厙廣東，陳娟，代小敏，韓霞

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。⒛X卒中等的主要病理基礎(chǔ)[1]。AS作為一種慢性炎癥疾病，局部或全身性的免疫反應(yīng)始終貫穿發(fā)病過(guò)程，而巨噬細(xì)胞在其中起到重要作用[2]。胰高血糖素樣肽1（GLP-1）是一種新型降糖藥物，具有低血糖反應(yīng)少、對(duì)體重影響小的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床，其心血管保護(hù)作用也成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。目前GLP-1對(duì)AS的作用及具體機(jī)制尚未完全清楚，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠能短期內(nèi)形成類(lèi)似人類(lèi)病理特征的AS斑塊，是研究AS病理的良好模型。本研究旨在分析GLP-1是否能影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞泡沫化及動(dòng)脈粥樣斑塊發(fā)生發(fā)展，以期為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器6周齡雄性ApoE-/-小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。小鼠體重17～22 g，平均（19.1±1.7）g，均在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～25 ℃。GLP-1（7-36）、GLP抑制劑Exendin（9-39）均購(gòu)自成都凱捷生物醫(yī)藥有限公司；高脂飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）；蘇木素-伊紅染色液（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；紅油O染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（美國(guó)Sigma公司）；細(xì)胞裂解液（美國(guó)Sigma公司）；鼠抗人SR-A、CD36一抗（美國(guó)R&D公司）；FITC標(biāo)記的IgG二抗（美國(guó)Invitrogen公司）；β-action（美國(guó)Santa Cruz公司）；全自動(dòng)生化儀（邁瑞B(yǎng)S-280型）；顯微鏡（日本Olympus BX41型）。

1.2 小鼠分組及處理將40只ApoE-/-小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、GLP-1組和GLP-1阻斷組，每組各10只。其中，對(duì)照組采用普通飼料喂養(yǎng)，其余三組采用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料為含10%豬油和1.25%膽固醇的飼料，喂養(yǎng)12周。于8周末開(kāi)始，GLP-1組小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2 nmol/（L·kg），GLP-1阻斷組小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2nmol/（L·kg）和Exendin22 nmol/（L·kg）。兩組均連續(xù)注射4周，對(duì)照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物管理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)喂養(yǎng)12周后采集小鼠靜脈血，待血液凝固血塊收縮后以4000 r/min離心10 min，取上清液，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.4 小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)形態(tài)觀察采集血液樣本后剪開(kāi)右心耳，采用磷酸鹽緩沖液從左心室灌注至右心房流出，分離主動(dòng)脈并在4% HCHO溶液中過(guò)夜，在蔗糖濃度梯度溶液中脫水，包埋、制備組織切片（5 μm），進(jìn)行HE染色觀察血管內(nèi)斑塊大小、管腔狹窄程度、泡沫細(xì)胞形成等病理變化。

1.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離及泡沫細(xì)胞脂滴形成檢測(cè)小鼠處死后在其腹腔中注射2 ml預(yù)冷的PBS緩沖液，輕揉小鼠腹部并將腹腔液吸出，重復(fù)操作3次后，放置于5 ml離心管中，以2000 r/min離心10 min，棄去上清液后加入DMEM重懸；再次離心棄去上清液，在沉淀細(xì)胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液重懸；將得到的巨噬細(xì)胞在4% HCHO溶液中國(guó)定10 min，采用油紅O染色1 min，其后采用60% C3H8O溶液清洗2次、超純水漂洗3次，在顯微鏡下觀察細(xì)胞泡沫化狀況并拍照。

1.6 RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A mRNA表達(dá)在獲取的巨噬細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共35 cycles后72℃延長(zhǎng)7 min，分別取CD36、SR-A擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線(xiàn)透射反射分析儀下拍照。采用凝膠分析系統(tǒng)和ID Image分析軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行灰度圖像分析，以β-action為內(nèi)參，計(jì)算CD36、SR-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：CD36上游3'- GGAGGCATTCTCATGCCAGT -5'，下游3'- CTGCTGTTCTTTGCCACGTC -5'，SR-A上游3'- ATCTTCCACCAAGGCCAGTG -5'，下游3'- CCTAGACTCCGGCAGACAAC -5'。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CD36、SR-A蛋白表達(dá)采用含1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液加入到巨噬細(xì)胞中，以12 000 r/min離心15 min來(lái)提取上清液中總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDSPAGE電泳、200 mA恒流電轉(zhuǎn)膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入CD36、SR-A一抗（1:1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜；二抗室溫孵育60 min，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，采用成像掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和圖像保存，并計(jì)算CD36、SR-A蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠血脂水平比較與對(duì)照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平降低（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻斷組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高（P＜0.05），（表1）。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)形態(tài)觀察HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)壁清晰、無(wú)斑塊形成；模型組斑塊病變最嚴(yán)重，斑塊內(nèi)可見(jiàn)大量膽固醇結(jié)晶，泡沫細(xì)胞數(shù)量較多，管腔高度狹窄；與模型組比較，GLP-1組主動(dòng)脈壁黏膜層只有局部薄層粥樣斑塊，泡沫細(xì)胞數(shù)目減少，管腔輕度狹窄；而GLP-1阻斷組與GLP-1組相比粥樣斑塊面積和厚度增加，泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增加（圖1）。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈HE染色結(jié)果（40×）

