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      NF-κB在心肌缺血再灌注損傷中的作用

      2022-03-27 00:00:06楊濤蔣艷
      中國典型病例大全 2022年6期
      關(guān)鍵詞:核因子心肌缺血

      楊濤 蔣艷

      摘要: 目的 探究NF-κB在心肌缺血再灌注損傷中的作用。方法 選取60只雌性小鼠隨機(jī)分為四組每組各15只,分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、慢病毒對照(Ad-nc)組、慢病毒(Ad-SNHG1)組,所有小鼠再灌注損傷4h后處死小鼠,HE染色分析心肌組織病理變化,并選擇Western blot分析心肌組織NF-κB信號通路變化,酶聯(lián)免疫吸附測定小鼠外周血及心肌組織炎癥水平。結(jié)果 慢病毒(Ad-SNHG1)組心肌NF-κB、血液HMGB-1、IL-10、Tn-1、P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評分顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子,增加心肌細(xì)胞負(fù)擔(dān)。

      關(guān)鍵詞:核因子-κB;心肌缺血;灌注損傷

      【中圖分類號】R542.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026(2022)06--01

      急性心肌梗死為臨床常見心血管疾病類型,隨著溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療展開,心肌梗死致死率得到顯著改善,但心肌梗死后缺血再灌注損傷成為新的難題[1]。核因子-κB(NF-κB)作為細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,刺激因子如脂多糖、病毒或腫瘤壞死因子等的活化誘導(dǎo)多種基因表達(dá),產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[2]。分析心肌缺血再灌注損傷后NF-κB活性及炎癥因子變化,對有效干預(yù)心肌缺血再灌注損傷具有良好指導(dǎo)作用。文章就建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,分析NF-κB及相關(guān)炎癥因子變化,具體如下。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

      健康雌性C57BL/60小鼠60 只,12周大,20~22g,清潔級。由桂林醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供(編號:62000700001045)。采取隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為四組各15只,假手術(shù)組(Sham組):實(shí)驗(yàn)時只扎線,不結(jié)扎、缺血再灌注組(I/R組):結(jié)扎冠狀血流30分鐘,放松結(jié)扎線進(jìn)行再灌注2小時,造成I/R損傷、慢病毒對照(Ad-nc)組:術(shù)前7d、2d尾靜脈注射對照慢病毒,然后結(jié)扎冠脈造I/R損傷模型、慢病毒(Ad-SNHG1)組:術(shù)前7d、2d尾靜脈注射Ad-SNHG1慢病毒,然后結(jié)扎冠脈造I/R損傷模型。

      1.2 方法

      1.2.1心肌缺血再灌注模型構(gòu)建

      將小鼠(C57BL/6,12周大)稱重后,2.5%戊巴比妥麻醉。將小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺上。剪去頸部體毛,剪開頸部皮膚分離組織,氣管切開連接小動物呼吸機(jī),潮氣量250 mL/min,呼吸頻率120次/min。碘伏消毒,胸骨正中偏左側(cè)切口分離肌肉,剪斷第3-4根肋,用于胸器撐開胸骨,暴露小鼠心臟。提起包壁層剪開心包,暴露左心耳,在左心耳與肺動脈圓錐之間,找到行走于也肌內(nèi)與也大靜脈走向一致的冠狀動脈前降支處進(jìn)針,5-0無創(chuàng)縫合線穿過,進(jìn)針深度為0.3-0.5 mm,在肺動脈圓錐旁出針。術(shù)中用針形電極連接小鼠四肢,心尖區(qū)表面的蒼白表示缺血成功,心肌梗死模型的建立成功。120 min后松解結(jié)扎線,行再灌注,實(shí)驗(yàn)過程中維持機(jī)械呼吸支持。Sham組小鼠手術(shù)操作與上述基本相同,僅將縫合針穿線過左冠狀動脈前降支,但不結(jié)扎該血管。

      1.2.2心肌組織核質(zhì)分離

      取出生1-3天新生小鼠處死,心室剪碎至體積1mm3左右的顆粒,15 mL離心管中加入1 mL 0.1% II型膠原酶、0.2%胰酶混合液(1:1),37℃消化10 min輕輕吹打靜置1分鐘,收集上清液放置50 mL離心管,加入DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基,重復(fù)6~7次直至組織消化成絮狀沉淀物。收集細(xì)胞接種于35 mm的無菌培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)30 min。上清液中的細(xì)胞再次貼壁45 min,仍懸浮的細(xì)胞接種于涂有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,得到跳動的心肌細(xì)胞。

