致病性鉤端螺旋體的多位點(diǎn)序列分型研究

李 喆，張 影，杜宗利，辛?xí)苑?，葉 強(qiáng)，徐穎華

鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)引起的人獸共患傳染病[1]。盡管隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和衛(wèi)生條件改善，在過(guò)去幾十年世界各國(guó)鉤體病的發(fā)病率大幅降低，但據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年仍有約200萬(wàn)鉤體感染病例，一些地區(qū)甚至還發(fā)生暴發(fā)流行。因此，鉤體病仍是當(dāng)前全球的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。

病原體的監(jiān)測(cè)和溯源是預(yù)防和控制傳染性疾病的最關(guān)鍵步驟之一。國(guó)際和國(guó)內(nèi)對(duì)鉤體菌株的分類從最早血清學(xué)分類法，到各型不同原理的分子分型方法[3-5]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，自20世紀(jì)90年代起，研究人員就開(kāi)始應(yīng)用16SRNA基因測(cè)序方法對(duì)鉤體進(jìn)行分子分型，并將致病性鉤體中包括問(wèn)號(hào)(Leptospirainterrogans)、波氏(L.borgpetersenii)、衛(wèi)氏(L.weilii)等10個(gè)基因種[6-7]。此外，Ahmed等[8]于2006年首次將基于多種管家基因的多位點(diǎn)序列分型法(Multi-Locus Sequence Typing, MLST)技術(shù)用于鉤體的分子分型，由于該方法簡(jiǎn)單、快捷、結(jié)果易于比較，被廣泛用于不同致病性基因型的分子分型、進(jìn)化溯源和種群結(jié)構(gòu)等研究[9-10]。而目前對(duì)全球致病鉤體菌株進(jìn)行系統(tǒng)性MLST分析的研究較少。此外，中國(guó)致病性鉤體菌株MLST研究多用于黃疸出血群的型群結(jié)構(gòu)分型[6,9]，而其他血清群致病性鉤體分型和遺傳多樣性的研究報(bào)道也較少。因此，在本研究應(yīng)用16SRNA基因測(cè)序和MLST分析方法對(duì)不同來(lái)源、不同時(shí)期的21種不同血清群的國(guó)內(nèi)鉤體分離菌株與國(guó)際參考菌株進(jìn)行分析，并與國(guó)內(nèi)7株疫苗株結(jié)果平行比較[4]。同時(shí)基于PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)和已有的文獻(xiàn)報(bào)道[4,6,9]，共收集來(lái)自世界7大洲不同國(guó)家和不同時(shí)期1 238株致病性鉤體基因種和MLST數(shù)據(jù)(含236株中國(guó)致病性鉤體MLST數(shù)據(jù))。探討分析致病性鉤體MLST基因多態(tài)性，以其系統(tǒng)性了解中國(guó)境內(nèi)和全球致病鉤體菌株種群結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株 致病性鉤體國(guó)際和國(guó)內(nèi)參考菌株均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Ex Taq DNA聚合酶和DNA marker DL1000購(gòu)自大連TaKaRa公司；其他化學(xué)試劑均為分析純；2400型基因擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)和DNA提取 將鉤體菌株接種于含10%兔血清的磷酸鹽培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)14 d。離心收集菌體，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌體基因組的提取，基因組DNA樣品放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16SrRNA基因序列分析 以提取的鉤體菌株基因組DNA為模板，通過(guò)擴(kuò)增和測(cè)序近全長(zhǎng)16SrRNA基因(擴(kuò)增引物見(jiàn)表1)，進(jìn)行鉤體基因型的鑒定。將測(cè)序結(jié)果與參考序列(GenBank: AY631894.1)進(jìn)行比對(duì)，參考文獻(xiàn)[7], 根據(jù)位點(diǎn)差異判定菌株基于16SrRNA序列的基因型。

1.5 MLST分析 參考文獻(xiàn)[10]，選擇7個(gè)國(guó)際通用的MLST位點(diǎn)，已提取基因組DNA為模板，應(yīng)用7種不同管家基因引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行MLST不同位點(diǎn)的擴(kuò)增及測(cè)序。將管家基因測(cè)序結(jié)果上傳PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/)，獲得待檢測(cè)鉤體菌株MLST型(ST)。