2.3 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化狀況比較與對(duì)照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組小鼠腹腔泡沫細(xì)胞形成明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組泡沫細(xì)胞形成減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻斷組泡沫細(xì)胞形成增加（P＜0.05），（圖2～3）。

圖2 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞油紅O染色結(jié)果（200×）

2.4 RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD36、SR-AmRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A mRNA表達(dá)增加（P＜0.05），（圖4～5）。

圖3 各組巨噬細(xì)胞泡沫化比例比較

圖4 三組腹腔巨噬細(xì)胞CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻巨噬細(xì)胞中CD36、SR-A 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），（圖6～7）。

圖6 腹腔巨噬細(xì)胞CD36、SR-A蛋白表達(dá)圖

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種由動(dòng)脈管壁上膽固醇累積引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)疾病。巨噬細(xì)胞的泡沫化和凋亡不斷累積可加速動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定和破裂，是促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的主要因素[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽1（GLP-1）可有效改善心肌能量代謝和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而減少心血管疾病的發(fā)生[5]。本研究旨在觀察GLP-1對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化形成及AS發(fā)展的影響，為臨床抗AS治療提供新的思路。

圖5 三組腹腔巨噬細(xì)胞SR-A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖7 各組細(xì)胞CD36、SR-A 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

載脂蛋白E基因（ApoE）主要參與機(jī)體脂蛋白代謝過(guò)程，而ApoE-/-小鼠在高脂飲食條件下，可在較短時(shí)間內(nèi)形成類(lèi)似人體的AS病變從而成為常用的AS動(dòng)物模型[6]。本研究中我們采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，其他三組高脂飲食血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均偏高，且GLP-1組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平低于模型組、GLP-1阻斷組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平高于GLP-1組，提示高脂飲食可引發(fā)外周血中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高，而GLP-1可緩解體內(nèi)脂質(zhì)水平的過(guò)度升高。外周血中膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)受巨噬細(xì)胞等特殊細(xì)胞調(diào)節(jié)，因此推測(cè)GLP-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞來(lái)參與體內(nèi)膽固醇代謝。

泡沫細(xì)胞與AS發(fā)展關(guān)系密切，而泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中LDL的大量涌入及膽固醇的超負(fù)荷沉積[7,8]。正常內(nèi)環(huán)境中，巨噬細(xì)胞是血漿脂蛋白代謝的主要調(diào)節(jié)因子[9]。在內(nèi)皮細(xì)胞的促炎激活反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞穿透內(nèi)皮屏障并在動(dòng)脈內(nèi)膜中積累，成為機(jī)體中泡沫細(xì)胞的重要來(lái)源[10,11]。內(nèi)皮下聚集的泡沫細(xì)胞不斷形成超負(fù)荷脂質(zhì)的動(dòng)脈粥樣斑塊，在AS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)階段中都發(fā)揮著重要作用[12]。此外，巨噬細(xì)胞的泡沫化主要來(lái)自于細(xì)胞中出現(xiàn)膽固醇的沉積，具體表現(xiàn)為膽固醇攝取增加和外流減少，而清道夫受體在其中發(fā)揮重要作用[13]。巨噬細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)LDL受體和清道夫受體，其中LDL受體可介導(dǎo)細(xì)胞攝取脂質(zhì)，此過(guò)程受到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的反饋調(diào)節(jié)；而CD36、SR-A等清道夫受體所介導(dǎo)的脂質(zhì)攝入過(guò)程不受到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的反饋抑制，在脂質(zhì)攝入過(guò)程還可促進(jìn)自身表達(dá)水平的增加，從而加劇游離和酯化膽固醇在巨噬細(xì)胞中的沉積[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，其他三組泡沫細(xì)胞形成、CD36、SR-A mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，且GLP-1組低于模型組、GLP-1阻斷組低于GLP-1組，提示GLP-1可抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化狀況，推測(cè)原因可能是GLP-1能通過(guò)調(diào)節(jié)清道夫受體CD36、SR-A表達(dá)從而影響巨噬細(xì)胞的泡沫化過(guò)程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)高血脂癥小鼠有抗AS作用，且巨噬細(xì)胞在主動(dòng)脈壁的浸潤(rùn)受到明顯影響[17]。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑可抑制DPP-4對(duì)GLP-1的降解，有學(xué)者采用DPP-4抑制劑注射ApoE-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的CD36、SR-A和清道夫受體LOX-1的表達(dá)量相對(duì)模型組明顯下調(diào)，提示GLP-1表達(dá)增加可抑制CD36、SR-A表達(dá)[18]。GLP-1類(lèi)藥物已成為新一代降糖藥物，糖尿病合并AS不僅增加血糖管理難度，還會(huì)對(duì)患者生命健康造成不利影響。本研究表明GLP-1通過(guò)影響巨噬細(xì)胞泡沫化從而影響AS進(jìn)程，也為DM患者并發(fā)AS的綜合防治提供參考。