佛甲草的質量標準研究

黃瑋 李翔宇 趙彩云

【摘 要】 目的：制定佛甲草飲片質量標準。方法：采用顯微鑒別、薄層色譜法對佛甲草飲片進行鑒別，按2015年版《中國藥典》（四部）通則進行水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測定，采用高效液相色譜法測定其槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量。結果：樣品的顯微特征明顯，薄層色譜鑒別斑點清晰，專屬性強;7批樣品水分含量為8.04%～9.73%，總灰分含量為15.07%～20.53%，酸不溶性灰分5.12%～8.99%，水溶性浸出物含量為25.42%～40.12%;槲皮素、山奈素和異鼠李素3個成分的線性關系良好，精密度、穩(wěn)定性和重復性的RSD均低于2.0%，加樣回收率分別為98.33%、98.92%和97.96%，RSD均小于2.0%（n=6）;3種成分的線性關系均良好（r≥0.9990） 結論：方法準確穩(wěn)定，可用于佛甲草的質量控制。初步擬定佛甲草水分不得過11.0%，酸不溶性灰分不得過9.0%，浸出物不得少于24.0%，槲皮素含量不得少于0.025%。

【關鍵詞】 佛甲草;質量標準;顯微鑒別;薄層色譜法;含量測定

【中圖分類號】R282?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）03-0046-05

Study on the Quality Standard of Sedilinearis Herba

HUANG Wei1 LIN Xiangyu2 ZHAO Caiyun1

1.Xuzhou food and Drug Administration and inspection center， Xuzhou 221006，China;

2. Xuzhou Medical Univercity， Xuzhou 221006，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Sedilinearis Herba. Methods? Microscopic identification，thin layer chromatography（TLC） were carried out， According to the corresponding methods in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia（Part Ⅳ）， the contents of moisture， total ash and doluble extractive from 7 batches of Sedilinearis Herba were determined. The contents of quercetin， kaempferol and isorhamnetin were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Results The microseopic characteristics of Sedilinearis Herba were described in detail. TLC spots were clear and the specificity was strong.The contents of moisture， total ash， acid insoluble ash，and soluble extract from samples were 8.04%～9.73%，15.07%～20.53%， 5.12%～8.99%，25.42%～40.12%， respectively.The linear relationships of quercitrin， kaempferol and isorhamnetin were all good.， and the RSDs were all less than 2.0%. The recovery rates of the 3 components were 98.33%，98.92% and 97.96%， and the RSDs were all less than 2.0%（n=6）; the linear ralationships of the 3 components were all good（r≥0.9990）.Conclusions This method is accurate and stable， which can be used for the quality control of? Sedilinearis Herba. It is preliminarily proposed that moisture and acid insoluble ash content should not exceed 11.0% and 9.0%， and extract and quercetin content should not be less than 24.0% and 0.025%? respectively.

Key words：Sedilinearis Herba;Quality Standard;Microscopic Identification;Thin Layer Chromatography;Content Determination

佛甲草為景天科植物佛甲草Sedum lineae Thunb.的干燥全草 。主要分布于中南及江蘇、浙江、安徽、福建、江西、四川、貴州、云南、陜西、甘肅、臺灣等地[1]。有清熱解毒、消腫止血等功效。用于咽喉腫痛、目赤、痢疾、丹毒、帶狀皰疹、癰腫、燙、火傷和外傷出血[2] 。現(xiàn)收載于《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》2002年版，原標準只有性狀鑒別，目前尚無有關佛甲草質量控制方面的文獻報道，為了更好地控制該飲片的質量和安全性，結合參考文獻[3-5]，本研究通過增加顯微鑒別、薄層鑒別、常規(guī)檢查、浸出物測定及以槲皮素、山奈素和異鼠李素作為指標成分進行含量測定，以期建立完善的質量標準，以便控制佛甲草飲片的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FW177高速萬能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;LEICA DM 2500透射光顯微成像系統(tǒng)（德國萊卡公司）;XSR205電子天平（瑞士Metter公司，精度十萬分之一）;101A-1E型電熱鼓風干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）;SX2-5-12型箱式電阻爐（天津市華北實驗儀器有限公司）;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（包括Empower3工作站，四元梯度泵，2998PDA檢測器，自動進樣器和柱溫箱），均購自于美國Waters公司。