表1 本研究所用引物序列

1.6 MLST數(shù)據(jù)收集和系統(tǒng)發(fā)育分析 從PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/)下載已明確MLST型(scheme 1)數(shù)據(jù)及其菌株信息，同時(shí)從國(guó)內(nèi)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[4,6,9]收集中明確MLST型(scheme 1)的鉤體菌株信息。使用Bionumerics軟件v7.5 (Applied-Maths)對(duì)本研究所有鉤體菌株MLST信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建最小生成樹(shù)，并以此探討致病性鉤體種群結(jié)構(gòu)與菌株分離宿主來(lái)源、區(qū)域等流行病學(xué)信息的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 致病性鉤體16SrRNA基因序列分析 16SrRNA基因測(cè)序分析結(jié)果顯示(圖1)，5株鉤體國(guó)際參考菌株為問(wèn)號(hào)基因種，其他2株國(guó)際菌株為L(zhǎng).kirschneri基因種；而在47株鉤體中國(guó)分離株中，分別包含28株(59.6%)問(wèn)號(hào)基因種、8株(17.0%)波氏基因種、6株(12.8%)衛(wèi)氏基因種、4株(8.5%)L.alexanderi基因種和1株(2.1%)L.kirschneri基因種。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)6株衛(wèi)氏基因種菌株除了來(lái)源人以外，還來(lái)自3種不同動(dòng)物宿主(圖1)。不同菌種的血清群與其基因種沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

2.2 致病性鉤體MLST分型 通過(guò)對(duì)54株鉤體菌株進(jìn)行7個(gè)管家基因位點(diǎn)的擴(kuò)增、測(cè)序及與PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)參考序列進(jìn)行比對(duì)，確定了每個(gè)菌株每個(gè)管家基因位點(diǎn)的基因型，通過(guò)組合不同位點(diǎn)基因型最終確定了每個(gè)菌株的MLST型(圖1)。7株國(guó)際參考菌株呈現(xiàn)7種不同ST型。

在47株中國(guó)鉤體分離株中，發(fā)現(xiàn)15種ST型以及24種尚未報(bào)道的新ST型(圖1)。其中56620、56666、56679和56660菌株均為ST1型，與疫苗株黃疸出血群賴株(56001)相同，這5種ST1型菌株均為問(wèn)號(hào)基因種，56620和56679均為黃疸出血群。此外，還發(fā)現(xiàn)56003和56626菌株的ST型與疫苗株犬群611菌株相同，均為ST37型(圖1)。

上述菌株MLST分析結(jié)果的UPGMA發(fā)現(xiàn)，屬于問(wèn)號(hào)、波氏和衛(wèi)氏基因種菌株均各自形成單獨(dú)聚類分支。而4株L.alexanderi基因種聚類分支中包含一株L.kirschneri基因種菌株。在問(wèn)號(hào)基因種中，7株不同ST的疫苗株也位于不同亞分支中(圖1)。

紅色下劃線標(biāo)注的為中國(guó)鉤體疫苗生產(chǎn)菌株。

2.3 致病性鉤體基因種與MLST型的多態(tài)性分析 共收集(數(shù)據(jù)庫(kù)下載、文獻(xiàn)引用和本研究結(jié)果)1 238株鉤體MLST數(shù)據(jù)。對(duì)每一個(gè)菌株來(lái)源、分離時(shí)間、基因種和MLST型進(jìn)行匯總分析(表2)，世界范圍內(nèi)近百年分離的1 238株鉤體菌株共分為8個(gè)基因型，而中國(guó)236株鉤體菌株共分為5個(gè)基因型，不同國(guó)家流行菌株的基因種和ST型不盡相同(表2)。在鉤體流行疫情比較嚴(yán)重的亞太地區(qū)和南美區(qū)域，在過(guò)去60多年中，分離鉤體菌株基因種主要為問(wèn)號(hào)基因種。例如1962-2016年巴西分離的113株鉤體菌株中，83株為問(wèn)號(hào)基因種，相類似，在泰國(guó)分離的125株菌株中，92%(115株)的菌株基因種同為問(wèn)號(hào)基因種。而在疫情較輕的非洲國(guó)家剛果分離的16株菌株中，12株為L(zhǎng).kirschneri基因種和4株為波氏基因種(表2)。

