董良慶，高 強(qiáng)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所，上海 200032

全球癌癥發(fā)病率和死亡率仍處于上升階段，已成為全球第三大死因[1]。在我國，肝細(xì)胞癌是高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全球近50%，70%～80%的患者首診即是晚期，是我國第三大癌癥死因[2]。盡管外科治療、介入、放療等傳統(tǒng)療法以及靶向、免疫治療等創(chuàng)新療法均取得了顯著的進(jìn)步，肝癌總體生存期仍有待于進(jìn)一步改善[3]。目前，肝癌的治療仍然面臨“預(yù)防難，發(fā)現(xiàn)晚，靶點(diǎn)少”的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，被寄予厚望的靶向免疫治療的整體應(yīng)答率低且在患者間差異巨大，其原因包括目前對(duì)肝癌分子亞型及驅(qū)動(dòng)事件等認(rèn)知尚不足，以及體內(nèi)外高通量藥物篩選等存在技術(shù)性限制。此外，肝癌患者可能有多種藥物治療選擇，但最佳治療藥物和組合等仍缺乏有效生物標(biāo)志物用以有效預(yù)測療效或提供用藥指導(dǎo)。近年來，高通量分子生物學(xué)技術(shù)以及平行檢測技術(shù)的進(jìn)步和普及，使得從多維度、多組學(xué)、多系統(tǒng)來綜合揭示肝癌發(fā)生機(jī)制和驅(qū)動(dòng)事件，并開發(fā)新的精準(zhǔn)診療策略成為可能。本文簡要回顧了近年來肝癌的治療進(jìn)展，詳細(xì)探討了應(yīng)用多組學(xué)的新技術(shù)和策略鑒定潛在治療靶點(diǎn)及治療應(yīng)答標(biāo)志物，以及指導(dǎo)肝癌患者治療方案選擇。

1 肝癌治療的現(xiàn)狀和困境

肝癌主要危險(xiǎn)因素包括HBV/HCV慢性感染、酒精性肝炎、代謝綜合征以及非酒精性脂肪肝[4]。對(duì)于早期肝癌患者，手術(shù)切除仍是目前的一線選擇，其5年生存率在筆者中心已超過70%。對(duì)于肝功能儲(chǔ)備不足或腫瘤位置不適合手術(shù)的患者，射頻消融及肝移植是潛在治愈性療法，但存在供肝可用性以及腫瘤負(fù)荷超過移植標(biāo)準(zhǔn)等諸多限制[5]。大多數(shù)肝癌患者確診即為晚期，因此上述治愈性療法并不適用[6]。2017年之前，多受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase imhibitor，TKI)索拉非尼仍是唯一確認(rèn)可為晚期肝癌患者帶來生存獲益的療法[7-8]。近幾年，肝癌的靶向和免疫治療取得了顯著進(jìn)展，多種新藥被證實(shí)對(duì)晚期肝癌有效。就TKI而言，已有一線治療侖伐替尼[9]和多納非尼[10]，以及二線治療瑞戈非尼[11]、卡博替尼[12]和阿帕替尼[13]。TKI通過靶向抑制多達(dá)40余種激酶，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，并實(shí)現(xiàn)免疫微環(huán)境平衡[14]，包括血管生成(如VEGFR和PDGFRβ)以及細(xì)胞增殖相關(guān)(如BARF、KIT和RAF1)等位點(diǎn)，但由于TKI藥理學(xué)的復(fù)雜性和位點(diǎn)的多樣性，目前尚未發(fā)現(xiàn)可有效預(yù)測TKI應(yīng)答療效的生物標(biāo)志物。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)更是在肝癌患者中顯示出令人鼓舞的療效，多種ICI單藥已被批準(zhǔn)用于肝癌二線治療，包括納武單抗(PD-1)[3]、派姆單抗(PD-1)[15]、卡瑞麗珠單抗(PD-1)[16]、替雷利珠單抗(PD-1)[17]和阿維單抗(PD-L1)[18]。特別是ICI的免疫聯(lián)合療法在患者中實(shí)現(xiàn)了更大的生存獲益，包括阿替利珠單抗(PD-L1)聯(lián)合貝伐單抗(IMbrave150)[19]、信迪利單抗(PD-1)聯(lián)合貝伐單抗(ORIENT-32)[20]以及度伐利尤單抗(PD-L1)聯(lián)合曲美木單抗(CTLA-4)(HIMALAYA)[21]。上述不同機(jī)制的藥物通過抗腫瘤-免疫或者免疫-免疫等強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，作用機(jī)制互補(bǔ)，是未來肝癌藥物治療的重要發(fā)展方向。

