楊奇濤,吳殷囡,汪玉馨,孟長(zhǎng)虹,宗衛(wèi)峰,陸益紅,史清水?

(1.中國(guó)藥科大學(xué),南京 211198;2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,南京 210019;3.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室,江蘇 徐州 221004)

類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)有皮疹、瘙癢、蕁麻疹、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、胸悶、呼吸困難、血壓下降以及過(guò)敏性休克等,與I型過(guò)敏反應(yīng)相似,容易混淆,其發(fā)生于首次給藥后30min內(nèi),無(wú)需IgE介導(dǎo)[1-2]。骨肽類(lèi)制劑為多組分生化藥,以豬或牛的四肢骨提取物制成,或與全蝎提取物混合制成復(fù)方骨肽制劑,成分包括活性肽、肽類(lèi)活性因子、有機(jī)鈣、磷、無(wú)機(jī)鈣、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、氨基酸等[3-4]。臨床該制劑主要通過(guò)靜脈注射或肌肉注射給藥,用于骨折、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[5-6]。國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心在《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》中對(duì)骨肽和復(fù)方骨肽注射劑的安全問(wèn)題進(jìn)行了通報(bào)[7]。近年來(lái),對(duì)骨肽類(lèi)注射劑不良反應(yīng)病例分析發(fā)現(xiàn),其不良反應(yīng)的臨床表現(xiàn)有過(guò)敏性休克、皮疹、瘙癢、胸悶、心慌、呼吸困難、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、等過(guò)敏性反應(yīng),還包括消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的損害[8]。骨肽類(lèi)注射劑的不良反應(yīng)中,給藥30min內(nèi)發(fā)生的不良反應(yīng)占比較多(40%以上)[9]。由于前期本課題組采用全身主動(dòng)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)法對(duì)骨肽類(lèi)注射劑的過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果均為陰性,故在本研究進(jìn)一步采用類(lèi)過(guò)敏相關(guān)模型考察骨肽類(lèi)注射劑與類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的相關(guān)性,對(duì)骨肽類(lèi)制劑的臨床安全用藥及其不良反應(yīng)的闡述和發(fā)生機(jī)制研究具有重要意義。

類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制在體內(nèi)較為復(fù)雜,可能與補(bǔ)體系統(tǒng)或膜表面受體介導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放活性物質(zhì),導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加有關(guān)[10]。在此基礎(chǔ)上,細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)、大鼠藍(lán)斑皮膚實(shí)驗(yàn)、小鼠耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)等方法在類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)研究中有相關(guān)報(bào)道[11-13]。其中小鼠耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)由類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)與伊文思藍(lán)(evans blue,EB)混合經(jīng)靜脈注射入體內(nèi)后,EB迅速與血漿蛋白結(jié)合,在類(lèi)過(guò)敏相關(guān)物質(zhì)影響下,體內(nèi)毛細(xì)血管通透性增加,導(dǎo)致EB隨血漿蛋白滲出血管,表現(xiàn)為小鼠耳廓藍(lán)染[14],該檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便,但在陽(yáng)性藥物選擇與劑量、實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)未有明確的標(biāo)準(zhǔn),因此,本課題通過(guò)陽(yáng)性藥篩選,建立了適宜的陽(yáng)性模型,并將其用于骨肽類(lèi)注射劑的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠246只,體重20～22g,5～6周齡,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院屏障系統(tǒng)內(nèi)[SYXK(蘇)2019-0047],本研究經(jīng)江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審批(JSIFDC2020-04),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

骨肽注射液(企業(yè)A、B、C)、復(fù)方骨肽注射液(企業(yè)A、D)、骨肽氯化鈉注射液(企業(yè)E)、注射用骨肽(企業(yè)E、F)、注射用骨瓜提取物(企業(yè)G、H)、骨瓜提取物注射液(企業(yè)I、H);磷酸組胺(中國(guó)食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,批號(hào):150510-201313);組胺(北京百靈威科技有限公司,批號(hào):LK90T46);組胺二鹽酸鹽(德國(guó)LGC公司,批號(hào):G165368);0.9%氯化鈉溶液(中國(guó)大冢制藥有限公司、批號(hào):8J95D4);伊文思藍(lán)(上海Sigma-Aldrich公司,批號(hào):MKCF0851);甲酰胺(上海Sigma-Aldrich公司,批號(hào):94024020)。

XP6型/XS205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);Synergy H1多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)博騰Bio Tek公司);XiangYi L-550低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

