吳 畏， 田宇昂， 白宇汐， 梁琳悅， 余 洋， 梁鵬寬，蔣中華， 石海春， 柯永培， 孫 群

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064; 2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物成都觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，四川 成都 610066;4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 溫江 611130)

0 引 言

玉米是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，如果因病害大規(guī)模減產(chǎn)將可能威脅國(guó)家糧食戰(zhàn)略安全。而玉米穗腐病是一種廣泛發(fā)生的玉米病害，在亞洲、歐洲、美洲等主要玉米種植區(qū)都有報(bào)道[1]。一般玉米品種該病發(fā)病率為5%～10%，部分易感品種發(fā)病率超過(guò)50%[2]。該病會(huì)使患病玉米的果穗、籽粒等腐爛，種子的發(fā)芽率和幼苗的成活率降低[3-4]。該病據(jù)報(bào)道有多種致病菌，主要為真菌，如鐮孢菌 (Fusariumspp)、曲霉菌 (Aspergi1usspp)、根霉菌 (Rhizopusspp) 等，在不同區(qū)域主要致病菌有差異[5-7]，并且也可以導(dǎo)致玉米莖腐病的發(fā)生[1,8]。

在中國(guó)，引起玉米穗腐病的主要致病菌為鐮孢菌，其中擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides) 和禾谷鐮孢復(fù)合種 (Fusarium graminearumclade) 為廣泛分布的致病種；但在部分省份玉米種植區(qū)，串珠鐮孢菌 (Fusarium moniliforme)、層出鐮孢菌(Fusarium proliferatum) 和尖胞鐮孢菌 (Fusarium oxysporum) 等也占有一定優(yōu)勢(shì)[3,9-17]。另外，鐮孢菌屬不同的種產(chǎn)毒能力和毒素類型有差異[18]，對(duì)不同玉米品種的侵染能力也不同[15,19-20]，所以防治穗腐病需先明確種植區(qū)當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)致病菌。2019年云南省玉米總產(chǎn)量920萬(wàn)噸[21]，玉米穗腐病可能對(duì)當(dāng)?shù)赜衩咨a(chǎn)造成的損失不容忽視。然而對(duì)云南地區(qū)玉米穗腐病的發(fā)生情況缺乏報(bào)道[13]，其主要致病菌尚不清楚，因此需要對(duì)當(dāng)?shù)赜衩姿敫〉闹饕虏【M(jìn)行鑒定。本研究在云南玉米穗腐病害嚴(yán)重地區(qū)采集染病玉米樣本，所采集樣本品種均為某云南大面積播種的高產(chǎn)品種；品種接種鑒定顯示對(duì)大斑病、小斑病、南方銹病等常見(jiàn)作物疾病有較高抗性，但易感穗腐病。因此對(duì)該玉米品種發(fā)生穗腐病的患病情況進(jìn)行鑒定，可以表征云南玉米穗腐病害嚴(yán)重地區(qū)玉米感病的情況。

另外，傳統(tǒng)的研究主要利用分離純化然后培養(yǎng)鑒定的方式來(lái)確定致病菌，但是由于大量微生物難以在培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，這種方法往往會(huì)低估環(huán)境中的生物多樣性[22]，也無(wú)法明確致病菌及其共生群落的構(gòu)成。近年來(lái)，以環(huán)境中微生物宏基因組DNA 信息為基礎(chǔ)，通過(guò)PCR-RFLP[23]、PCR-SSCP[24]、高通量測(cè)序[25]等方法來(lái)研究環(huán)境中微生物的組成成為一種更加便捷、全面、準(zhǔn)確的研究方式。另外，由于玉米穗腐病的主要致病菌為真菌[1,5]，并且真菌的核基因組 rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間ITS (internal transcribed spacer) 序列長(zhǎng)度適中、進(jìn)化速率較快，常用于真菌種屬鑒定、分型和多態(tài)性研究[26]；所以通過(guò)對(duì)群落DNA的ITS序列進(jìn)行測(cè)序，獲得的信息可以用來(lái)研究玉米穗腐病主要致病菌及其共生真菌群落組成。

本研究通過(guò)分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定、致病性測(cè)定等傳統(tǒng)的鑒定驗(yàn)證方法和基于Pacbio Sequel三代測(cè)序平臺(tái)的SMRT (Single Molecule Real-Time)測(cè)序技術(shù)的群落組成譜分析兩種方式，來(lái)研究云南省玉米穗腐病害嚴(yán)重地區(qū)玉米所患穗腐病主要致病菌及其共生群落組成；并通過(guò)文獻(xiàn)來(lái)源的玉米穗腐病致病菌鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行空間插值分析來(lái)研究中國(guó)穗腐病致病菌的分布從而了解該病主要致病菌的流行特征。