隨著肝癌不同作用機(jī)制藥物治療的快速發(fā)展，亟需對(duì)肝癌展開全面的分子層面分析，亞組生物特征、標(biāo)志物篩選，以及治療應(yīng)答差異數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，從而針對(duì)每個(gè)患者快速遴選最優(yōu)的用藥策略[22-23]。由于這些藥物可能涉及腫瘤代謝、血管生成、免疫調(diào)控等多維度干預(yù)，因此需要整合多學(xué)科和交叉應(yīng)用思維，從更廣泛維度分析并驗(yàn)證腫瘤-免疫應(yīng)答特征——從全腫瘤組織測序到單細(xì)胞研究，從癌細(xì)胞到微生物組學(xué)，從腫瘤細(xì)胞系到轉(zhuǎn)基因小鼠和個(gè)體化患者模型，從單個(gè)時(shí)間點(diǎn)到時(shí)空異質(zhì)性分析。龐大的分子圖譜數(shù)據(jù)集合描繪了肝癌發(fā)生發(fā)展的生物機(jī)制，并為合理治療靶點(diǎn)選擇和治療分層提供重要指導(dǎo)。在此，本文將關(guān)注于當(dāng)前肝癌研究中的大隊(duì)列、時(shí)空多位點(diǎn)樣本、多組學(xué)研究，并探究如何將組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于指導(dǎo)治療和篩選生物標(biāo)志物。

2 基因組分型是肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的起點(diǎn)

隨著2001年人類基因組計(jì)劃的完成，從基因組維度解析生理和疾病狀態(tài)下的生物學(xué)過程，精準(zhǔn)腫瘤學(xué)和個(gè)體化醫(yī)療概念由此誕生。肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多因素多步驟過程，約80%的患者在慢性致病因素(如肝炎、藥物性或酒精性)影響下獲得不同的病理、基因組及微環(huán)境改變，逐步過渡形成硬化結(jié)節(jié)最終發(fā)展為肝癌[24]。高通量基因組分析等技術(shù)的發(fā)展使我們對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及患者分子分層有更深入認(rèn)識(shí)，也是肝癌精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)和開端。

2.1 以基因組、轉(zhuǎn)錄組和臨床特征為核心的肝癌分子分型 肝癌基因組主導(dǎo)腫瘤驅(qū)動(dòng)模式以及臨床病理特征，目前已有超過千例肝癌患者的基因組被測序和分析[25-32]，發(fā)現(xiàn)肝癌中的高頻突變的驅(qū)動(dòng)基因包括TERT(44%的肝癌腫瘤中存在突變)、TP53(31%)、CTNNB1(27%)和ARID1A(7%)；拷貝數(shù)分析揭示了28個(gè)高頻局灶性擴(kuò)增，包括已知的癌基因CCND1、FGF19、MYC、MET、VEGFA和MCL1[33]。通過整合病因、突變譜、表達(dá)譜、臨床特征等信息，多項(xiàng)研究中提出了將肝癌患者分為增殖型和非增殖型[24,34-35]，其中增殖型與HBV感染相關(guān)且預(yù)后較差，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和生存相關(guān)通路的激活，如PI3K-AKT-mTOR、MAPK和MET級(jí)聯(lián)通路等，進(jìn)一步可將增殖型肝癌細(xì)分為2個(gè)亞型：S1類表現(xiàn)為WNT-TNFβ激活；S2類表現(xiàn)為WNT的非經(jīng)典激活以及高表達(dá)EPCAM和AFP。非增殖型患者侵襲性相對(duì)較低預(yù)后更好，主要富集了丙型肝炎病毒感染及酒精代謝相關(guān)的肝癌。2017年TCGA肝癌研究[33]進(jìn)一步完善了該分型，通過對(duì)363例患者的基因突變、DNA拷貝數(shù)變化、DNA甲基化水平、mRNA表達(dá)、microRNA表達(dá)和反相蛋白陣列(RPPA)數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類(iCluster)，揭示了3種具有獨(dú)特分子特征的亞型以及亞型對(duì)應(yīng)的治療策略，其中iClust1亞型與增殖-S2具有相似的祖細(xì)胞(表達(dá)EPCAM)等特征；iClust2與非增殖型具有共同的分子和病理特征，包括CTNNB1突變以及較少的微血管侵襲；iClust3則是TCGA鑒定的新亞型，主要具有染色體不穩(wěn)定性和TP53突變等增殖型S1的部分特征，同時(shí)具有M2巨噬細(xì)胞浸潤以及免疫耗竭等特征，是預(yù)后最差的一個(gè)亞型。

