孫 悅,戴求仲，蔣桂韜，黃 璇，李 闖，鄧 萍，孫 濤

(1. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131； 3. 珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點實驗室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541006，4. 湖南省家禽安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心, 湖南 長沙 410128)

腸道是動物體內(nèi)的消化器官和最大免疫器官，在維持正常營養(yǎng)代謝、免疫防御等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。動物腸道中共生著一個龐大而復(fù)雜的微生物群落，主要是細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌等，這些微生物與宿主協(xié)同進(jìn)化，互相依存，對保障宿主機(jī)體穩(wěn)態(tài)和健康方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。飼糧類型及其粗纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)素可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成[6]，但目前關(guān)于飼糧成分對腸道菌群影響的研究主要集中在粗纖維、粗蛋白質(zhì)水平等方面，飼糧氨基酸成分及水平對腸道菌群影響的研究較少。研究表明，飼糧中氨基酸含量增加對腸道健康具有調(diào)節(jié)作用，可減少腸黏膜萎縮[7]，維持腸道微生物菌群平衡[8]。

支鏈氨基酸(BCAAs)在動物體內(nèi)不能合成，主要通過飼料或人工添加來滿足動物生長需要[9]。BCAAs具有營養(yǎng)機(jī)體、提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和分解、調(diào)節(jié)母畜泌乳、調(diào)節(jié)激素和物質(zhì)代謝等多種重要的生物學(xué)功能[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BCAAs對于維持豬、小鼠、雞及魚類的腸道健康具有重要意義[10,14-17]，主要通過促進(jìn)腸道發(fā)育以及提高腸道免疫等實現(xiàn)，但BCAAs在鴨飼料中的應(yīng)用研究較少，尤其對鴨腸道菌群是否存在影響尚不清楚。本研究以28～63日齡攸縣麻鴨作為研究對象，探討不同比例BCAAs飼糧對其盲腸微生物多樣性的影響，以期為鴨的腸道健康研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

攸縣麻鴨購于湖南衡東綠然家禽飼養(yǎng)合作社，BCAAs中Leu、Ile、Val均為分析純。試驗飼糧參照地方標(biāo)準(zhǔn)《臨武鴨營養(yǎng)需要》(DB43/T 898—2014)配制，飼糧中亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)按質(zhì)量比m(Leu)∶m(Val)∶m(Ile)分為1∶0.4∶0.3(MA組)、1∶0.5∶0.4(MB組)、1∶0.6∶0.5(MC組)、1∶0.7∶0.6(MD組)、1∶0.8∶0.7(ME組)和1∶0.9∶0.8(MF組)共6組，其中BCAAs總營養(yǎng)水平基本保持一致，以Leu為1來設(shè)置與調(diào)節(jié)三者的含量，其他營養(yǎng)水平各組基本一致，配方組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼料配方及主要成分表(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選用28日齡健康、體質(zhì)量相近(587.96±4.44) g(P>0.05)的攸縣麻鴨公鴨504羽，隨機(jī)分成6個處理(每處理飼喂1種試驗飼糧)，每處理6個重復(fù)，每重復(fù)14羽試鴨，試驗全期35 d。試驗在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所試驗鴨場進(jìn)行。試鴨采用網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食與飲水，常規(guī)免疫，定期消毒，飼養(yǎng)規(guī)程按常規(guī)操作進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集

試驗結(jié)束后稱量，試鴨末質(zhì)量(1 222.13±62.39) g(P>0.05)。從每重復(fù)中選取1羽接近該處理平均體質(zhì)量的試鴨進(jìn)行屠宰，在無菌操作條件下采集盲腸內(nèi)容物分裝于滅菌EP管后，迅速置于液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2.3 高通量測序

1.2.3.1 樣品DNA提取

利用DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)提取盲腸內(nèi)容物總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用DS-11型超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的濃度和純度，-80 ℃保存。

1.2.3.2 建庫測序

提取樣品總DNA后，根據(jù)16S rDNA V3～V4 區(qū)設(shè)計得到引物(338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測序文庫。建好的文庫先進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

從測序平臺得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags；同時，對測序序列進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到有效數(shù)據(jù)后進(jìn)行OTU劃分和物種注釋，并作物種多樣性分析以及組間差異分析。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件與ANOVA進(jìn)行分析，以Duncan氏作多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列及OTU分析

通過測序共得到2 244 524條有效序列，將有效序列進(jìn)行聚類并劃分OTU。對OTU進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)每組樣品的OTU覆蓋率均在99.9%以上，表明該測序能夠真實反映各組樣品的微生物組成。樣品測定結(jié)果見表2和圖1。