1 材料與方法

1.1 玉米樣品

發(fā)生穗腐病的玉米樣品于2019年采集自云南省楚雄彝族自治州祿豐縣 (海拔：1 659 m；經(jīng)緯度：25°N，102°E)，共 10 份，均為完整的新鮮玉米棒。

1.2 主要致病菌的分離純化和形態(tài)學(xué)鑒定

剝離少量發(fā)病部位 (玉米籽粒和穗軸) 的玉米材料，75%酒精浸泡10 s，用0.1%升汞消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗2次，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 平板上，于18 ℃下培養(yǎng)7 d，挑取菌落邊緣菌絲于新的PDA平板保存。利用稀釋法進(jìn)行單胞分離[27-28]。將分離的菌株接種于PDA平板上，18 ℃下培養(yǎng)14 d，觀察菌落形態(tài)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子特征，與相關(guān)文獻(xiàn)中穗腐病致病菌的描述進(jìn)行比較。

1.3 主要致病菌的致病性測(cè)定

將分離培養(yǎng)于PDA平板上的菌株用打孔器(直徑5 mm) 取菌餅分別接種到相同品種新鮮玉米的穗、籽粒和穗軸，18 ℃套袋培養(yǎng)14 d，觀察發(fā)病情況。設(shè)置空白對(duì)照和重復(fù)組。取發(fā)病部位的玉米材料，用75%酒精浸泡10 s，再用0.1%升汞消毒3～5 min，用無(wú)菌水沖洗2次，放置于PDA平板上，于18 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察再次分離得到的菌株和原來(lái)接種的菌株是否存在形態(tài)學(xué)上的差異。

1.4 真菌總DNA提取、ITS序列的擴(kuò)增和測(cè)序

分別從玉米籽粒和穗軸患病部位各取兩份菌落樣本 (取自籽粒的菌落樣本編號(hào)為：Z1，Z2；取自穗軸的菌落樣本編號(hào)為：B1，B2)。按照E.Z.N.A.?Fungal DNA Mini Kit (OMEGA bio-tek,美國(guó)) 試劑盒的步驟說(shuō)明，提取菌落中的真菌總DNA。對(duì)提取到的總DNA采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，并采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA完整性檢測(cè)。使用ITS序列引物ITS1 (TCCGTAGGTGAACC TGCGG) 及ITS4 (TCCTCCGCTT ATTGATATGC)對(duì)獲得的DNA模板進(jìn)行序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包括 12.5 μL Premix Taq，1 μL 引物 ITS1(10 μmol/L)，1 μL 引物 ITS4 (10 μmol/L)，1 μL 模板 DNA，由滅菌 ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。95 ℃ 預(yù)變性3min，95 ℃ 變性 30 s，57 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸2 min，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30，最后72 ℃延伸8 min。采用Pacbio Sequel三代測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增后的DNA片段進(jìn)行SMRT (Single Molecule Real-Time) 測(cè)序。采用perl腳本根據(jù)序列兩端的barcode序列進(jìn)行分樣，并去除barcode，再根據(jù)引物序列將反向互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)置為正向序列。測(cè)序公司為上海派森諾生物科技有限公司。

1.5 生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)分析

1.5.1 序列過(guò)濾及操作分類單元 (OTU) 聚類

序列過(guò)濾及聚類這一過(guò)程使用Vsearch(v2.13.4_linux_x86_64) 和 cutadapt (v2.3) 軟件進(jìn)行序列過(guò)濾和聚類。首先切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；之后拼接序列并進(jìn)行質(zhì)控；去除重復(fù)序列。在98%相似度水平對(duì)去重后的序列聚類，去除嵌合體；再使用perl腳本(https://github.com/torognes/vsearch/wiki/VS EARCH-pipeline)，過(guò)濾質(zhì)控后序列集中的嵌合體，從而獲得高質(zhì)量序列；在97%相似度水平對(duì)高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表。最后，去除OTU表格中的singletons OTU及其代表序列。