肝癌是一種典型的炎癥相關(guān)癌癥，病毒性肝炎或者脂肪性肝炎等是重要的慢性病因，因此肝癌微環(huán)境中存在多種免疫細(xì)胞與癌細(xì)胞的復(fù)雜相互作用[36]。通過對(duì)炎癥相關(guān)基因表達(dá)、免疫細(xì)胞浸潤以及免疫調(diào)控配體等對(duì)肝癌進(jìn)行基于免疫狀態(tài)的分子分型[37]，發(fā)現(xiàn)僅30%的肝癌患者具有較高免疫水平，具體表現(xiàn)為高免疫細(xì)胞浸潤、IFNγ信號(hào)激活、顆粒酶B和穿孔素等細(xì)胞溶解標(biāo)志物的高表達(dá)；另有25%患者肝癌表現(xiàn)為“免疫荒漠”型，缺乏多種免疫細(xì)胞浸潤，有趣的是該亞型與上述CTNNB1突變的非增殖亞型高度重合。

2.2 肝癌遺傳異質(zhì)性影響治療策略的開發(fā) 肝癌是高度異質(zhì)性的腫瘤，各亞克隆群可是因肝硬化背景而從不同克隆獨(dú)立發(fā)展而來，也可能是由單個(gè)原始病灶轉(zhuǎn)移形成，在這個(gè)過程中腫瘤克隆群異質(zhì)性受腫瘤進(jìn)化及免疫微環(huán)境的雙重自然選擇[38]。腫瘤異質(zhì)性主要包括時(shí)空異質(zhì)性[38]、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[39]、腫瘤間異質(zhì)性[38]以及患者間異質(zhì)性[33,40-41]。異質(zhì)性越高的肝癌患者預(yù)后相對(duì)更差，且治療選擇也更加復(fù)雜[38]。

為了克服腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，目前治療策略主要從兩方面入手：一方面，靶向腫瘤中所有亞克隆群，通過阻斷主克隆或者聯(lián)合藥物阻斷分支克隆將可能產(chǎn)生臨床獲益。85%肝癌的主克隆突變主要集中在TERT、TP53和CTNNB1，這些突變存在于同一腫瘤不同區(qū)域以及原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間[42]。盡管上述基因靶點(diǎn)因高頻性和時(shí)空分布特點(diǎn)具有重大潛在價(jià)值，遺憾的是，目前精準(zhǔn)靶向這些驅(qū)動(dòng)變異仍較為困難，TP53突變目前認(rèn)為是不可成藥的，靶向其上下游信號(hào)調(diào)控分子(如MDM4或MDM2)具有藥物開發(fā)潛力[43-44]。此外，多種靶向亞克隆的新型治療策略尚在開發(fā)，包括應(yīng)用小分子藥物和反義寡核苷酸，如利用GRN163L來靶向TERT的RNA模板區(qū)域，能夠有效抑制肝癌生長[45]。筆者團(tuán)隊(duì)[39]通過構(gòu)建肝癌不同位點(diǎn)原代細(xì)胞株，應(yīng)用高通量篩選聯(lián)合靶向多分支變異的研究策略，在體外成功阻斷了腫瘤演化進(jìn)程。另一方面，充分調(diào)動(dòng)肝癌克隆群間相互競爭以及增強(qiáng)靈活多樣的免疫篩選壓力來控制腫瘤也是重要的突破口，肝癌不同克隆群間存在相互競爭[46]，通過間歇性調(diào)動(dòng)腫瘤內(nèi)不同克隆群促使其相互競爭，達(dá)到并維持克隆競爭“平衡點(diǎn)”將可能實(shí)現(xiàn)長期帶瘤生存[47]；此外，針對(duì)主干變異或者不同分支變異單獨(dú)設(shè)計(jì)腫瘤疫苗或者篩選特異性T淋巴細(xì)胞等免疫策略，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)殺滅各亞克隆群[38]。當(dāng)前，迫切需要進(jìn)一步闡明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的機(jī)制以及對(duì)不同治療策略的影響，探索如何克服腫瘤異質(zhì)性進(jìn)而阻斷腫瘤進(jìn)化中的陽性選擇，基于不同腫瘤克隆結(jié)構(gòu)和演化特征開發(fā)個(gè)體化治療策略，從而最大化延長患者生存獲益。