(1)溶液配制

天平稱(chēng)取EB2g,溶解于100mL0.9%氯化鈉溶液,超聲10～15min,直至充分溶解,然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到2% EB溶液,用于配制含EB的各組藥液。

陰性對(duì)照組:含0.16% EB的0.9%氯化鈉溶液。

陽(yáng)性對(duì)照組:高劑量組:(1)組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,配制成濃度為1mg/mL(含0.16%EB)的溶液;(2)磷酸組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制含組胺1mg/mL(含0.16% EB)的溶液;(3)組胺鹽酸鹽:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制成含組胺1 mg/mL(含0.16% EB)的溶液;低劑量組:(1)組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,配制成濃度為0.5mg/mL(含0.16% EB)的溶液;(2)磷酸組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制為含組胺0.5mg/mL(含0.16% EB)的溶液。

樣品組:高劑量組:骨肽類(lèi)注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為5mg/mL(含0.16%EB)的藥液。中劑量組:骨肽類(lèi)注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為2.5mg/mL(含0.16%EB)的藥液。低劑量組:骨肽類(lèi)注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為1mg/mL(含0.16%EB)的藥液。骨肽氯化鈉注射液的原液濃度為1 mg/mL故實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了1mg/mL與0.5mg/mL兩個(gè)劑量組。

(2)實(shí)驗(yàn)分組

小鼠按照體重隨機(jī)分組,每組6只,每只小鼠尾靜脈給予0.5mL藥液。陰性對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液(含0.16% EB);陽(yáng)性對(duì)照組,分別給予高劑量及低劑量的組胺(含0.16% EB)、磷酸組胺(含0.16% EB)、組胺鹽酸鹽(含0.16% EB);樣品組,分別給予相應(yīng)的高、中、低劑量含0.16% EB的樣品溶液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)選擇

(1)小鼠耳廓藍(lán)染率測(cè)定

給藥30min后處死小鼠。觀察并記錄各組出現(xiàn)耳廓藍(lán)染色的動(dòng)物數(shù)量,計(jì)算各組耳廓藍(lán)染的發(fā)生率。

(2)小鼠耳廓EB滲出量測(cè)定

EB標(biāo)準(zhǔn)曲線配制:將10mg EB溶于10mL甲酰胺中,配制得濃度為1mg/mL的備用溶液。取200μL備用溶液用20mL甲酰胺稀釋得到濃度為10μg/mL的工作液。

觀察并記錄小鼠的耳廓藍(lán)染情況后,處死并立即沿耳根部剪去雙耳后,剪成小塊,用2mL甲酰胺浸沒(méi),室溫浸泡48h,提取耳廓中滲出EB染料,各組雙耳EB滲出量及升高率的測(cè)定:浸泡48h后離心15min,轉(zhuǎn)速為3000r/min。在96孔培養(yǎng)板中加入200μL各組上清液,以等量甲酰胺作為空白對(duì)照,用酶標(biāo)儀在620nm下測(cè)定吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EB含量,將其換算2mL甲酰胺中所含有EB染料的總滲出量,并計(jì)算EB升高率。EB升高率=(給藥組EB含量-陰性對(duì)照組EB含量)/陰性對(duì)照組EB含量×100%。

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:a:耳廓藍(lán)染發(fā)生率≥30%;b:耳廓EB升高率≥50%。以上2項(xiàng)條件均符合時(shí),類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)判斷為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性模型的建立

利用3種組胺標(biāo)準(zhǔn)品(磷酸組胺、組胺、組胺鹽酸鹽)建立陽(yáng)性模型,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組高低劑量陽(yáng)性對(duì)照組藍(lán)染發(fā)生率均為100%,同時(shí)其EB滲出量相比陰性對(duì)照組都明顯升高且升高率大于50%,類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)均判定為陽(yáng)性(圖1)?？紤]到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中靜脈注射高劑量組胺鹽酸鹽,30min內(nèi)小鼠存在呼吸加快、輕微抽搐等情況,無(wú)法判定類(lèi)過(guò)敏的產(chǎn)生是否由組胺鹽酸鹽引起,因此在低劑量考察時(shí),未將其納入考察對(duì)象。比較了低劑量組胺與磷酸組胺的類(lèi)過(guò)敏結(jié)果發(fā)現(xiàn),磷酸組胺的藍(lán)染情況與EB升高率更為明顯,且低劑量下的EB升高率與其高劑量組相差不大。綜上,后期選擇低劑量的磷酸組胺作為骨肽類(lèi)注射劑類(lèi)過(guò)敏考察的陽(yáng)性對(duì)照模型藥物。