1.2 樣品與試藥 槲皮素對照品（批號：100081-200907，純度為97.4%），山奈素對照品（批號：110861-201611，純度為95.5%），異鼠李素對照品（批號：110860-201611，純度為99.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院;佛甲草對照藥材（自制）;甲醇為色譜純（Fish公司），水為超純水，其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。7批佛甲草飲片由企業(yè)提供，經(jīng)徐州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心趙彩云主任中藥師鑒定為佛甲草Sedum lineae Thunb.的干燥全草。詳細信息見表1。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 本品粉末棕色。取本品粉末加水合氯醛試液加熱透化裝片，置顯微鏡下觀察：葉上表皮細胞壁較平直，下表皮細胞壁常波狀彎曲，氣孔不定式。非腺毛單細胞，直徑約20 μm?；ǚ哿＝蛐危砻婵梢婎w粒狀紋飾。纖維狹長而筆直，大多成束。草酸鈣簇晶30～75 μm。導管多為螺紋導管 。如圖1所示。

2.2 薄層鑒別 取供試品粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取佛甲草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）[6]57試驗，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖2所示。

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分測定 取佛甲草飲片粉末（過二號篩）2 g，精密稱定，分別照《中國藥典》2015年版四部通則0832項下水分測定法（第二法 烘干法）、通則2302項下總灰分和酸不溶性灰分測定法測定水分[6]103、總灰分和酸不溶性灰分[6]204。各批次飲片均平行操作3次，取平均值。結果顯示，7批佛甲草的水分含量為8.04%～9.73%，平均值為9.07%，以平均值的120%設限，為10.88%，故暫定本品水分不得過11.0%?？偦曳趾繛?5.07%～20.53%，平均值為17.87%，以平均值的120%設限，為21.44%，數(shù)值較高故暫定不收入正文。酸不溶性灰分含量為5.12%～8.99%，平均值為7.14%，以平均值的120%設限，為8.56%，故暫定本品酸不溶性灰分不得過9.0%。詳見表2。

2.4 浸出物測定 取佛甲草飲片粉末（過二號篩）2 g，精密稱定，照《中國藥典》2015年版四部通則2201水溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定浸出物含量[6]202。 以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量（%），結果7批佛甲草飲片水溶性浸出物含量為25.42%～40.12%，平均值為30.30%，以平均值的80%設限，為24.24%，故暫定本品水溶性浸出物不得少于24.0%。詳見表2。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 色譜柱：C18（ZORBAX，XDB，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55），流速：1.0 mL/min，柱溫：32 ℃，檢測波長：360 nm，進樣量10 μL。槲皮素、山柰素和異鼠李素峰與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于5000。

2.5.2 對照品溶液 取槲皮素、山柰素和異鼠李素對照品適量，精密稱定，分別100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制備各單一對照品母液。分別精密量取一定量的各對照品母液，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋制成每1毫升含槲皮素40.87 μg、山柰素5.75 μg和異鼠李素5.92 μg的混合對照溶液。

2.5.3 供試品溶液 取本品2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-30%鹽酸溶液（4∶1）25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 陰性樣品溶液 取制備供試品溶液的溶劑，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5.5 系統(tǒng)適應性試驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果顯示，供試品色譜中槲皮素、山柰素和異鼠李素與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于5000，陰性樣品無干擾。色譜圖如圖3所示。

2.5.6 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.5.2”項下對照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋，并按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1和3∶1分別計算3種待測成分的定量限和檢測限。結果顯示槲皮素、山奈素和異鼠李素的定量限分別為0.0163 μg/mL、0.0230 μg/mL、0.0237 μg/mL，檢測限分別為0.006 μg/mL、0.0078 μg/mL、0.0079 μg/mL。

2.5.7 線性關系考察 分別精密量取“2.5.2”項下對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL， 按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X， μg）為橫坐標進行直線回歸，得回歸方程： Y（槲皮素）=4.0684×106X-2.1006×103（r=0.9999，n=6）; Y（山奈素）=4.6136×106X+7.6703×103 （r=0.9993，n=6）;Y（異鼠李素）=4.3187×106X+6.9922×103（r=0.9990，n=6），槲皮素進樣量在0.08173～1.2260 μg，山柰素進樣量在0.01151～0.1726 μg，異鼠李素進樣量在0.01184～0.1776 μg的范圍內線性關系良好。

