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      缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化*

      2022-03-23 07:04:52張曉涵遲淑娜徐征鵬
      西部醫(yī)學(xué) 2022年3期
      關(guān)鍵詞:細(xì)胞系低氧結(jié)果顯示

      張曉涵 遲淑娜 徐征鵬

      (濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院婦科腫瘤,山東 煙臺(tái) 264000)

      宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率和致死率僅次于乳腺癌,嚴(yán)重危害著女性健康。隨著宮頸癌危險(xiǎn)因素暴露的增加,宮頸癌發(fā)病率逐年增高且呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程復(fù)雜,涉及多種病理過(guò)程,侵襲和轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者死亡的主要原因[3-4]。宮頸癌患者的預(yù)后與腫瘤是否浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用尤為重要[5-6]。EMT是一個(gè)涉及上皮細(xì)胞極化的生物學(xué)過(guò)程,可使細(xì)胞呈間充質(zhì)細(xì)胞表型,同時(shí)賦予細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡等能力以及ECM(細(xì)胞外基質(zhì))成分的產(chǎn)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),低氧微環(huán)境會(huì)改變腫瘤細(xì)胞的代謝方式,誘導(dǎo)細(xì)胞代謝發(fā)生適應(yīng)性變化,并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)和代謝通路,此外,低氧微環(huán)境還可通過(guò)上調(diào)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子激活與EMT信號(hào)通路,從而誘發(fā)EMT[9]。Netrin-1是最早在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的可溶性神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子,在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移,具有調(diào)控血管生成和類似血管表皮生長(zhǎng)因子的作用[10]。Netrin-1還被視為致癌基因, 促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),在許多腫瘤組織中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),Netrin-1能促進(jìn)結(jié)直腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。但目前Netrin-1是否在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT中發(fā)揮作用文獻(xiàn)鮮少?;诖耍狙芯吭噲D探究Netrin-1在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT中的作用及其機(jī)制,為宮頸癌治療提供新的策略。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑 人正常上皮細(xì)胞HaCaT(CL-0090)及人宮頸癌細(xì)胞系CasKi(CL-0048)購(gòu)自Procell公司,人宮頸癌細(xì)胞系SiHa(TCHu113)、Hela(TCHu187)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。二氧化鈷購(gòu)自廣州金華大化學(xué)試劑公司,胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司,DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,胰酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,Primescript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京智杰遠(yuǎn)科技有限公司,qPCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。Netrin-1敲低載體Si-Netrin-1 (siRNA-Netrin-1)、Si-NC (siRNA-negative control) 等由吉瑪基因公司負(fù)責(zé)構(gòu)建,Lipofectamine 2000購(gòu)自日本TaKaRa公司,一抗GAPDH(5174)、E-cadherin(14472)、Vimentin(5741)、AKT(4691)、p-AKT(4060)均購(gòu)自CST公司,Netrin-1(ab126729) 購(gòu)自Abcam公司。羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自武漢博士德公司,ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Hela,人正常上皮細(xì)胞HaCaT用DMEM(含10%FBS)培養(yǎng)基,人宮頸癌細(xì)胞系CasKi用RPMI-1640(含10%FBS)培養(yǎng)基,置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)備用。細(xì)胞分為常氧組和低氧組,低氧組應(yīng)用二氧化鈷處理,終濃度為150 μmol/L,常氧組應(yīng)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

      1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰酶消化、計(jì)數(shù),然后接種于6孔板,培養(yǎng)24 h以備轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染Si-NC、Si-Netrin-1至SiHa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果,并通過(guò)qPCR和蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

      1.4 qPCR檢測(cè)Netrin-1的表達(dá) 采用TRIzol一步法分別提取待測(cè)細(xì)胞中總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度,隨后采用Primescript RT試劑逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA),取1 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板行qPCR,反應(yīng)體系(20 μL)為:2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix、0.4 μL ROX Reference Dye、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、6 μL ddH2O。預(yù)變性95℃、5 min,94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸 1 min,循環(huán)45次后進(jìn)行終延伸完成PCR。采用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因Netrin-1表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參,引物序列見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

      表1 qPCR引物序列

      1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Netrin-1、E-cadherin、Vimentin、AKT等蛋白表達(dá)水平 胰酶消化人宮頸癌細(xì)胞,離心5 min,PBS溶液洗滌,棄上清,重復(fù)3次。提取各組細(xì)胞總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白條帶,用電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過(guò)夜;次日,TBST洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h;TBST洗滌3次后加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影,然后在凝膠成像儀上觀察拍照。