3 蛋白基因組學(xué)的綜合策略助力肝癌精準(zhǔn)診療

基因組的研究系統(tǒng)闡明了肝癌的遺傳變異，但單純基因組研究存在較大局限性，一方面，基因組主要反映腫瘤細(xì)胞自身變異，但目前階段大部分肝腫瘤突變?nèi)狈τ行У陌邢蚋深A(yù)藥物，且基因組對(duì)腫瘤間質(zhì)及免疫組分解析有限；特別是肝癌這類由慢性肝炎逐步誘發(fā)的腫瘤，致癌環(huán)境的影響會(huì)遠(yuǎn)早于基因組變異[41]。另一方面，基因變異并不完全反映到蛋白質(zhì)層面，從基因改變到實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)要經(jīng)歷一系列生物學(xué)過程的調(diào)控，其功能的執(zhí)行通常需要翻譯形成蛋白質(zhì)，其中轉(zhuǎn)錄后以及翻譯后調(diào)節(jié)修飾對(duì)實(shí)際效應(yīng)蛋白均會(huì)產(chǎn)生顯著影響。近年來以蛋白基因組為核心的多組學(xué)研究蓬勃開展，包括中國人蛋白質(zhì)組計(jì)劃、美國臨床蛋白組腫瘤分析聯(lián)盟以及國際蛋白基因組聯(lián)盟等，并在結(jié)直腸癌[48-49]、肺癌[50-51]、腎癌[52]、卵巢癌[53]、乳腺癌[54]、子宮內(nèi)膜癌[55]、肝細(xì)胞癌[40-41]、肝內(nèi)膽管癌[56]、胃癌[57-58]、頭頸癌[59]等多癌種的蛋白基因組圖譜描繪中取得重大突破。整合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、蛋白修飾組及代謝組等多組學(xué)數(shù)據(jù)將有助于多維度全面解析肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，從基因型分析逐步深入到蛋白質(zhì)組表型，并與基因組數(shù)據(jù)互補(bǔ)，為肝癌的精準(zhǔn)分型與個(gè)體化治療、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等提供新的思路和策略。

3.1 蛋白基因組分型更精細(xì)化解析肝癌特征 鑒于蛋白組學(xué)在肝癌中巨大價(jià)值和轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力，多項(xiàng)研究基于此策略進(jìn)一步解析了肝癌特征。2017年TCGA通過RPPA蛋白組技術(shù)初步探索了肝癌蛋白譜特征[33]。2019年，Nature發(fā)表的一項(xiàng)研究[40]基于110個(gè)早期肝癌的定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)將隊(duì)列分為S-Ⅰ、S-Ⅱ和S-Ⅲ亞型，其中預(yù)后最差的S-Ⅲ主要表現(xiàn)為膽固醇代謝紊亂，該亞型特異性高表達(dá)的甾醇O-?；D(zhuǎn)移酶1可改變細(xì)胞內(nèi)膽固醇分布并促進(jìn)肝癌增殖和遷移；而S-Ⅰ和S-Ⅱ相對(duì)侵襲性較低，S-Ⅰ主要表現(xiàn)為解毒和尿素循環(huán)等肝細(xì)胞相關(guān)特征，S-Ⅱ表現(xiàn)為增殖特征。我國肝癌多是由慢性乙型肝炎肝炎基礎(chǔ)上發(fā)展而來，同期筆者團(tuán)隊(duì)[41]對(duì)159例乙型肝炎相關(guān)肝癌患者進(jìn)行蛋白基因組學(xué)研究并分為3個(gè)亞型：代謝驅(qū)動(dòng)型(S-Mb)、微環(huán)境失調(diào)型(S-Me)和增殖驅(qū)動(dòng)型(S-Pf)；S-Mb的特征是肝臟代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平高且突變負(fù)荷最高；S-Pf具有癌栓且增殖相關(guān)信號(hào)通路異常激活，預(yù)后最差；S-Me的特征是免疫、炎癥分子表達(dá)下調(diào)；大部分的潛在藥物靶點(diǎn)富集于S-Pf和S-Me，包括大量涉及增殖和侵襲的調(diào)控因子；該研究鑒定出2種差異代謝酶二氫吡咯-5-羧酸還原酶2和乙醇脫氫酶1A可作為獨(dú)立的肝癌預(yù)后生物標(biāo)志物。

基因拷貝數(shù)改變是由腫瘤基因組不穩(wěn)定引起，對(duì)mRNA、蛋白和磷酸化蛋白的豐度產(chǎn)生了多元影響，主要包括順式調(diào)控和反式調(diào)控。反式調(diào)控的蛋白主要富集于大型蛋白質(zhì)復(fù)合物上，如核糖體和剪接體，可能是由于這些蛋白的翻譯后修飾等導(dǎo)致蛋白質(zhì)豐度與拷貝數(shù)改變的關(guān)聯(lián)性減弱，這突出了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)在肝癌靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和治療選擇中的重要性。多項(xiàng)研究[40-41,60]也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在mRNA和蛋白質(zhì)豐度改變之間并非是線性的，而是處在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之下。

