賀曉文，邊 競(jìng)

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110000）

帕金森病（parkinson's disease,PD）是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，65 歲以上人群患病率為1%，而80 歲以上人群患病率為3%，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，其患病率逐漸增加[1]。PD的主要臨床表現(xiàn)為肌肉震顫性僵硬，運(yùn)動(dòng)功能障礙，記憶力喪失，失語癥以及肌張力障礙等，最主要的病理學(xué)改變?yōu)楹谫|(zhì)紋狀體區(qū)域黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡[2]。

研究顯示，氧化應(yīng)激的增加和慢性炎癥參與PD的起始和進(jìn)展，也是包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵致病因素[3-4]。此外，氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥表現(xiàn)出的一種相互誘導(dǎo)的模式。研究表明，PD 患者腦內(nèi)由于氧化劑和抗氧化劑的失衡，促使氧自由基增多，最終導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元退化，直至死亡[5]。另一方面，在PD 患者的黑質(zhì)區(qū)，多巴胺能神經(jīng)元的喪失與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活同時(shí)發(fā)生，而抑制炎癥因子的釋放可顯著減少多巴胺能神經(jīng)元的死亡[6-7]。因此，抗氧化治療和抗炎治療可能是PD的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

梓醇（catalpol,CA）是存在于多種藥用植物中的環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物，鮮地黃中梓醇含量最高。梓醇具有包括神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和抗炎等多種藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠透過血腦屏障，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8-9]。此外，梓醇可通過抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生降低阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[10]。同時(shí)，梓醇可抑制由過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。最新研究結(jié)果顯示，梓醇可通過抑制帕金森病模型小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元死亡而提高小鼠的運(yùn)動(dòng)功能[11-12]。因此，本研究利用MPTP 構(gòu)建亞急性帕金森病的小鼠模型，然后給予梓醇處理，旨在檢測(cè)梓醇對(duì)帕金森病小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)控作用，并進(jìn)一步探究梓醇是否通過Nrf2/HO1/NQO1信號(hào)通路降低帕金森病小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮行為。

1 材料與方法

1.1 材料

供試梓醇購自皓元生物有限公司；供試TH、BAX、SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、Nrf2、Bcl2、GAPDH 和二抗均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，PVDF 膜購自密理博生物有限公司，牛血清白蛋白購自西格瑪生物有限公司，小鼠的氧化應(yīng)激試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白Marker購自賽默飛生物有限公司。

供試C57BL/6野生型小鼠（2～3月齡，北京華阜康生物科技股份有限公司），體重20～25g，小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠約3～4只，12h晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室的溫度保持在22～25°C。

1.2 方法

研究共設(shè)3個(gè)處理，分別為對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水14d）、MPTP模型組（腹腔注射生理鹽水3d，第4天開始腹腔注射含30mg·kg-1MPTP 的生理鹽水，連續(xù)注射5d，最后給予小鼠腹腔注射生理鹽水6d）和梓醇治療組（腹腔注射15mg·kg-1梓醇的生理鹽水溶液3d，第4 天腹腔注射30mg·kg-1MPTP 的生理鹽水溶液，連續(xù)注射5d，最后腹腔注射15mg·kg-1梓醇的生理鹽水溶液6d）。

1.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 為了評(píng)估小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，參考SHEPPARD 等[6]的方法，隨機(jī)將小鼠放在曠場(chǎng)中心，每只小鼠運(yùn)動(dòng)監(jiān)測(cè)時(shí)間為5min。使用SMART v3.0軟件記錄每只小鼠在曠場(chǎng)中心停止的時(shí)間和行走的距離。

1.2.2 旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn) 采用旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，每個(gè)轉(zhuǎn)軸獨(dú)立計(jì)時(shí)，以4r·min-1的速度旋轉(zhuǎn)，并且在5min 內(nèi)使旋轉(zhuǎn)桿勻速增加至40r·min-1，轉(zhuǎn)軸停下時(shí)自動(dòng)記錄小鼠在轉(zhuǎn)軸上停留的時(shí)間和路程，每只小鼠測(cè)試3次。

1.2.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 為了考察小鼠的焦慮行為，將小鼠尾部后1/3 處用膠帶固定，懸掛于支架上，頭部距離臺(tái)面約15cm 高，進(jìn)行攝像，計(jì)時(shí)6min 停止，使用SMART v3.0 軟件（Harvard Apparatus，British）記錄小鼠后4min（3～6min）內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4 小鼠腦組織取材 腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg·kg-1）麻醉小鼠，小鼠麻醉后進(jìn)行灌流，取出的大腦沿著矢狀縫切開，一側(cè)大腦存放于4%多聚甲醛中4℃保存，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)，另一側(cè)大腦取出黑質(zhì)和紋狀體存放于-80°C，用于后續(xù)的分子生物學(xué)等指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 小鼠的大腦皮層組織稱重，并按1∶5 比例加入RIPA 裂解液（內(nèi)含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），超聲破碎后，冰上裂解2～3h，4℃離心12000r·min-130min，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，定量后，應(yīng)用12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF 膜置于2.5%脫脂奶粉中，室溫封閉25min，TH、Bcl2、BAX、SOD1、SOD2、HO1、NQO1 和Nrf2 抗體4°C 孵育過夜，第2 天，二抗室溫孵育1h，ECL 發(fā)光，膠片曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析。