1.5.2 生物信息學(xué)分析

物種分類學(xué)注釋利用QIIME2 (2019.4) 軟件和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù) (Release 8.0,https://unite.ut.ee/)。采用 QIIME2的 classify-sklearn算法 (https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier)，對(duì)每個(gè) OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)行物種注釋。使用去除singleton后的OTU特征表，實(shí)現(xiàn)各樣本在門(mén)和屬分類水平上的組成分布的可視化，并以柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。在每個(gè)樣本中篩選序列數(shù)＞5的OTU，將這些OTU的代表序列與nr/nt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，將同一樣本篩選出的代表序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度最高的序列利用MEGA7 (v7.0.26) 共同構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)，并以每個(gè)樣本篩選出的OTU對(duì)應(yīng)的全部序列數(shù)占總序列數(shù)比例作柱狀圖來(lái)呈現(xiàn)各樣本在種水平上的主要物種的組成分布。

利用QIIME2 (2019.4) 對(duì)OTU的豐度表進(jìn)行抽平，抽平深度設(shè)為最低樣本序列量的95%。通過(guò)對(duì)抽平后的OTU表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得每個(gè)樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成表。利用QIIME2 (2019.4) 進(jìn)行Alpha多樣性以及稀釋曲線分析，利用R腳本的VennDiagram包繪制OTU的Venn圖。

1.6 中國(guó)玉米穗腐病致病菌分布分析

從30篇已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取中國(guó)21個(gè)省份(包含全部玉米主產(chǎn)區(qū)) 的5 483個(gè)穗腐病致病菌的分離鑒定結(jié)果[2-3,9-17,19-20,29-45]，計(jì)算每種致病菌在各省份于全部致病菌中所占比例，并繪制餅狀圖；利用 ArcMap (v10.1) 進(jìn)行 IDW (Inverse Distance Weighted) 空間插值分析，分析主要致病菌在中國(guó)各地區(qū)的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定和致病性測(cè)定結(jié)果

2019年從云南省楚雄彝族自治州祿豐縣采集玉米感病樣本，病穗呈現(xiàn)出腐爛狀，患病部位籽粒腐爛，葉片表面可見(jiàn)白色菌絲體 (圖1a)。從多個(gè)玉米樣本患病部位 (籽粒和穗軸) 分離純化獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上18 ℃培養(yǎng)14 d，菌落平均直徑為31 mm，菌絲呈絲絨狀，在培養(yǎng)過(guò)程中菌落表面逐漸由白色變?yōu)榛易仙?(圖2a)，培養(yǎng)基背面從無(wú)色變?yōu)槌赛S色、紫色，最終接近黑色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，小型分生孢子數(shù)量多，多鏈生，呈橢圓形或卵形，6～9 μm× 2.5～3 μm；無(wú)厚垣孢子；產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶?；驈?fù)瓶梗 (圖 2c,d)。經(jīng)與郭成[2]，丁夢(mèng)軍[11]，張婷[40]以及許佳寧[31]的鑒定結(jié)果比較，其形態(tài)各項(xiàng)指標(biāo)與擬輪枝鐮孢菌相符。

圖1 玉米穗腐病的田間采樣標(biāo)本 (a)，致病性測(cè)定中表現(xiàn)出的穗部腐爛和籽粒、穗軸上的菌落 (b-d)

將分離得到的菌株接種于同一品種玉米的穗、籽粒和穗軸后，在穗部出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象 (圖1b)，籽粒上在接種部位沿籽粒間縫隙出現(xiàn)白色絮狀帶紫紅色的菌落 (圖1c)，穗軸出現(xiàn)紫紅色粉狀菌落 (圖1d)，與采集樣本癥狀相似。將這些菌落中的菌株再次分離接種于PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后所得菌落形態(tài)與之前分離的菌株一致 (圖2b)，可以認(rèn)定為同種致病菌。因此，可以確認(rèn)分離得到了導(dǎo)致樣本玉米發(fā)生穗腐病的主要致病菌。

圖2 分離菌株 (a) 和致病性測(cè)定中再次分離菌株 (b) 在PDA平板上的菌落形態(tài)，光學(xué)顯微鏡下小孢子 (c)以及產(chǎn)孢細(xì)胞 (d) 形態(tài)