圖1 陽(yáng)性模型典型耳廓藍(lán)染圖(高劑量組)Figure1 Typical ear blue staining of positive model(High-dose group)

表1 不同劑量的陽(yáng)性對(duì)照的耳廓藍(lán)染結(jié)果(n=6)Table1 Ear blue staining results of different doses of positive control

2.2 骨肽類(lèi)注射液類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的考察

根據(jù)骨肽注射液及復(fù)方骨肽注射液的臨床用藥濃度,設(shè)置高劑量組藥液濃度為5mg/mL;中劑量組藥液濃度為2.5mg/mL;低劑量組藥液濃度為1 mg/mL。綜合比較了骨肽類(lèi)注射液在小鼠耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)中觀察記錄的耳廓藍(lán)染發(fā)生率及計(jì)算所得的EB升高率(見(jiàn)表2)。高劑量(5mg/mL)下,不同企業(yè)間骨肽類(lèi)注射液引起的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)具有一定差異,企業(yè)B骨肽注射液的EB升高率大于50%,企業(yè)A骨肽注射液和復(fù)方骨肽注射液、企業(yè)D復(fù)方骨肽注射液的EB升高率大于50%且大于陽(yáng)性對(duì)照組,以上各組藍(lán)染發(fā)生率均大于30%,故類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)均呈陽(yáng)性;企業(yè)C骨肽注射液EB升高率低于50%且無(wú)藍(lán)染發(fā)生,類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)呈陰性。中劑量(2.5mg/mL)下,企業(yè)A骨肽注射液和復(fù)方骨肽注射液、企業(yè)B骨肽注射液、企業(yè)D復(fù)方骨肽注射液的EB升高率相均大于50%,同時(shí)藍(lán)染發(fā)生率也大于30%,上述企業(yè)的制劑類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)仍呈陽(yáng)性;其余骨肽類(lèi)注射液結(jié)果判定為陰性。在低劑量(1mg/mL)下,上述部分制劑小鼠藍(lán)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然EB升高率大于50%,藍(lán)染發(fā)生率均低于30%,各組結(jié)果判定均呈陰性。(見(jiàn)圖2、圖3)。

圖2 不同企業(yè)的骨肽類(lèi)注射液耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)EB升高率Figure2 Rising rate of EB in ear blue staining experiment of osteopeptide injections from different companies

表2 不同企業(yè)的骨肽類(lèi)注射液的耳廓藍(lán)染結(jié)果(n=6)Table2 Results of ear blue staining experiments of osteopeptide injections from different companies

圖3 不同企業(yè)的骨肽注射液典型耳廓藍(lán)染圖(高劑量組)Figure3 Typical ear blue staining pictures of osteopeptide injections from different companies(High-dose group)

2.3 其他骨肽類(lèi)注射劑類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的考察

骨肽注射液與復(fù)方骨肽注射液是臨床上使用較多的骨肽類(lèi)注射劑,除此之外還有多種其他的骨肽類(lèi)注射劑,因此我們還利用小鼠耳廓藍(lán)染模型考察了骨肽氯化鈉注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液及注射用骨瓜提取物的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)(見(jiàn)表3)。高劑量下,除了企業(yè)E的骨肽氯化鈉注射液與企業(yè)I的骨瓜提取物注射液,其余5個(gè)骨肽類(lèi)注射劑EB升高率均大于50%,且藍(lán)染發(fā)生率大于30%,其中企業(yè)G、H的注射用骨瓜提取物與企業(yè)F的注射用骨肽EB升高率明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組,故類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)呈陽(yáng)性。中劑量下,企業(yè)G、H的注射用骨瓜提取物與企業(yè)H的骨瓜提取物注射液EB升高率均大于50%,且藍(lán)染發(fā)生率大于30%,類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)判斷仍為陽(yáng)性,其余四組判定結(jié)果為陰性。在低劑量下,上述部分制劑小EB升高率雖然大于50%,但各組的藍(lán)染發(fā)生率均低于30%,因此結(jié)果判定均呈陰性。(見(jiàn)圖4、圖5)。

圖4 不同企業(yè)的其他骨肽類(lèi)注射劑耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)EB升高率Figure4 Rising rate of EB in ear blue staining experiment of other osteopeptide injections from different companies

圖5 不同企業(yè)的其他骨肽類(lèi)注射劑典型耳廓藍(lán)染圖(高劑量組)Figure5 Typical ear blue staining pictures of other osteopeptide injections from different companies(High-dose group)