在不同國(guó)家分離菌株中所含有ST型數(shù)量也不同，導(dǎo)致其多態(tài)性指數(shù)也不同，例如在中國(guó)和泰國(guó)，分別在236株和125株分離菌株發(fā)現(xiàn)82種和51種ST型，多態(tài)性指數(shù)分別為0.35和0.41，而在馬來(lái)西亞，31株菌株中含有30種ST型，多態(tài)性指數(shù)為0.97。在澳大利亞分離的16株菌株中發(fā)現(xiàn)12株ST型，多態(tài)性指數(shù)為0.75(表2)。

2.4 致病性鉤體種群結(jié)構(gòu)分析 基于MLST系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，世界范圍內(nèi)1 238株鉤體菌株包含16個(gè)主要的進(jìn)化簇(不少于10菌株/簇)，共計(jì)669個(gè)菌株(54.0%)，主要包括ST17、ST34、ST149、ST1和ST37等(表3)，其中ST17和ST149遍布全球多個(gè)洲分布。236個(gè)中國(guó)鉤體菌株包含4個(gè)主要的進(jìn)化簇(不少于10菌株/簇)，分別為ST1、ST128、ST17、ST143，共計(jì)120個(gè)菌株(50.9%)(表2)，ST1與ST128僅有ptnA管家基因不同，其余6個(gè)管家基因型均為1型。

表2 不同國(guó)家鉤體分離菌株的基因種與MLST型

表3 主要流行MLST型鉤體菌株的分布

此外，MLST分型與16SrRNA序列分析結(jié)果具有較好的一致性，而與血清群分型結(jié)果一致性較差，相同的血清群菌株內(nèi)ST型眾多。相同ST型菌株具有不同血清群。進(jìn)化樹(shù)分析也顯示致病性鉤體菌株在不同宿主物種廣泛地交叉感染，不同國(guó)家間存在廣泛傳播。分離時(shí)間與鉤體種群結(jié)構(gòu)分布并不具有明顯的相關(guān)性(圖2)。

每個(gè)圓代表一個(gè)MLST型(ST)，圓的大小代表一個(gè)給定ST的菌株數(shù)量。A為MLST與鉤體基因型的相關(guān)性，不同顏色代表了鉤體菌株基于16S RNA測(cè)序的不同基因型；B為MLST與鉤體血清群的相關(guān)性，不同顏色代表了不同的血清群；C為MLST與鉤體菌株宿主/媒介的相關(guān)性，不同顏色代表了不同的宿主/媒介；D為MLST與鉤體分離地區(qū)的相關(guān)性，不同顏色代表了不同的分離地區(qū)；E為MLST與鉤體分離時(shí)間的相關(guān)性，不同顏色代表了不同的分離時(shí)間段；F為中國(guó)鉤體菌株MLST型別的分布。

3 討 論

目前，全球已發(fā)現(xiàn)了近30個(gè)血清群300多個(gè)型不同血清型鉤體，至今仍不斷有新的血清型鉤體報(bào)道[4-5]。在中國(guó)，已發(fā)現(xiàn)的致病性鉤體有18個(gè)血清群76個(gè)血清型，但目前主要流行血清群仍是黃疸出血群[5-6]。但由于血清學(xué)方法檢測(cè)時(shí)需要一系列的標(biāo)準(zhǔn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)分群(型)血清，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，僅在部分鉤體參考實(shí)驗(yàn)室方可開(kāi)展，從而限制鉤體的分型分析廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單快捷的16SrRNA和MLST分析方法對(duì)不同來(lái)源、不同時(shí)期的多種不同血清群國(guó)內(nèi)分離菌株和國(guó)際菌株進(jìn)行分析，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)16SrRNA和MLST方法不僅可以用于鉤體的分子分型研究，還同樣適用于不同基因型菌株的進(jìn)化關(guān)系。