2.2 序列過(guò)濾與質(zhì)量控制

4 個(gè)樣本 (B1、B2、Z1、Z2) 總體高質(zhì)量序列數(shù)目比例達(dá)75.80%，在97%相似度水平對(duì)高質(zhì)量序列聚類，總共得到150個(gè)OTU (表1)。單個(gè)樣本中有效序列豐度大于1%的OTU數(shù)目較少，分別是6(B1)、7 (B2)、4 (Z1)、4 (Z2)。4 個(gè)樣本的覆蓋度都達(dá)到了0.994以上，稀釋曲線 (圖3a)、Simpson曲線(圖3b) 及Shannon 曲線 (圖3c) 均顯示曲線已經(jīng)趨于最大值并達(dá)到平坦，表明樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，已經(jīng)包含了幾乎所有的序列多樣性，足夠反映4個(gè)樣本中絕大部分待測(cè)真菌物種的遺傳信息。除Z1的OTU數(shù)目較少外，B1、B2和Z2的OTU數(shù)目沒(méi)有顯著性差異；但是Z1和Z2的序列豐度大于1%的OTU均少于B1和B2，說(shuō)明玉米籽?；疾〔课槐人胼S患病部位主體菌群的多樣性更低。

表1 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的序列信息

圖3 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的稀釋曲線 (a)、Simpson 曲線 (b)、Shannon 曲線 (c) 和Pielou’s evenness曲線 (d)

2.3 主要致病菌及其共生真菌群落主成分分析

由主成分分析 (principal component analysis,PCA) 可知 (圖4a)，取自患病籽粒的樣本Z1和Z2距離接近，和取自患病穗軸的樣本B1、B2距離較遠(yuǎn)，且B1和B2間距離較遠(yuǎn)。上述情況說(shuō)明患病籽粒處真菌群落相似性高，且與患病穗軸處真菌群落差異較大；而患病穗軸處真菌群落組成可能受所處環(huán)境、位置等因素的影響較大。

圖4 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 基于OTU水平的主要致病菌及其共生真菌群落主成分分析 (a)，以及門(mén) (b) 和屬 (c) 水平的主要致病菌及其共生真菌群落結(jié)構(gòu)

2.4 基于門(mén)、屬水平的主要致病菌及其共生真菌群落結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過(guò)序列相似性大于97%水平上的OTU聚類，所有樣本中可識(shí)別的真菌可分為2個(gè)門(mén) (圖4b)。其中主要為子囊菌門(mén) (Ascomycota)，在B1,B2,Z1,Z2中的豐度分別為 99.842%，87.816%，91.377%，98.418%。擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota) 所占比例極少，只在B1中檢出，豐度為0.070%。

在屬水平上4個(gè)樣本中的真菌共鑒定出19個(gè)屬 (圖4c)。B1中鑒定出15屬，豐度大于1%的有4個(gè)，由大至小依次為毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (76.464%)、鐮孢菌屬 (Fusarium)(19.581%)、籃狀菌屬 (Talaromyces) (1.384%) 以及德巴利酵母菌科 (Debaryomycetaceae Unclassified)(1.068%)。B2中鑒定出15屬，豐度大于1%的有4個(gè)，依次為毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified)(47.468%)、葡萄球菌屬 (Sarocladium) (18.592%)、鐮孢菌屬 (Fusarium) (13.884%) 以及德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (5.736%)。Z1中鑒定出11屬，豐富度大于1%的有3個(gè)，依次為鐮孢菌屬 (Fusarium) (86.313%)、德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (2.413%) 和毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (2.215%)。Z2 中鑒定出15屬，豐富度大于1%的有4個(gè)，依次為鐮孢菌屬 (Fusarium) (64.517%)，德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (23.774%)，毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (7.991%)，以及葡萄球菌屬 (Sarocladium) (1.543%)。

在B1，B2中，毛殼菌科的豐富度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而在Z1，Z2中，鐮孢菌屬的豐富度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。對(duì)于4個(gè)樣本而言，鐮孢菌屬、巴利酵母菌科和毛殼菌科均占優(yōu)勢(shì) (豐度＞1%)。此外，諸如青霉屬(Penicillium)， 糞 殼 菌 綱 (Sordariomycetes Unclassified)，盤(pán)菌亞門(mén) (Leotiomycetes Unclassified)以及子囊菌門(mén) (Leotiomycetes Unclassified) 皆以不同比例 (豐度＜1%) 存在于樣本中。剩余屬則數(shù)目極少 (豐度＜0.1%)。另外也存在部分特殊情況，例如在B1中豐富度較高的籃狀菌屬 (1.384%) 在B2與Z1中豐富度均較低 (豐度＜1%) 甚至不存在于Z2中。

