株僅攜帶blaNDM，1株同時攜帶blaIMP和blaOXA-48菌 株，6株 同 時 攜 帶blaNDM和blaOXA-48菌 株，8株 同 時 攜 帶blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株。

2.3 表型結(jié)果

10株blaKPC陽性菌株中，改良碳青霉烯類失活法（mCIM）陽性9株、陰性1株；EDTA-碳青霉烯類失活法（eCIM）陽性1株、陰性8株、無效結(jié)果1株；2株blaNDM陽性菌株中，mCIM和eCIM均為陽性；1株同時攜帶blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均為陽性；6株同時攜帶blaNDM和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均為陽性；8株同時攜帶blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM陽性7株、陰性1株，eCIM陽性7株、無效結(jié)果1株，部分表型結(jié)果見表3。

表3 部分表型結(jié)果

2.4 表型試驗結(jié)果評價

以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，mCIM試驗的敏感度與特異度均＞90%。mCIM試驗與PCR結(jié)果一致性較好（Kappa=0.832），見表4。

表4 表型試驗結(jié)果

2.5 兩組鐵載體產(chǎn)量與鐵載體基因、耐藥基因陽性率的比較

高產(chǎn)鐵載體組鐵載體相關(guān)基因ent B和ybt S陽性率均高于低產(chǎn)鐵載體組，耐藥基因NDM陽性率低于低產(chǎn)鐵載體組（P均＜0.05）。其余鐵載體相關(guān)基因和耐藥基因兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表5。

表5 兩組耐藥基因、鐵載體基因陽性率比較

2.6 產(chǎn)鐵載體能力與碳青霉烯類耐藥的關(guān)系

高產(chǎn)鐵載體組碳青霉烯類耐藥率（30%）低于低產(chǎn)鐵載體組（70%）（χ2=9.600，P＜0.01）。根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，將60株Kpn分為碳青霉烯類藥物敏感組（30株）與耐藥組（30株），碳青霉烯類藥物耐藥組鐵載體產(chǎn)量低于敏感組（t=2.481，P＜0.05），見圖3。

圖3 碳青霉烯類耐藥組和敏感組鐵載體產(chǎn)量比較

3 討論

碳青霉烯類抗生素是臨床目前用于治療腸桿菌科細菌感染最為有效的抗生素，特別是針對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC酶的多重耐藥菌[7]。隨著該類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，導(dǎo)致腸桿菌科細菌對其敏感性降低甚至耐藥。其中多數(shù)CRKP對幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，這對于臨床抗感染治療造成了極大的挑戰(zhàn)[8]。本研究收集的寧夏地區(qū)2019年臨床分離的60株Kpn菌株中，通過PCR檢測出有27株菌株為碳青霉烯類耐藥基因陽性，達到了45%，且CRKP菌株的碳青霉烯酶基因以NDM為主，檢出率為30%。該結(jié)果與我國大部分地區(qū)以KPC基因型流行為主不同[9-10]，可能由于地區(qū)上的差異，不同耐藥基因的分布也有所不同，因此應(yīng)依據(jù)當(dāng)?shù)啬退幘哪退幪攸c來進行抗生素的選擇。在臨床抗感染治療和防治上，鑒定CRKP產(chǎn)酶菌株具有重要意義。本項研究中，mCIM試驗的敏感度為92.59%，特異度為90.90%，與PCR結(jié)果一致性較好。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）建議，通過eCIM實驗初步分類了碳青霉烯酶的型別[11]。該結(jié)果顯示eCIM靈敏度較高，考慮到eCIM試驗具有一定的局限性，只能應(yīng)用于單產(chǎn)金屬酶的檢測，如果同時攜帶其他類型的碳青霉烯酶的菌株進行檢測時，則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12]，因此還應(yīng)該參考相關(guān)耐藥基因的檢測結(jié)果。

鐵是大多數(shù)生物體極其重要的生命元素，在細菌的生化代謝反應(yīng)、電子傳遞和其他生命活動中不可或缺[13]。在缺鐵條件下，微生物會分泌一種低分子量的鐵螯合劑，稱為鐵載體。鐵載體則與細菌耐藥性有著密切聯(lián)系。部分革蘭陰性菌耐藥原因為抗生素分子較大，無法進入細菌[14]。而鐵載體－抗生素結(jié)合形成的軛合物可以轉(zhuǎn)入細菌內(nèi)，從而抑制細菌的生長[4]。本研究顯示肺炎克雷伯菌鐵載體的產(chǎn)量與碳青霉烯類抗生素耐藥性有關(guān)，高產(chǎn)鐵載體組耐藥率低于低產(chǎn)鐵載體組，且碳青霉烯類耐藥組產(chǎn)鐵能力低于敏感組。表明肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素的耐藥性與其產(chǎn)鐵載體能力可能存在著一定關(guān)聯(lián)性，考慮原因為：鐵載體含量較高，細菌更易與抗生素形成軛合物，從而使抗生素進入細菌內(nèi)殺滅病原菌。近年來，新型鐵載體藥物利用細菌自身的鐵吸收系統(tǒng)進入細菌，使其鐵載體含量增加。該類藥物具有獨特的穿透革蘭陰性菌細胞膜的作用機制，從而克服碳青霉烯耐藥[15]。Bachman等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從呼吸道分離的Kpn對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感，ent B和ybt S陽性率較低?？赡苡捎谥粰z測了一些鐵載體基因的攜帶情況，并未直接分析細菌產(chǎn)生鐵載體的能力，從而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。

本研究通過對Kpn耐藥基因進行篩選，匯總和分析了CRKP的分子流行情況，通過方法學(xué)對mCIM實驗進行了評價，發(fā)現(xiàn)Kpn鐵載體的產(chǎn)量與碳青霉烯類抗生素耐藥性有關(guān)。在今后的研究中，將對抗生素耐藥性與其產(chǎn)鐵載體的相關(guān)機制進行深入探究，針對目前臨床的細菌耐藥問題提供更加完善的理論依據(jù)。