我們分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在47株國(guó)內(nèi)分離的鉤體菌株中，多數(shù)(59.6%)菌株均為問(wèn)號(hào)基因種，進(jìn)一步支持在中國(guó)過(guò)去60多年中分離鉤體菌種主要以問(wèn)號(hào)基因種為流行趨勢(shì)現(xiàn)狀[6,11]。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在波氏基因種的菌株來(lái)自多種動(dòng)物宿主。以前研究結(jié)果證實(shí)波氏致病性基因種的基因組含有大量的假基因，較問(wèn)號(hào)等基因種菌株基因組小400～800 kb[11-12]，提示其經(jīng)歷不同進(jìn)化歷程，喪失近祖先在普通環(huán)境生存的能力，僅能在動(dòng)物宿主體內(nèi)寄生，這些分析結(jié)果也解釋了為什么波氏基因種鉤體可在多種動(dòng)物宿主分離的原因之一。

MLST分析結(jié)果證實(shí)47株國(guó)內(nèi)分離菌株存在39種ST型，其中包括24種新型ST型，也進(jìn)一步表明中國(guó)鉤體菌株資源豐富、菌型復(fù)雜，種群結(jié)構(gòu)獨(dú)特[6,11,13]。此外，盡管當(dāng)前國(guó)內(nèi)鉤體疫苗生產(chǎn)用菌種是依據(jù)主要流行血清群的選擇代表性菌株，通過(guò)MLST系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)7株疫苗株位于不同進(jìn)化亞分支上，從分子水平層面分析，作為疫苗株也具有一定代表性。

由于鉤體病屬于人獸共患的自然疫源性疾病。其動(dòng)物宿主的種類繁多，當(dāng)?shù)貐^(qū)域性的氣候、環(huán)境變遷可能會(huì)影響致病性鉤體菌株的遺傳變異和進(jìn)化，表明鉤體菌株的基因型與地域具有一定相關(guān)性[14-15]。本研究MLST分析也證實(shí)不同國(guó)家流行不同的ST型，例如鉤體疫情嚴(yán)重的泰國(guó)和巴西主要流行型分別為ST34和S17，而在中國(guó)主要為ST1。由于分型原理不同，血清群與MLST分型沒(méi)有明顯的相關(guān)性，相同的血清群菌株具有不同的ST型，反之亦然。中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所收集過(guò)去50多年國(guó)內(nèi)5個(gè)不同省市的120株黃疸出血群鉤體菌株進(jìn)行MLST多態(tài)性分析，證實(shí)黃疸出血群群內(nèi)分化明顯，呈現(xiàn)17種不同ST基因型；盡管其中69株鉤體為ST1型，但隨著時(shí)間推移，菌株基因多態(tài)性呈現(xiàn)逐漸增多，國(guó)際主要流行ST17型占比呈上升趨勢(shì)[6]。研究人員應(yīng)用MLST方法對(duì)近些年泰國(guó)持續(xù)暴發(fā)鉤體疫情進(jìn)行分子流行病回顧性研究證實(shí)，盡管在泰國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)主要流行鉤體菌株的血清型并沒(méi)有明顯改變，但在暴發(fā)區(qū)域感染病人分離鉤體菌株及同時(shí)期其他泰國(guó)省市的人和動(dòng)物宿主分離的MLST型主要為ST34型(分別占比76%、71%和88%)，然而在泰國(guó)以前分離菌株中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ST34型，表明流行菌株管家基因發(fā)生變異，呈克隆性擴(kuò)張，形成主要新ST34基因型，在鉤體動(dòng)物宿主中具有較強(qiáng)的傳播能力，從而引起鉤體病的流行暴發(fā)[16]。因此，這些研究結(jié)果提示我們?cè)诋?dāng)前流行趨勢(shì)下，不僅要對(duì)鉤體流行菌株的血清群(型)進(jìn)行監(jiān)控，同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)鉤體分子流行病學(xué)的研究，掌握鉤體主要流行菌株基因型的動(dòng)態(tài)變化，從而為鉤體流行病暴發(fā)以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件菌株溯源和疾病控制提供技術(shù)支撐。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：李 喆，張 影，杜宗利，等. 致病性鉤端螺旋體的多位點(diǎn)序列分型研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(2)：95-101. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.024