3.2 蛋白基因組學(xué)有助于藥物應(yīng)答監(jiān)測 多項(xiàng)臨床研究嘗試根據(jù)生物標(biāo)志物對(duì)患者分層以進(jìn)行精準(zhǔn)治療。在Ⅱ期研究的回顧性分析中，發(fā)現(xiàn)RAS通路激活的晚期肝癌患者對(duì)瑞法替尼(MEK抑制劑)和索拉非尼的組合表現(xiàn)出最佳的臨床反應(yīng)[61]。研究[62]發(fā)現(xiàn)Fms樣酪氨酸激酶3激活狀態(tài)可作為索拉非尼在晚期肝癌患者應(yīng)答中的預(yù)測標(biāo)志物。結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體1和2是mTOR通路中的高頻突變基因，其突變降低mTOR通路活性并促進(jìn)肝癌進(jìn)展[63]，研究[64]表明該突變亞群患者對(duì)mTOR通路抑制劑雷帕霉素較為敏感。此外，基于蛋白基因組為核心的多組學(xué)對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境全方位動(dòng)態(tài)監(jiān)測有助于預(yù)測腫瘤免疫治療效果，以及解析治療應(yīng)答和耐藥機(jī)制，如已有多項(xiàng)研究報(bào)道腫瘤突變負(fù)荷、抗原提呈通路變異以及T淋巴細(xì)胞活性狀態(tài)等因素影響黑色素瘤對(duì)ICI治療應(yīng)答[65-67]：2017年發(fā)表的多組學(xué)探究納武單抗治療期間腫瘤及微環(huán)境演化機(jī)制[68]、2019年利用轉(zhuǎn)錄組+多重免疫熒光+流式質(zhì)譜技術(shù)解析免疫亞群用以預(yù)測ICI治療應(yīng)答[69]、2021年發(fā)表的利用多組學(xué)探究納武單抗對(duì)腎癌治療應(yīng)答影響因素[70]等。

目前，針對(duì)肝癌批準(zhǔn)的一線用藥TKI均是以多個(gè)激酶蛋白為最終靶點(diǎn)，由于靶點(diǎn)廣泛，目前從基因組角度很難界定與TKI應(yīng)答相關(guān)的突變事件。除了對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，TKI通過影響腫瘤微環(huán)境、血管生成和激酶信號(hào)通路等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[71-72]。通過CRISPR-Cas9敲除篩選等高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGFR通路反饋激活將限制肝癌對(duì)侖伐替尼的應(yīng)答，提示EGFR通路激活患者可嘗試EGFR通路抑制劑和侖伐替尼聯(lián)合治療[73]。在治療過程中，蛋白基因組技術(shù)能較好區(qū)分EGFR通路狀態(tài)以及下游磷酸化水平的動(dòng)態(tài)改變，分析腫瘤微環(huán)境組分，從而預(yù)測TKI療效以及耐藥發(fā)生。因此，以蛋白基因組為核心的多組學(xué)研究將促進(jìn)肝癌高通量靶點(diǎn)的相關(guān)研究，將全面解析肝癌患者的不同臨床分組以及亞組患者的分子特征，指導(dǎo)不同藥物選擇和預(yù)后預(yù)測，也將為現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)治療提供有力的監(jiān)測手段。

4 基于分子分型的肝癌精準(zhǔn)治療新策略

4.1 臨床前模型加速個(gè)體化精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)的選擇

盡管靶向和免疫治療在肝癌中已取得巨大成功，但腫瘤樣本受限于組織量及活性等因素，患者最佳治療方案選擇和應(yīng)答預(yù)測等模型仍然缺乏，是目前探索多組學(xué)分子分層精準(zhǔn)治療的主要障礙。構(gòu)建具有患者遺傳和微環(huán)境背景的臨床前模型以最大程度再現(xiàn)肝癌整體異質(zhì)性和復(fù)雜性至關(guān)重要。

4.1.1 成熟的肝癌細(xì)胞系組學(xué)平臺(tái)用于藥篩研究 具有原發(fā)腫瘤大部分遺傳和表觀變異的細(xì)胞系，是目前癌癥藥物應(yīng)答研究中最被廣泛使用的模型。原代肝癌細(xì)胞系在體外篩選藥物靶點(diǎn)及動(dòng)態(tài)監(jiān)測耐藥性改變方面優(yōu)勢(shì)明顯，2019年一項(xiàng)研究[74]中構(gòu)建了50個(gè)低傳代數(shù)的患者來源的肝癌細(xì)胞株模型，結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及體外高通量藥物篩選，大規(guī)?？焖勹b定適合于不同遺傳背景的治療靶點(diǎn)，為對(duì)應(yīng)患者臨床用藥選擇提供潛在參考；同時(shí)，基于多點(diǎn)取樣及多時(shí)間點(diǎn)取樣策略，筆者團(tuán)隊(duì)構(gòu)建時(shí)空異質(zhì)性細(xì)胞系并闡明了肝癌克隆演化機(jī)制以及耐藥性改變[39,47]。