表3 不同企業(yè)的其他骨肽類(lèi)注射劑的耳廓藍(lán)染結(jié)果(n=6)Table3 Results of ear blue staining experiments of other osteopeptide injections from different companies

3 討論

根據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示[9,15],大部分的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)于給藥30min內(nèi)發(fā)生,故小鼠耳廓藍(lán)染實(shí)驗(yàn)中,將給藥時(shí)間設(shè)為30min,觀察耳廓藍(lán)染情況,以與臨床不良反應(yīng)相關(guān)。同時(shí)本研究分析了制劑臨床用藥濃度與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)濃度的相關(guān)性。

骨肽注射液與復(fù)方骨肽注射液是常用的骨肽類(lèi)注射劑,臨床上常作為骨折、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療或輔助治療藥物。骨肽注射液(臨床用藥劑量為1.67mg/kg)給藥濃度由高到低折算后分別為臨床用藥劑量的8.33倍、4.17倍、1.67倍;復(fù)方骨肽注射液(臨床用藥劑量為2.5 mg/kg)的給藥濃度由高到低依次為臨床用藥濃度的5.5倍、2.75倍、1.1倍。結(jié)果表明,高、中劑量下,僅1批骨肽注射液呈陰性反應(yīng);低劑量下均呈陰性反應(yīng),藍(lán)染發(fā)生率均低于30%,但有2批骨肽注射液的EB升高率大于50%。

為了更好地評(píng)價(jià)骨肽類(lèi)注射劑的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)性,利用小鼠耳廓藍(lán)染模型對(duì)其他骨肽類(lèi)注射劑(骨肽氯化鈉注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物)進(jìn)行類(lèi)過(guò)敏評(píng)價(jià)。注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物的臨床劑量都為1.67mg/kg,其給藥濃度由高到低折算后分別為臨床用藥劑量的8.33倍、4.17倍、1.67倍,與骨肽注射液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,在高、中劑量下多數(shù)給藥組存在不同程度的類(lèi)過(guò)敏陽(yáng)性情況,而在低劑量下類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)均判定為陰性;而骨肽氯化鈉注射液在原液濃度下類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)呈陰性。

結(jié)合近年對(duì)藥物的類(lèi)過(guò)敏研究[16],在1倍臨床用藥劑量下,清開(kāi)靈注射液、生脈注射液、魚(yú)腥草注射液等均未呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),但清開(kāi)靈注射液在2倍臨床劑量下、生脈注射液在1.67倍臨床劑量有輕微的類(lèi)過(guò)敏陽(yáng)性反應(yīng)。骨肽注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物在臨床劑量的4.17倍與復(fù)方骨肽注射液在臨床劑量的2.75倍即呈有不同程度的陽(yáng)性反應(yīng),故骨肽類(lèi)注射劑可能存在類(lèi)過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)。此外,類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)具有明顯的量效關(guān)系,單位時(shí)間內(nèi)給予的藥物濃度越高,類(lèi)過(guò)敏發(fā)生的可能性越高,且程度逐漸加重[17-18];而骨肽類(lèi)注射劑的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)也存在一定的量效關(guān)系,與之相符。因此骨肽類(lèi)注射劑在臨床用藥時(shí)應(yīng)注意用藥濃度以及需要觀察患者用藥后的身體情況。

骨肽類(lèi)注射劑的臨床不良反應(yīng)多發(fā)生于給藥后30min,而在患者持續(xù)給藥期間也會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏樣反應(yīng)[9]。此外,胡青[19]發(fā)現(xiàn)骨肽類(lèi)注射劑的臨床不良反應(yīng)與患者的給藥量、基礎(chǔ)病史、過(guò)敏史等諸多因素相關(guān),故骨肽類(lèi)注射劑的過(guò)敏樣反應(yīng)可能與類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)與過(guò)敏反應(yīng)均有關(guān)。本研究采用小鼠耳廓藍(lán)染模型,通過(guò)觀察小鼠首次給予骨肽類(lèi)注射劑后的耳廓藍(lán)染情況,考察骨肽類(lèi)注射劑的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng),而對(duì)于骨肽注射劑的過(guò)敏反應(yīng)需要采用相關(guān)模型進(jìn)一步考察。綜上,骨肽類(lèi)注射劑的類(lèi)過(guò)敏評(píng)估對(duì)其不良反應(yīng)研究具有重要意義,也為臨床用藥給藥濃度的選擇、速度的控制,用藥安全的保障提供參考和依據(jù)。