表2 樣品OTU

圖1展示了6組樣品共有和特有的OTU信息，中間數(shù)字代表所有樣品共有的OTU數(shù)目，花瓣上數(shù)字代表特有OTU數(shù)目，可見6組共有的OTU數(shù)目為344，僅MD組存在特有的OTU，數(shù)目為1。

2.2 BCAAs比例與攸縣麻鴨腸道菌群組成

圖1 OTU韋恩圖Fig. 1 OTU Venn chart

2.2.1 基于門分類水平分析

6組盲腸內(nèi)容物的所有序列鑒定為14個門。通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對OTU進(jìn)行物種分類并選取相對豐度排名前10的門類繪制物種相對豐度柱狀圖(圖2)。排名前10的門類依次為擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、螺旋體門Spirochaetes、梭桿菌門Fusobacteria、脫鐵桿菌門Deferribacteres、無壁菌門Tenericutes、Patescibacteria門和迷蹤菌門Elusimicrobia。6組核心菌群均為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，其中MD組在3種核心菌群的總豐度最高(92.82%)，MA組最低(84.02%)。6組的三大核心菌群總相對豐度差異不顯著(P>0.05)。由表3可知，ME組變形菌門豐度(11.10%±6.09%)顯著低于MD組(P<0.05)；MF組放線菌門豐度(7.29%±5.14%)顯著高于MA組(P<0.05)。6組其他菌門相對豐度的差異不顯著(P>0.05)。

一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例圖2 門水平上物種的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of species at the phylum level

表3 門水平物種相對豐度差異

續(xù)表3 %

2.2.2 基于屬分類水平分析

對盲腸腸道菌群中豐度最高的10個屬進(jìn)行統(tǒng)計作圖，結(jié)果如圖3所示，排名前10的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio、厭氧螺菌屬Anaerobiospirillum、Subdoligranulum屬、Alistipes屬、Faecalibacterium屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group屬、短螺旋菌屬Brachyspira、梭桿菌屬Fusobacterium以及賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus。由圖3可知，屬水平上優(yōu)勢菌屬在各組間略有不同。其中，MA、MB、MC、ME組的第一優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌屬，MA、MB、MC組的第二優(yōu)勢菌屬為脫硫弧菌屬；MD組的第一、第二優(yōu)勢菌屬為賴氨酸芽孢桿菌屬和擬桿菌屬，ME組的第二優(yōu)勢菌屬為Subdoligranulum屬，6個試驗組各菌屬之間的差異不顯著。

圖3 屬水平上物種相對豐度Fig. 3 Relative abundance of species at the genus level

2.3 BCAAs比例與攸縣麻鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性

2.3.1 腸道菌群Alpha多樣性分析

腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表4。Ace和Chao1指數(shù)數(shù)值越大，物種越豐富。Shannon數(shù)值越大，Simpson數(shù)值越小，物種多樣性越高。6個組的Ace和Chao1指數(shù)值的差異不顯著；MF組Shannon指數(shù)值大于MC組(P<0.05)，Simpson指數(shù)值小于MC組(P<0.01)和MA組(P<0.05)，表明MF組的微生物物種多樣性最高，MC組最低。

表4 Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果

2.3.2 腸道菌群Beta多樣性分析

腸道菌群Beta多樣性的主坐標(biāo)分析(PCoA)和無度量多維標(biāo)定法(NMDS)分析結(jié)果見圖4。將數(shù)據(jù)以點的形式反映在二維坐標(biāo)圖上，樣本距離越近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。6個組樣本極大程度聚集在一起，微生物群落結(jié)構(gòu)的差異顯著(P>0.05)，表明6個組樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。

點分別表示各樣品；不同顏色代表不同分組；橫、縱坐標(biāo)為導(dǎo)致樣品間差異最大的2個特征值，以百分?jǐn)?shù)的形式體現(xiàn)主要影響程度圖4 PCoA和 NMDS分析結(jié)果Fig. 4 PCoA and NMDS analysis chart