      1.6 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞,按5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)皿底部細(xì)胞融合率達(dá)90%,用200 μL槍頭垂直于細(xì)胞平面劃“十”字,PBS清洗細(xì)胞2次,更換培養(yǎng)液,24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察相同位置劃痕愈合情況并拍照。

      1.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力 取24孔板,置入Transwell小室,用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋Matrigel(體積稀釋比例為1∶8),每個(gè)小室的上室內(nèi)加入50 μL稀釋后的Matrigel,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜;次日取出小室,吸出上室和下室內(nèi)剩余的培養(yǎng)液;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞消化離心,用PBS洗滌細(xì)胞2次,用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,在每個(gè)小室上室內(nèi)加入3×104個(gè)細(xì)胞/200 μL的細(xì)胞懸液,下室內(nèi)加入500 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室,用棉簽將上室底部的細(xì)胞擦拭掉,用PBS洗滌小室底面3次,4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞,再次PBS洗滌小室底面3次,1%結(jié)晶紫染色30 min,光學(xué)顯微鏡(Nikon TS100,日本Nikon公司產(chǎn)品)下觀察并拍照。

      1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,采用GraphPad 7.0軟件進(jìn)行相關(guān)圖片繪制。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系中呈高表達(dá) qPCR結(jié)果顯示,相對(duì)于正常人上皮細(xì)胞HaCaT,Netrin-1基因在宮頸癌細(xì)胞系SiHa(P<0.001)、Caski(P<0.01)、Hela(P<0.01)中均高表達(dá)(圖1A)。Western Blot結(jié)果顯示,相對(duì)于正常人上皮細(xì)胞HaCaT,Netrin-1蛋白表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski、Hela中明顯升高(圖1B),且在細(xì)胞系SiHa、Caski中表達(dá)水平較高,并選取SiHa、Caski細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。上述結(jié)果表明,Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞中異常高表達(dá),可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

      圖1 Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞株中高表達(dá)

      2.2 低氧條件下SiHa、Caski經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程 Western Blot結(jié)果顯示,相對(duì)于常氧組,低氧組SiHa、Caski細(xì)胞中的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin顯著下調(diào),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin顯著上調(diào)(圖2A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于常氧組,宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski在低氧條件下顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞侵襲能力(圖2B)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件下?lián)碛斜瘸Q踅M更快的細(xì)胞損傷愈合能力(圖2C)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)時(shí)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin下調(diào),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin上調(diào),細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

      圖2 低氧條件下SiHa、Caski經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程

      2.3 低氧條件下誘導(dǎo)Netrin-1在SiHa、Caski細(xì)胞中表達(dá)升高 Western Blot結(jié)果顯示,相對(duì)常氧組,SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件培養(yǎng)24 h后Netrin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3A)。qPCR檢測(cè)SiHa、Caski細(xì)胞中Netrin-1表達(dá)結(jié)果顯示,相對(duì)于常氧組,Netrin-1基因在在低氧組被顯著上調(diào)(圖3B)。上述結(jié)果表明,SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件培養(yǎng)24 h后,Netrin-1在基因及蛋白水平顯著上調(diào)(均P<0.01)。

      圖3 低氧誘導(dǎo)條件下Netrin-1在SiHa、Caski細(xì)胞中表達(dá)升高

      2.4 敲低Netrin-1抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力 Western Blot結(jié)果顯示,相對(duì)于Control組,Netrin-1在SiHa細(xì)胞中被成功敲低(圖4A)。并且發(fā)現(xiàn)在低氧條件下敲低Netrin-1可以顯著上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin被顯著下調(diào)(P<0.05、P<0.001,圖4B)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低Netrin-1基因,可以抑制低氧條件下SiHa細(xì)胞的侵襲能力(圖4C)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于Control組,Netrin-1敲低組細(xì)胞損傷愈合能力顯著減弱(圖4D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力。

      圖4 敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力

      2.5 敲低Netrin-1常氧組SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化 Western Blot結(jié)果顯示,敲低Netrin-1,常氧組SiHa細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著性變化(圖5A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,常氧培養(yǎng)條件下,與Control組和Si-NC組相比,Si-Netrin-1組細(xì)胞的侵襲能力無(wú)顯著性改變(P>0.05,圖5B)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Netrin-1基因的敲低,對(duì)SiHa細(xì)胞的遷移能力無(wú)顯著影響(圖5C)。上述結(jié)果表明,常氧培養(yǎng)條件下敲低Netrin-1,SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