癌細(xì)胞系百科全書(cancer cell line encyclopedia，CCLE)為代表的泛癌種細(xì)胞系研究計(jì)劃在2012年—2020年對(duì)約1000個(gè)腫瘤細(xì)胞系(其中包含25個(gè)肝癌細(xì)胞系)進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)、亞硫酸氫鹽甲基化測序、全局組蛋白修飾譜和代謝物譜等多組學(xué)分析，有機(jī)整合了各細(xì)胞系藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)以及CRISPR全基因組篩選等數(shù)據(jù)，極大地拓展了對(duì)腫瘤生物學(xué)認(rèn)識(shí)，為腫瘤細(xì)胞系功能組學(xué)以及體外靶點(diǎn)篩選提供了重要組學(xué)平臺(tái)數(shù)據(jù)[75-78]。然而，細(xì)胞系模型存在諸多缺陷，如與其他細(xì)胞系交叉污染[79]、長期培養(yǎng)后遺傳背景漂變，依賴于細(xì)胞增殖來評(píng)估藥物應(yīng)答，粘附于培養(yǎng)皿影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、增殖和凋亡等功能[80]。盡管原代細(xì)胞株在保留腫瘤微環(huán)境及異質(zhì)性方面存在先天不足，它仍然是當(dāng)前肝癌藥物高通量篩選的重要基礎(chǔ)，藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)也是藥物開發(fā)和患者選擇的重要參考。

4.1.2 具有三維結(jié)構(gòu)的類器官保留更多腫瘤特征 類器官因其能更好地保留原始腫瘤的三維空間組織結(jié)構(gòu)、多向分化能力以及細(xì)胞間相互作用，從更多維度評(píng)估藥物對(duì)腫瘤的影響，如增殖、形態(tài)、粘附、信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞-微環(huán)境相互作用等，近年來被用以研究包括癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移和藥物篩選等多種科學(xué)問題[81]。2017年，Broutier等[81]成功構(gòu)建了3種最常見的肝癌的類器官(肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和肝細(xì)胞癌-膽管癌混合癌)并進(jìn)行了29種化合物藥物敏感性篩選，最終鑒定出ERK抑制劑SCH772984可能作為肝癌的潛在治療藥物。2018年Nuciforo等[82]利用肝癌活檢微量組織成功構(gòu)建了具有腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的類器官，體外實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)索拉非尼具有不同的藥物敏感性，將類器官接種免疫缺陷鼠后成功復(fù)現(xiàn)了其親代腫瘤的組織學(xué)和基因組特征。近期，Tienderen等[83]評(píng)論，標(biāo)準(zhǔn)化高效化的類器官構(gòu)建及多組學(xué)表征將促使肝膽類器官在個(gè)體化治療中構(gòu)筑堅(jiān)實(shí)的應(yīng)用基石。但目前類器官也存在一些問題，例如成本高、制備耗時(shí)且困難，且缺乏免疫組分和腫瘤間質(zhì)成分，尚不能完全模擬臨床肝癌全部特征,若要應(yīng)用于免疫治療篩選以及抗血管生成等藥物測試仍需進(jìn)一步完善[84]。

4.1.3 小鼠等動(dòng)物模型的合理應(yīng)用和開發(fā) 小鼠模型主要包括患者來源腫瘤異種移植物(patient-derived xenograft，PDX)、基因編輯小鼠模型 (genetically engineered mouse models，GEMM)和致癌物誘導(dǎo)模型(chemically induced models，CIM)，其中GEMM和CIM分別被廣泛用于不同遺傳背景和不同病因下肝癌發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)研究。如基于臨床大樣本鑒定肝癌驅(qū)動(dòng)基因，并構(gòu)建具有特定遺傳背景的GEMM小鼠模型，包括過表達(dá)癌基因(如Myc和β-catenin)、過表達(dá)生長因子(如EGF和TGFβ)以及破壞抑癌基因(如p53)[85]，有助于揭示這些驅(qū)動(dòng)基因在肝癌發(fā)生發(fā)展、治療應(yīng)答和耐藥中的關(guān)鍵作用[86]；2004年的一項(xiàng)研究[87]比較了7個(gè)小鼠肝癌模型與91個(gè)人肝癌樣本的轉(zhuǎn)錄水平差異,發(fā)現(xiàn)Myc、E2f1和Myc+E2f1的轉(zhuǎn)基因小鼠與預(yù)后好的肝癌患者之間存在更高相似性，提示特定突變背景的小鼠模型能有效代表特定亞群的肝癌患者。此外，GEMM和CIM更重要的是兩者存在完整的免疫組分，是重要的免疫治療臨床前模型，可為該驅(qū)動(dòng)基因亞型患者的免疫聯(lián)合治療藥物選擇提供機(jī)制參考。而PDX模型可最大限度保留患者腫瘤組織形態(tài)、分子和遺傳異質(zhì)性[88]，可以有效的監(jiān)測腫瘤生長以及評(píng)估療效，但受限于操作及小鼠腫瘤生長周期等，目前PDX藥物篩選通量低、耗時(shí)長，很難在臨床實(shí)踐中推廣。隨著更多的小鼠肝癌模型的開發(fā)，人肝癌發(fā)生發(fā)展規(guī)律將獲得更全面更精確的模擬，為轉(zhuǎn)化研究提供充分的臨床前藥物測試系統(tǒng)。