      1.2.3Western blot分析蛋白表達(dá)

      提取細(xì)胞蛋白和細(xì)胞核蛋白添加上樣緩沖液,依據(jù)說明書操作作NF-KBp65(Ser536)、IkBa(Ser32)等蛋白表達(dá)水平,內(nèi)參選擇LaminB和Tubulin。

      1.2.4血液樣本處理

      四組小鼠建模前及建模后4h分別經(jīng)尾部取血,將12000rpm/min離心10min(離心半徑8.2cm),將血清部分轉(zhuǎn)移至新的離心管,用于ELISA檢測。

      1.2.5心肌組織細(xì)胞提取物制備

      取四組小鼠心肌組織各0.1g并剪碎,放入放射免疫沉淀法組織裂解液200ul,在組織勻漿儀上勻漿,在冰上靜置30min,1200×g,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管,用于ELISA檢測組織炎癥因子。

      1.2.6ELISA分析炎癥因子水平

      取96孔板,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品孔,加入分離獲取血清和組織上清液10ul,待測樣本孔中添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100ul,依據(jù)說明書孵育、洗滌操作。終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀492nm處測定隔空吸光度值,依據(jù)樣品OD值,計(jì)算各樣本濃度值。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      使用GraphPad Prism v6.0和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均以SD(標(biāo)準(zhǔn)差)表示。采用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異,采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗(yàn)區(qū)分三組或三組以上的差異。

      2 結(jié)果

      2.1四組小鼠心肌NF-κB水平比較

      慢病毒(Ad-SNHG1)組心肌NF-κB水平顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

      2.2四組大鼠血漿中各ELISA指標(biāo)含量分析

      慢病毒(Ad-SNHG1)組HMGB-1、IL-10、Tn-1水平顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

      2.3四組小鼠心臟組織免疫組化評分結(jié)果

      慢病毒(Ad-SNHG1)組P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評分顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

      3 討論

      缺血再灌注損傷所致組織損傷為一種與抗原無關(guān)炎癥過程,病理生理十分復(fù)雜。既往研究指出[3],氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血再灌注損傷病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。缺血再灌注會引起無菌性炎癥,獲得性和固有免疫系統(tǒng)均被激活,如模式識別受體激活、炎癥細(xì)胞浸潤。

      NF-κB則作為一種能特異的與免疫球蛋白的增強(qiáng)子KB序列結(jié)合的核蛋白轉(zhuǎn)錄因子,具有Rel同源結(jié)構(gòu)域,是Rel蛋白家族成員。未活化狀態(tài)下,NF-κB與抑制因子結(jié)合并形成NF-κB/IκB復(fù)合物,處于失活狀態(tài),定位于細(xì)胞質(zhì)中。但經(jīng)過外界刺激下會產(chǎn)生活性氧、細(xì)胞因子等。本次研究中指出,通過建立四組模型組,其中慢病毒(Ad-SNHG1)組NF-κB信號通路處于最高水平。主要是建模后,磷酸化NF-κBp65和磷酸化IκBa水平顯著增加,p65蛋白大量進(jìn)入細(xì)胞核,IκBa磷酸化水平增加,處于高激活狀態(tài),顯著增加心肌缺血再灌注后NF-κB活性。同時,針對血清、免疫組化中相關(guān)指標(biāo)分析后,心肌慢性損傷缺血再灌注后炎癥因子、P-NF-kBp65、TLR4顯著偏高,表明炎癥因子作用下會造成心肌損傷。

      綜上所述,心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子,增加心肌組織損傷。

      參考文獻(xiàn):

      [1]戴文琴,黃縣立,汪愛萍,等.小鼠心肌缺血再灌注損傷后NF-κB磷酸化狀態(tài)及炎癥因子的表達(dá)水平[J].國際免疫學(xué)雜志,2020,43(1):26-30.

      [2]韋皓,許玉霞,秦莉,等. HIF-1α通過TLR4/NF-κB信號通路對心肌缺血-再灌注大鼠心肌損傷的保護(hù)機(jī)制分析[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2019,18(10):1017-1020.

      [3]袁泉,夏中元,趙博,等. NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致腦損傷中的作用[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2018,47(7):55-58.

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