      圖5 敲低Netrin-1正常氧氣組SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化

      2.6 缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 Western Blot結(jié)果顯示,相對(duì)于常氧組,低氧條件下AKT蛋白表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中沒(méi)有變化(P>0.05),但是其磷酸化形式p-AKT顯著升高,當(dāng)在低氧條件下敲低Netrin-1,p-AKT水平卻被顯著下調(diào)(P<0.05, 圖6A)。正常氧氣培養(yǎng)條件下,在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中敲低Netrin-1對(duì)AKT蛋白及其磷酸化形式p-AKT沒(méi)有顯著性影響(P>0.05,圖6B)。上述結(jié)果表明,在正常氧氣培養(yǎng)條件下,敲低Netrin-1對(duì)PI3K/AKT通路沒(méi)有影響,但是在低氧條件下,敲低Netrin-1可以抑制PI3K/AKT通路的激活。

      圖6 缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

      3 討論

      侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征,宮頸癌患者的不良預(yù)后與侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān),轉(zhuǎn)移以直接侵犯和淋巴轉(zhuǎn)移為主,晚期可轉(zhuǎn)移到肺、腎等[13]。EMT作為上皮源性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要步驟,與腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等癌細(xì)胞中,從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的表型改變?cè)谵D(zhuǎn)移過(guò)程中起決定性作用[14-15]。盡管在診斷和篩查技術(shù)以及疫苗的使用方面有所改進(jìn),宮頸癌仍然是全世界女性與癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。具有EMT表型的原發(fā)性宮頸癌顯示出腫瘤進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮完整性畸變[16]。缺氧是宮頸癌和其他類型癌癥患者不良臨床預(yù)后有力且獨(dú)立的指標(biāo),研究人員發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)的蛋白質(zhì)組的變化可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT而增加了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。這些變化伴隨著間質(zhì)標(biāo)記Vimentin的上調(diào)以及上皮標(biāo)記E-cadherin的下調(diào),表明缺氧條件下宮頸癌細(xì)胞中EMT的發(fā)生。本研究證明宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski經(jīng)含有二氧化鈷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞中E-cadherin被顯著下調(diào),Vimentin被顯著上調(diào),證實(shí)發(fā)生了EMT,同時(shí)遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng),表明低氧誘導(dǎo)SiHa、Caski發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并且提高了宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

      Netrin-1是Netrin家族中最有特色的配體,是一種高度保守的可溶性蛋白,越來(lái)越多的證據(jù)表明,Netrin-1不僅參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[18],而且在多種人類癌癥細(xì)胞中高表達(dá),如Netrin-1在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),并在低氧條件下,通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲;在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá),通過(guò)UNC5A受體激活NF-κB促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[19];Netrin-1通過(guò)EMT增強(qiáng)細(xì)胞侵襲、遷移和血管生成模擬物,從而引發(fā)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移潛力。本研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于正常上皮細(xì)胞,Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski、Hela中均顯著過(guò)表達(dá)。并且經(jīng)低氧條件處理后,細(xì)胞內(nèi)Netrin-1蛋白表達(dá)水平提高,敲低Netrin-1可抑制由低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT過(guò)程,并使細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低;而在常氧條件下,敲低Netrin-1對(duì)細(xì)胞EMT過(guò)程及侵襲轉(zhuǎn)移能力沒(méi)有明顯影響。這表明Netrin-1在低氧誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控功能,促進(jìn)細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。

      在低氧微環(huán)境中細(xì)胞因子、趨化因子、G蛋白偶聯(lián)受體等可激活 PI3K/ AKT/MTOR、MAPK和NF-κB信號(hào)通路。PI3K/ AKT/MTOR 信號(hào)通路在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中處于高活性狀態(tài),也正是因?yàn)檫@條通路的激活,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。研究表明FAK是Netrin-1的重要下游分子,可在磷酸肌醇3激酶(PI3K)/ AKT和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中相互作用,從而誘導(dǎo)EMT[20]。此外,在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷中,Netrin-1介導(dǎo)的Schwann 細(xì)胞遷移與p38 MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)低氧誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞中AKT蛋白水平不變,p-AKT水平增加,PI3K/AKT通路被激活,在宮頸癌細(xì)胞SiHa中敲低Netrin-1后,p-AKT恢復(fù)到原來(lái)水平,AKT通路激活效應(yīng)被抑制。而在正常氧氣條件下,敲低Netrin-1對(duì)PI3K/AKT通路沒(méi)有明顯影響。從而證實(shí)了低氧條件下Netrin-1通過(guò)PI3K/AKT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。

      4 結(jié)論

      Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系中異常高表達(dá),并且低氧條件可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞中Netrin-1的表達(dá)升高,從而激活PI3K/AKT通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

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