3 討論

3.1 BCAAs比例對攸縣麻鴨腸道菌群組成的影響

腸道微生物主要是指腸道細(xì)菌，由有益菌、致病菌及中性菌構(gòu)成，腸道細(xì)菌種群多達(dá)500 種，但這些種主要歸屬于少數(shù)的幾個門類[18]。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是單胃大型動物與小型動物腸道的兩大優(yōu)勢門類[18]。除去以上兩大優(yōu)勢門類，鼠腸道中的主要菌群還有變形菌門與脫鐵桿菌門[19]，反芻動物和雞腸道中主要菌群還有變形菌門[20-21]。本研究中，兩大優(yōu)勢門類為厚壁菌門和擬桿菌門，這與前人研究結(jié)果[18-21]相一致，第三大優(yōu)勢門類為變形菌門，與反芻動物和雞腸道主要菌群更為一致。以上結(jié)果表明，動物腸道的優(yōu)勢門類不會被輕易改變，但飼糧中添加BCAAs會對其中部分主要菌門有一定的影響。另有研究指出，15月齡小鼠腸道中BCAAs補(bǔ)充組的擬桿菌門豐度較對照組下降3.9%，厚壁菌門豐度上升3.62%，變形菌門作為其第三優(yōu)勢門類在補(bǔ)充組中的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組[17]，而變形菌門中通常包含較多的致病菌，因此，補(bǔ)充BCAAs可能有助于降低腸道菌群中的致病菌。結(jié)合本研究，ME組變形菌門豐度最低且顯著低于MD組，可以推測BCAAs中Leu比例在三者中為37%～40%時，更有益于攸縣麻鴨的腸道健康。本研究還發(fā)現(xiàn)MF組放線菌門豐度顯著高于MA組，放線菌門中通常包含較多的共生菌與益生菌，所以MF組可能更有益于攸縣麻鴨腸道菌群。

屬水平上，BCAAs比例對豐度前10的菌屬均無顯著影響，然而各組間仍有一定差異。擬桿菌是腸道中的共生菌，為身體提供必需的營養(yǎng)，在MC與MF組中豐度最高；脫硫弧菌是常見的致病菌，在MA組的豐度最高。BCAAs可以被腸腔內(nèi)的細(xì)菌利用[22-24]，提示它們可能參與調(diào)節(jié)腸道菌群的組成。在對小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)BCAAs能夠影響其腸道菌群的結(jié)構(gòu)，并增加潛在益生菌雙歧桿菌的豐度和降低致病菌腸桿菌的比例[17]。本研究中MF組出現(xiàn)較多的雙歧桿菌。此外，豬的低蛋白飲食降低了腸道乳酸菌水平，但BCAAs平衡顯著改善了乳酸菌的增殖[25]；Ile促進(jìn)了鯉魚腸中乳酸桿菌和芽孢桿菌的生長，抑制了氣單胞菌和大腸桿菌的生長[26]。然而對仔豬的研究中卻發(fā)現(xiàn)BCAAs補(bǔ)充組與正常蛋白組的結(jié)腸微生物菌群沒有差異[22]。以上表明，BCAAs對腸道菌群一定是有影響的，得到不一致的結(jié)果可能與動物品種、飼料組成和BCAAs添加水平以及比例等問題有關(guān)。因此，需要進(jìn)一步深入研究來揭示BCAAs對機(jī)體腸道菌群的影響。

3.2 BCAAs比例對攸縣麻鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

Yang等[17]研究指出，補(bǔ)充BCAAs使小鼠腸道微生物多樣性更豐富；文獻(xiàn)[22-24]認(rèn)為，BCAAs通過被腸道中細(xì)菌利用進(jìn)而可能參與腸道微生物種類和多樣性的調(diào)節(jié)。但目前沒有發(fā)現(xiàn)BCAAs比例對腸道菌群影響的研究。在本研究中，Alpha多樣性分析結(jié)果表明，6組Ace和Chao1指數(shù)無顯著差異(即6組具有相同的物種豐度)，而MF組Shannon指數(shù)顯著大于MC組，Simpson指數(shù)極顯著小于MC組和MA組。在相同物種豐度條件下，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明物種多樣性越高，由此可見，在本研究條件下，MF組具有最高的微生物多樣性，MC組腸道微生物多樣性最低。在Beta多樣性分析中，PCoA與NMDS分析都是采取降維的思想對多樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行定位、分析和歸類，而NMDS分析克服了以前排序方法(包括PCoA在內(nèi))的缺點，更具有可靠性。結(jié)合OTU聚類分析發(fā)現(xiàn)，雖然MD組具有一特有的OTU，但6組微生物菌落結(jié)構(gòu)仍具有較高的相似性，表明不同BCAAs比例在該研究條件下沒有對攸縣麻鴨的腸道菌群結(jié)構(gòu)造成影響。

4 結(jié)論

63日齡攸縣麻鴨盲腸的核心菌群是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，BCAAs比例顯著影響變形菌門及放線菌門，當(dāng)亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸的質(zhì)量比m(Leu)∶m(Val)∶m(Ile)=1∶0.9∶0.8時，攸縣麻鴨盲腸微生物物種多樣性最高。