2.5 基于種水平的主要致病菌及其共生真菌群落結(jié)構(gòu)分析

4 個(gè)樣本 (B1、B2、Z1、Z2) 各自篩選出的主要OTU分別在利用ITS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)上 (圖5)與擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides)、彎曲單胞瓶霉 (Phialemonium curvatum)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma caribbica)、Cornuvesica falcata、Sarocladium kiliense、艾米斯托克籃狀菌(Talaromyces amestolkiae) 聚為一群，由此可以將這些OTU對(duì)應(yīng)的全部序列歸入對(duì)應(yīng)的種，計(jì)算各個(gè)種 (主要種) 的相對(duì)比例。根據(jù)4個(gè)樣本中真菌主要種的相對(duì)比例 (圖6)，可以看出真菌主要種在4個(gè)樣本中的存在比較穩(wěn)定。其中擬輪枝鐮孢菌、彎曲單胞瓶霉、季也蒙畢赤酵母在4個(gè)樣本中都有一定量分布；Cornuvesica falcata在除B1 (圖6a) 外的3個(gè)樣本中有一定分布；Sarocladium kiliense在B2和Z2 (圖6b,d) 中有一定分布。特別的是：艾米斯托克籃狀菌僅在來(lái)自玉米穗軸的樣本 (B1,B2)(圖6a,b) 有一定分布；彎曲單胞瓶霉在來(lái)自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) (圖6a,b) 中的相對(duì)比例顯著高于來(lái)自玉米籽粒的樣本 (Z1，Z2) (圖6c,d)；擬輪枝鐮孢菌在來(lái)自玉米籽粒的樣本 (Z1，Z2) (圖6c,d)中的相對(duì)比例顯著高于來(lái)自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) (圖6a,b)。總之，主要種在不同患病部位的真菌群落組成相似，但是相對(duì)比例有較大差異。特別的是，彎曲單胞瓶霉作為在環(huán)境中廣泛分布的單胞瓶霉屬 (Phialemonium) 的一種真菌[46]，在來(lái)自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) 中的豐度高于主要致病菌擬輪枝鐮孢菌，可能由于擬輪枝鐮孢菌的侵染干擾了局部微生物群落平衡導(dǎo)致其在患病部位的大量增殖。

圖5 從穗軸所取菌落樣本B1 (a)、B2 (b) 和從籽粒所取菌落樣本Z1 (c)、Z2 (d) 中主要OTU構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖中相同顏色歸為同一個(gè)種)

圖6 從穗軸所取菌落樣本B1 (a)、B2 (b) 和從籽粒所取菌落樣本Z1 (c)、Z2 (d) 中主要真菌 (種水平) 的相對(duì)比例

2.6 主要致病菌及其共生真菌群落的Alpha多樣性和Venn圖分析

Alpha多樣性指數(shù)可以用來(lái)表征各樣本內(nèi)真菌群落多樣性 (表2)。其中Chao1、Observed species指數(shù)為預(yù)估群落豐度的指數(shù)，數(shù)值越大，則說(shuō)明樣本內(nèi)菌群豐度越高；Simpson、Shannon指數(shù)則用來(lái)表征群落多樣性，指數(shù)越大，群落多樣性越高；以Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度；以 Good’s coverage指數(shù)表征覆蓋度，其數(shù)值越高，則樣品中序列被測(cè)出的概率就越高，檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣本中微生物的真實(shí)情況的代表性越高。

表2 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的Alpha多樣性指數(shù)

Alpha多樣性分析結(jié)果表明，從同一患病部位(籽?；蛩胼S) 獲取的兩個(gè)樣本 (Z1和Z2，B1和B2)間的真菌群落豐度和多樣性都有顯著差異，這可能是取樣位置等因素的不同帶來(lái)的差異；在同一豐度水平 (Chao1、Observed species指數(shù)均接近) 的兩個(gè)樣本B1和Z2之間，Z2的Simpson、Shannon指數(shù)均高于B1，說(shuō)明取自籽?；疾〔课坏恼婢郝涠鄻有愿哂谒胼S，即主要致病菌的共生真菌群落組成在不同患病部位具有差異。

由 Venn圖 (圖 7a)，在 4個(gè)樣本主要的 61個(gè)OTU中，僅有10個(gè)共有OTU，占比為16.39%；除Z1外，Z2、B1、B2分別有 6、8、7個(gè)獨(dú)有 OTU。說(shuō)明不同植株不同患病部位 (籽?；蛩胼S) 的真菌群落組成整體相似度不高。由Venn圖各區(qū)域?qū)偎降腛TU豐度組成 (圖7b) 可以看出，四個(gè)樣本共有OTU豐度最高的為鐮孢菌屬，與主要致病菌為擬輪枝鐮孢菌的結(jié)論相符。