1.2.6 活性氧（ROS）檢測(cè) 小鼠取材后，稱取小鼠黑質(zhì)，并均質(zhì)于預(yù)冷后的磷酸鹽緩沖鹽水中，4℃12000r·min-1離心10min，上清液用于ROS 的測(cè)定。根據(jù)試劑盒說明，使用氧化敏感探針2,7-二氯熒光素雙乙酸酯對(duì)ROS的產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)估，使用酶標(biāo)儀測(cè)定530nm處的吸光度值。

1.2.7 GSH試劑盒檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書，配置所需要的應(yīng)用液，對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)組織進(jìn)行處理，制備10%組織勻漿，低速離心收集沉淀細(xì)胞，加入0.3～0.5mL 等滲PBS 緩沖液懸浮細(xì)胞，超聲破碎后待測(cè)，取0.1mL 10%組織勻漿或破碎后的細(xì)胞懸液，加入0.1mL試劑混勻，3500r·min-1，離心10min，取上清。配置相應(yīng)的空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測(cè)定孔，混勻，室溫靜置5min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的吸光度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 SOD活性檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書，配置所需要的應(yīng)用液，稱取10mg 的黑質(zhì)，加入100μL 的樣品制備液，置于冰上進(jìn)行勻漿，4℃，12000g 離心5min，取上清作為待測(cè)樣品。配制WST-8 工作液和反應(yīng)啟動(dòng)工作液，設(shè)置樣品孔和空白對(duì)照孔，分別加入待測(cè)樣品和其他各種溶液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后混勻，37℃恒溫箱孵育30min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 切片用羊血清室溫封閉1h，TH 抗體4℃過夜孵育。第2 天，取出切片恢復(fù)至室溫，用0.01mol·L-1的磷酸鹽緩沖液清洗切片，利用免疫熒光抗體室溫孵育2h，經(jīng)0.01mol·L-1的磷酸鹽緩沖液充分漂洗后，防熒光淬滅劑進(jìn)行封片。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，數(shù)據(jù)分析采用Prism v7.0 軟件，采用單因素方差分析（ANOVA）均值之間的差異，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 梓醇緩解由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙和焦慮行為

由表1可知，與對(duì)照組相比，MPTP模型組小鼠在曠場(chǎng)內(nèi)和曠場(chǎng)中心區(qū)域行走的距離明顯縮短，進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)減少（p＜0.05）。與MPTP 模型組相比，梓醇治療組小鼠行走的總路程增加，進(jìn)入曠場(chǎng)內(nèi)中心區(qū)域行走的路程增加，小鼠進(jìn)入中心區(qū)域的總次數(shù)明顯增加（p＜0.05）。

表1 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果Table 1 Results of the open field test every group mouse

由表2 可知，與對(duì)照組相比，MPTP 組小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿上的時(shí)間和距離明顯縮短（p＜0.05），與MPTP 組相比，梓醇處理后可明顯延長(zhǎng)小鼠在旋轉(zhuǎn)桿上的旋轉(zhuǎn)時(shí)間和距離（p＜0.05），上述結(jié)果說明，梓醇可顯著緩解由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。

表2 各組小鼠旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果Table 2 Results of the rotarod test every group mouse

懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），與對(duì)照組相比，MPTP 組小鼠懸掛時(shí)不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（p＜0.05），而與MPTP 模型組相比，梓醇處理后，小鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯縮短（p＜0.05），以上結(jié)果說明，梓醇可改善由MPTP 誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠的焦慮行為。

2.2 梓醇抑制由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果表明（圖2），模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 染色陽性細(xì)胞數(shù)目相比于對(duì)照組明顯減少（p＜0.05），與模型組相比，梓醇處理后黑質(zhì)區(qū)TH 染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（p＜0.05）。Western blot 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)梓醇可顯著上調(diào)小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)TH 的表達(dá)（p＜0.05）（圖3）?？梢?，梓醇可通過抑制小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元死亡而改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮情緒。

圖1 各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Figure 1 Comparison of tail suspension test results in each group

圖2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)的TH免疫熒光染色結(jié)果比較Figure 2 Comparison of the expression of TH in the substantia nigra in each group

2.3 梓醇降低由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠黑質(zhì)區(qū)凋亡蛋白表達(dá)

由圖4可知，與對(duì)照組相比，MPTP組小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)的凋亡分子BAX蛋白質(zhì)表達(dá)升高（p＜0.05），抗凋亡分子Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（p＜0.05）；與MPTP 組相比較，梓醇可促進(jìn)Bcl-2 的蛋白質(zhì)表達(dá)，抑制BAX 的蛋白表達(dá)水平（p＜0.05）?？梢姡鞔伎赡芡ㄟ^下調(diào)小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)凋亡蛋白的表達(dá)而抑制由MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

2.4 梓醇抑制由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠黑質(zhì)區(qū)氧化應(yīng)激水平的升高