4.2 基于蛋白組挖掘新的潛在治療靶點(diǎn)及進(jìn)展

盡管近年來已從多維度揭示了肝癌的分子特征，包括高頻驅(qū)動(dòng)變異(TERT啟動(dòng)子、TP53和CTNNB1)、染色質(zhì)拷貝數(shù)變異(1q和8q擴(kuò)增，4q/8p/16p/17p丟失)以及通路失調(diào)(WNT通路、mTOR以及MAPK級(jí)聯(lián)通路等)[33,40-41]，對(duì)這些分子驅(qū)動(dòng)因素的理解尚未轉(zhuǎn)化為生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐。除了目前的ICI以及TKI外，針對(duì)肝癌其他驅(qū)動(dòng)通路相關(guān)的藥物試驗(yàn)也在積極開展中，包括且不限于以下的靶點(diǎn)。

4.2.1 MET抑制劑 MET通路激活參與了肝癌惡性轉(zhuǎn)歸和治療耐藥，常發(fā)生激活突變以及擴(kuò)增[41]，研究[89]發(fā)現(xiàn)MET激活與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)且靶向該通路可改善患者預(yù)后，因此MET被認(rèn)為是肝癌重要的潛在治療靶點(diǎn)。然而，在一項(xiàng)包含1209例接受過索拉非尼治療后耐藥肝癌患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)[90]中，MET小分子抑制劑Tivantinib并未顯著延長患者生存，這對(duì)MET通路是否適合作為肝癌治療靶點(diǎn)提出了重大挑戰(zhàn)。后續(xù)的多項(xiàng)研究關(guān)注于尋找特異性更強(qiáng)的MET抑制劑(如卡馬替尼)[91]，亦或是聚焦于MET抑制劑(卡馬替尼)與ICI類(PDR001)聯(lián)合使用(NCT02795429)。MET抑制劑在肝癌治療體系中的作用仍需要后續(xù)進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4.2.2 FGFR4激酶抑制劑 FGF家族由至少5個(gè)酪氨酸激酶和大量同源配體組成，盡管FGFR2變異及融合是肝內(nèi)膽管癌等癌癥中一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)[56]，但肝細(xì)胞癌主要表達(dá)FGFR4且其配體FGF19在11%肝癌患者中發(fā)生擴(kuò)增[41]，兩者結(jié)合并激活肝癌FGF19/FGFR4信號(hào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖[92]，并促進(jìn)肝癌對(duì)索拉非尼發(fā)生耐藥[93]。多個(gè)早期臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了幾種FGFR4激酶抑制劑的安全性和臨床耐受，包括BLU-554(NCT02508467)[94]、H3B-6527(NCT02834780)[95-96]以及FGF401(NCT02325739)[97]，大部分不良反應(yīng)都是Ⅰ～Ⅱ級(jí)，包括腹瀉、惡心和嘔吐等，BLU-554在FGF19免疫組化陽性的晚期肝癌患者中整體應(yīng)答率達(dá)到17%，中位緩解持續(xù)時(shí)間5.3個(gè)月[94]，這些結(jié)果初步印證了FGFR4通路在肝癌中的致癌驅(qū)動(dòng)作用以及FGF19表達(dá)量可作為FGFR4激酶抑制劑應(yīng)答預(yù)測的生物標(biāo)志物。