圖7 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 中主要致病菌及其共生真菌群落的Venn圖 (a) 及Venn圖不同區(qū)域的OTU豐度柱狀圖 (b)

2.7 中國(guó)玉米穗腐病主要致病菌的分布

中國(guó)主要玉米產(chǎn)地 (省份) 玉米穗腐病的主要致病菌為鐮孢菌屬，且涉及具體種數(shù)目多 (＞15)，但是大部分僅在有限的地區(qū)零星分布 (圖8a)。其中在較多省份有較高比例的種有 (圖8b-f)：擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides)、串珠鐮孢菌 (Fusarium moniliforme) 、禾谷鐮孢復(fù)合種 (Fusarium graminearumclade)、層出鐮孢菌 (Fusarium proliferatum) 和尖胞鐮孢菌 (Fusarium oxysporum)。擬輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢復(fù)合種在中國(guó)主要玉米產(chǎn)地均有分布；前者在中國(guó)北方和海南省占有優(yōu)勢(shì)地位，后者在山西、陜西、黑龍江、云南等省份占有較大比例。串珠鐮孢菌、層出鐮孢菌和尖胞鐮孢菌在中國(guó)的分布相對(duì)局限；串珠鐮孢菌主要分布于四川省和山西省，層出鐮孢菌主要分布于中國(guó)中部省份，尖孢鐮孢菌主要分布于重慶市和云南省。另外，青霉 (Penicilliumspp)、毛霉 (Rhizomucorspp)、曲霉 (Aspergillusspp)、木霉 (Thichodermaspp) 等也在有限的地區(qū)少量分布。上述結(jié)果表明鐮孢菌屬各種在中國(guó)呈現(xiàn)出一定的區(qū)域性分布趨勢(shì)，總體上擬輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢復(fù)合種在中國(guó)主要玉米產(chǎn)區(qū)占優(yōu)勢(shì)，與之前的結(jié)論一致[9-10,13,33,35-36,44]，但是在中國(guó)北方地區(qū)優(yōu)勢(shì)更明顯；在中國(guó)中部和南方地區(qū)鐮胞菌屬致病種整體多樣性更高，串珠鐮胞菌、層出鐮胞菌等集中分布。

圖8 中國(guó)玉米穗腐病致病菌分布 (a)，以及擬輪枝鐮孢菌 (b)、串珠鐮孢菌 (c)、禾谷鐮孢菌 (d)、尖孢鐮孢菌 (e)、層出鐮孢菌 (f) 在中國(guó)的分布

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和三代測(cè)序群落結(jié)構(gòu)分析鑒定出云南省發(fā)生嚴(yán)重玉米穗腐病害地區(qū)的玉米穗腐病主要致病菌為擬輪枝鐮孢菌，并解析了其共生真菌群落結(jié)構(gòu)。擬輪枝鐮孢菌共生真菌群落多樣性較高但彎曲單胞瓶霉、季也蒙畢赤酵母、Cornuvesica falcata、Sarocladium kiliense、艾米斯托克籃狀菌等少數(shù)真菌在不同患病部位穩(wěn)定存在，可能與其存在穩(wěn)定的互利關(guān)系。另外，鐮孢菌屬優(yōu)勢(shì)種的分布可能與玉米品種和氣候條件有關(guān)[32,42]。本研究通過(guò)搜集到的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雖然擬輪枝鐮孢菌在中國(guó)幾乎所有玉米產(chǎn)區(qū)都可以分離出，但仍有傾向于分布在中國(guó)北方地區(qū) (如遼寧、甘肅等省份)的趨勢(shì)，這與擬輪枝鐮孢菌偏好干燥炎熱的氣候的結(jié)論一致[47]；而其在相對(duì)濕熱的云南省分布并在部分地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重的穗腐病害，可能是當(dāng)?shù)匾赘兴敫〉挠衩灼贩N的廣泛播種和現(xiàn)代發(fā)達(dá)的物流導(dǎo)致其在大范圍地域間遠(yuǎn)距離擴(kuò)散的結(jié)果。除此之外，由于玉米莖腐病和穗腐病致病菌組成高度相似且同源[8,48]，這兩種病害的差異可能是相似的致病菌和共生微生物群落空間分布不同導(dǎo)致的，因此本研究的結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究穗腐病、莖腐病等病害的主要致病菌和其共生群落組分間的互作奠定了基礎(chǔ)，并對(duì)玉米穗腐病、莖腐病等病害在云南當(dāng)?shù)啬酥寥珖?guó)的防治工作以及相應(yīng)抗病玉米的選育有指導(dǎo)意義。