由表3 可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)ROS 含量升高（p＜0.05），SOD 和GSH 活性明顯降低（p＜0.05），梓醇給藥處理后，治療組小鼠黑質(zhì)區(qū)ROS 含量降低（p＜0.05），SOD 和GSH 的活性顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，帕金森模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)的SOD1和SOD2蛋白表達(dá)顯著降低（p＜0.05）；相比于模型組小鼠，使用梓醇處理后，SOD1 和SOD2 蛋白表達(dá)明顯升高（p＜0.05）（圖5）。以上結(jié)果說明梓醇可能通過下調(diào)氧化應(yīng)激水平而抑制由小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中TH的蛋白表達(dá)Figure 3 Protein expression of TH in substantia nigra of mice in each group

圖4 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中Bcl2和BAX的蛋白表達(dá)量變化Figure 4 Changes of protein expressions of Bcl2 and BAX in substantia nigra of mice with in each group

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of the oxidative stress kit every group mouse

圖5 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中SOD1和SOD2的蛋白表達(dá)量變化Figure 5 Changes of protein expressions of SOD1 and SOD2 in substantia nigra of mice with in each group

2.5 梓醇抑制由MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡

由圖6 可知，與對(duì)照組相比，MPTP 組中Nrf2、HO1和NQO1 的表達(dá)量顯著性降低（p＜0.05）；給予梓醇后，Nrf2、HO1 和NQO1 的表達(dá)明顯增加（p＜0.05），以上結(jié)果說明梓醇可能通過Nrf2/HO1/NQO1 信號(hào)通路降低小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而抑制由MPTP 誘導(dǎo)組小鼠黑質(zhì)區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡，最終緩解小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙和焦慮情緒。

圖6 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中Nrf2，HO1和NQO1的蛋白表達(dá)量變化Figure 6 Changes of protein expressions of Nrf2, HO1 and NQO1 in substantia nigra of mice with in each group

3 討論與結(jié)論

PD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，隨著全球老齡化的加劇，發(fā)病率逐年增加，其主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙和焦慮抑郁情緒等多種癥狀[13]。研究表明氧化應(yīng)激與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在PD 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)區(qū)ROS 和氧化物水平增加，同時(shí)伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化[14-15]。研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，有助于抵抗氧自由基，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的抗氧化作用。而梓醇作為地黃最主要的有效成分之一，是一種黃酮類化合物，具有抗氧化，抗炎和抗衰老等多種藥理活性[16]。研究表明梓醇可通過上調(diào)SOD2的表達(dá)而有效抑制ROS的生成[17]。此外，梓醇可通過抑制小鼠多巴胺能神經(jīng)元MN9D細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[16]。與之相似，本研究的結(jié)果同樣證實(shí)梓醇可通過抑制由MPTP 誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮情緒。

氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)活性氧與抗氧化作用失衡所形成的一種生理狀態(tài)。生理情況下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)體內(nèi)ROS的含量相對(duì)提高時(shí)，機(jī)體對(duì)其清除能力減弱，進(jìn)而使組織中過氧化水平明顯升高，最終導(dǎo)致機(jī)體受到損害[18-19]。研究結(jié)果表明，H2O2可誘導(dǎo)內(nèi)源性促凋亡因子Bax 和Bak 表達(dá)升高和抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL 的表達(dá)降低，說明氧化應(yīng)激可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，MPTP處理后ROS的含量明顯升高，SOD的活性和表達(dá)以及GSH的活性明顯降低，而當(dāng)梓醇處理后，可顯著降低ROS的含量，提高SOD的活性和表達(dá)以及GSH的活性，說明梓醇可能通過降低活性氧的產(chǎn)生而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減少小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2）是氧化應(yīng)激途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，其表達(dá)增加可明顯抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[21]。血紅素氧合酶-1（hemeoxygennase-1,HO-1）是Nrf2發(fā)揮抗氧化和抗炎反應(yīng)的重要下游調(diào)控因子，醌氧化還原酶1（NADPH qunine oidoreduc-tase1,NQO1）是廣泛存在于各類組織器官中的黃素蛋白酶，也是位于Nrf2 下游因子，研究顯示，HO-1/NQO1 蛋白可抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MPTP 模型組Nrf2/HO-1/NQO1 通路蛋白表達(dá)明顯減少，而當(dāng)梓醇處理后，可顯著提高Nrf2，HO-1 和NQO1 的蛋白表達(dá)，說明Nrf2/HO-1/NQO1 信號(hào)通路介導(dǎo)了梓醇對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由MPTP誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)伴隨黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，與MPTP 組相比，梓醇可明顯促進(jìn)黑質(zhì)區(qū)TH 和抗凋亡分子Bcl-2 的表達(dá)，同時(shí)抑制凋亡分子BAX 蛋白表達(dá)，結(jié)果說明梓醇可能通過減少M(fèi)PTP 誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡而緩解小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示，梓醇可抑制MPTP 誘導(dǎo)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙和焦慮樣行為。

綜上所述，本研究結(jié)果表明梓醇通過Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路抑制MPTP誘導(dǎo)的亞急性帕金森小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡，最終改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮行為。