2.5.8 精密度考察 取“2.5.2”項下對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條連續(xù)進樣6次，測定面積，結果槲皮素平均峰面積為1655646，RSD為0.28%（n=6），山奈素峰平均峰面積為266269，RSD為1.01%（n=6），異鼠李素平均峰面積為259635，RSD為1.68 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.9穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液（批號：20151210），按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣，測定峰面積，結果槲皮素平均峰面積為1664001，RSD為0.41%（n=6），山柰素平均峰面積為114870，RSD為1.67%（n=6），異鼠李素平均峰面積為261482，RSD為1.61%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.10 重現(xiàn)性試驗 取同一批號（批號：20151210）樣品6份，按“2.5.3”項下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，結果槲皮素、山柰素和異鼠李素的平均含量分別為0.4057 mg/g、0.0229 mg/g和0.0577 mg/g，RSD分別為1.77%、1.97%和1.86%（n=6），表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.5.11 加樣回收試驗 精密量取已知含量的樣品（批號：20151210，槲皮素的平均含量為0.4053 mg/g，山柰素的平均含量為0.0230 mg/g， 異鼠李素的平均含量為0.0583 mg/g）約1.25 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入槲皮素對照品溶液（0.1022 mg/mL）5 mL、山柰素對照品溶液（0.01471 mg/mL）2mL和異鼠李素對照品溶液（0.02396 mg/mL）3 mL，按“2.5.3” 項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，分別測定峰面積并計算加樣回收率。結果見表3。

2.5.12 樣品測定 分別取各批次飲片細粉適量，按“2.5.3”項下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算3種成分含量，結果按干燥品計算。見表4。

3 討論

在薄層色譜鑒別研究中考察了甲苯-三氯甲烷（1∶1）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（40∶1）為展開劑進行薄層層析，結果甲苯-三氯甲烷（1∶1）為展開劑，層析的結果較好，斑點清晰;不同薄層板（Merck硅膠G板、青島海洋硅膠G 板、自制硅膠G層板）進行比較，結果不同薄層板，薄層色譜分離效果均好，斑點清晰;不同溫、濕度條件（t：5 ℃，RH：30%;t：18 ℃，RH：40%;t：23 ℃，RH：50%））及穩(wěn)定性（0、2、8、24 h）試驗，結果在三種溫濕度條件下薄層色譜結果均穩(wěn)定，斑點清晰，供試品溶液經(jīng)放置24 h后，層析結果依然穩(wěn)定，斑點清晰。結果表明該方法可行。

浸出物含量測定中，分別采用不同浸出方法（熱浸法、冷浸法），不同溶劑（乙醇、稀乙醇、 70%乙醇、30%乙醇、水）進行了比較，結果表明，采用熱浸法，以水為溶劑，測得浸出物量最高。故選擇水為溶劑，熱浸法進行浸出物測定。

含量測定中，流動相的選擇根據(jù)有關參考文獻[7]報道槲皮素、山柰素與異鼠李素的HPLC測定方法，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）進行試驗，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中異鼠李素峰與前后峰沒完全分開，故提高流動相中水相的比例，結果各峰分離度較好，所以最終確定流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）。供試品制備方法的選擇，對供試品回流溫度、時間及加入鹽酸濃度等影響因素進行了考察，結果加入甲醇-30%鹽酸（4∶1）25 mL沸水浴回流30 min可酸解完全，樣品重復性高。本研究建立的含量測定方法能同時測定佛甲草中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，其中槲皮素含量最高，占測定的3種成分總含量的70%左右。據(jù)文獻[8]報道，槲皮素具有抗氧化、抗病毒和抗炎的作用，與佛甲草具有清熱解毒、消腫止血等功效一致。因此，選擇槲皮素作為該飲片含量限定的指標成分，7批樣品槲皮素的平均含量為0.031%， 以平均值的80%設限，為0.025%， 故暫定本品含槲皮素不得低于0.025%。

參考文獻

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（收稿日期：2021-06-01 編輯：劉 斌）

作者簡介：黃瑋（1981-），女，漢族，本科，副主任中藥師，研究方向為中藥材及中成藥的檢驗及質量研究。E-mail：316243060@qq.com