4.2.3 mTOR通路抑制劑 mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于mTORC1和mTORC2 2種復(fù)合物中，并作為一種主要的生長調(diào)節(jié)分子參與了肝癌發(fā)生相關(guān)的下游酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)[63]。依維莫司是一種mTORC1變構(gòu)抑制劑，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)[98]中并未改善肝癌患者生存。目前臨床開發(fā)中的mTOR通路抑制劑一方面通過作用于更多靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)更廣泛的mTOR-PI3K-AKT通路抑制，如mTORC1和mTORC2雙抑制劑(如ATG-008和sapanisertib)以及mTOR-PI3K抑制劑(如GSK2636771、SF1126和capivasertib)，另一方面mTOR通路抑制劑與其他藥物聯(lián)合使用，包括SF1126聯(lián)合納武單抗(NCT03059147)、依維莫司聯(lián)合RTK(NCT04803318)[99]。PI3K/Akt/mTOR 通路抑制療法目前主要面臨著通路反饋激活其他替代通路從而耐藥的問題，因此需要密切監(jiān)測腫瘤信號(hào)通路的改變并阻斷替代通路實(shí)現(xiàn)最大療效。

5 展望

以蛋白基因組為核心的多組學(xué)以及高通量臨床前模型的發(fā)展和應(yīng)用將有助于肝癌患者臨床精準(zhǔn)診療實(shí)施，為開發(fā)個(gè)體化治愈性療法提供潛在機(jī)會(huì)。在可預(yù)見的未來，多組學(xué)工具將應(yīng)用于更多的研究以探索肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，評(píng)估針對(duì)特定肝癌患者亞型的分子途徑及新藥療效[100]。通過亞型特異性靶向策略，例如靶向特定的致癌通路可將侵襲性強(qiáng)的肝癌亞型轉(zhuǎn)化為另一種侵襲性較低的亞型。對(duì)腫瘤微環(huán)境的多維度監(jiān)測將可識(shí)別出更準(zhǔn)確的預(yù)后生物標(biāo)志物。隨著技術(shù)的蓬勃快速發(fā)展，基于多組學(xué)的肝癌精準(zhǔn)診療有望在以下方面取得重要突破。(1)可靠的肝穿刺活檢樣本多組學(xué)檢測技術(shù)：2020年，Satpathy等[101]對(duì)HER2靶向治療前后HER2陽性乳腺癌患者的針芯活檢進(jìn)行了全面的非靶向蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HER2靶向治療后，有響應(yīng)患者腫瘤的HER2蛋白磷酸化減少，而無響應(yīng)患者則出現(xiàn)多重HER2靶向耐藥因素。因此，該技術(shù)的發(fā)展將極大推進(jìn)肝癌分子狀態(tài)監(jiān)測，可能尋找到克服腫瘤進(jìn)展、治療耐藥的新方法。(2)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)將多組學(xué)帶入精準(zhǔn)診療臨床實(shí)踐：基于大樣本隊(duì)列構(gòu)建用于潛在藥物應(yīng)答以及預(yù)后預(yù)測的靶點(diǎn)模型，可通過應(yīng)用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)(低成本、高可靠性)將模型引入臨床實(shí)踐，一方面能顯著提升對(duì)低豐度樣本的解析[102-103]，另一方面可對(duì)多種不同狀態(tài)組織開展檢測，包括血清、血漿、冷凍組織和石蠟標(biāo)本[104]，同時(shí)還將有助于藥物以及臨床檢測腫瘤特異性蛋白流程開發(fā)[105]。(3)基于蛋白基因組驅(qū)動(dòng)分子分層的精準(zhǔn)診療：蛋白質(zhì)基因組學(xué)極大推動(dòng)了癌癥分子及組織學(xué)分型，可針對(duì)特定分子亞型肝癌驅(qū)動(dòng)及通路開發(fā)對(duì)應(yīng)的治療策略，并據(jù)此開展相應(yīng)的臨床試驗(yàn)研究[106]。精準(zhǔn)腫瘤學(xué)將在未來肝癌研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域不斷發(fā)展，多中心、多組學(xué)、大隊(duì)列肝癌數(shù)據(jù)的解析和高通量、多平臺(tái)驗(yàn)證技術(shù)的發(fā)展，有望為患者精準(zhǔn)的藥物靶點(diǎn)選擇和優(yōu)化提供重要支撐。同時(shí)，對(duì)來自腫瘤活檢、治療前后和原發(fā)復(fù)發(fā)樣本進(jìn)行多組學(xué)分析，有助于監(jiān)測腫瘤亞克隆演化，進(jìn)一步加深對(duì)基因型-表型相關(guān)性以及治療敏感和耐藥機(jī)制的理解。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：董良慶負(fù)責(zé)文獻(xiàn)分析，論文撰寫；高強(qiáng)負(fù)責(zé)指導(dǎo)寫作，最終定稿。

參考文獻(xiàn)見二維碼