海棲熱袍菌木聚糖酶B的分子改造、高效表達(dá)及其在啤酒中的應(yīng)用

劉學(xué)強(qiáng)，江正強(qiáng)，余 靜，馬俊文，楊 行，閆巧娟,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，中國輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

麥芽糖化是啤酒釀造過程中一個(gè)重要操作單元。大麥麥芽作為主要原料，其胚乳細(xì)胞中含有少量阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖對(duì)麥芽糖化的過濾速度以及啤酒的品質(zhì)有著較大的負(fù)面影響[1]。在此過程中添加木聚糖酶降解其中阿拉伯木聚糖，可明顯提高過濾速度，降低糖化液黏度，改善啤酒的品質(zhì)[2]。Wang Xiaoyu等[3]將密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）木聚糖酶添加于麥芽糖化過程中，糖化液過濾速度提高了31.3%，黏度降低了12.8%。Yu Jing等[4]將毛殼菌（Chaetomiumsp.）CQ31木聚糖酶添加至麥芽糖化過程中，加酶量為200 U/g麥芽，過濾時(shí)間和黏度分別降低42.3%和8.6%。盡管已有許多微生物木聚糖酶的報(bào)道，但在麥芽糖化中應(yīng)用效果好的木聚糖酶不多，這與麥芽糖化的條件相關(guān)。麥芽糖化過程中糖化液的pH值在5.0～5.6之間，處于弱酸環(huán)境，糖化溫度在45～70 ℃之間，并且需要在70 ℃保持1 h[2,5]。因此，在弱酸環(huán)境中具有較高阿拉伯木聚糖催化活力的耐熱木聚糖酶更加適用于麥芽糖化。

通過已有木聚糖酶的分子改造，提高木聚糖酶在pH 5.0～5.6和70 ℃條件下的催化活力，是解決其在麥芽糖化中應(yīng)用限制的有效手段[6]。木聚糖酶的分子改造已有相關(guān)報(bào)道，大多集中于提高耐熱性，Adsul等[7]利用定向進(jìn)化分子改造煙曲霉（Aspergillus fumigatus）木聚糖酶，突變體比野生型在70 ℃的半衰期提高了3 倍，達(dá)到了42 min。Li Guangqi等[8]對(duì)鏈霉菌（Streptomycessp.）S9木聚糖酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，突變體在75～85 ℃的熱穩(wěn)定性明顯提高。而同時(shí)改善木聚糖酶耐酸性和催化活力的分子改造報(bào)道較少。Andre-Leroux等[9]將灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）木聚糖酶的44 位Ser突變?yōu)锳sp，改變了該酶催化殘基的pKa值，突變體Ser44Asp的最適pH值下降了0.5。Azouz等[10]通過定向進(jìn)化改造Geobacillus stearothermophilusGH10家族木聚糖酶催化活力，2 個(gè)突變體Val161Leu和Pro209Leu的kcat/Km由野生型酶的1 178 mL/（s·mg）分別提高至1 799 mL/（s·mg）和2 680 mL/（s·mg）。此外，利用基因工程手段可大幅提高木聚糖酶的產(chǎn)量，畢赤酵母是一個(gè)優(yōu)異的蛋白質(zhì)異源表達(dá)系統(tǒng)，具有高效表達(dá)、分泌等許多優(yōu)點(diǎn)，已用于表達(dá)多種木聚糖酶，但僅有少數(shù)木聚糖酶表達(dá)水平達(dá)到工業(yè)化需求[11-12]。

海棲熱袍菌GH10家族木聚糖酶B（TmXynB）是本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的一種具有阿拉伯木聚糖活力的極端耐熱木聚糖酶，該酶在木二糖生產(chǎn)和面制品中具有一定的應(yīng)用潛力，但其在麥芽糖化條件下催化效率較低[13-14]。本實(shí)驗(yàn)利用定向進(jìn)化技術(shù)分子改造TmXynB，以期獲得在pH 5.0～5.6和70 ℃條件下具有較高催化活力的突變體，并將突變體在畢赤酵母中高效表達(dá)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)突變體在麥芽糖化中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

菌株與質(zhì)粒：海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

大腸桿菌E. coliDH5α 北京博邁德科技發(fā)展有限公司；畢赤酵母P. pastorisGS115 (His4)、載體pET-28a(＋)和載體pPIC9K 美國Invitrogen公司。

1.2 試劑與儀器

低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、EcoR I和NotI、T4 DNA連接酶 大連TaKaRa公司；木糖、木二糖至木六糖、櫸木木聚糖 愛爾蘭Mezayme公司；樺木木聚糖、燕麥木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖 美國Sigma公司；其他試劑如無特殊說明均為分析純。

突變體文庫初篩培養(yǎng)基：5 g/L酵母浸粉、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、0.05 g/L卡那霉素、1 mmol/L IPTG、1 g/L AZCL-Birchwood xylan、5 g/L還原膠、15 g/L瓊脂粉，配制時(shí)用50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。其他培養(yǎng)基的配制和儀器與余靜等[15]報(bào)道相同。

1.3 方法

1.3.1 易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和DNA改組

易錯(cuò)PCR：以TmXynBF和TmXynBR為引物（表1），對(duì)TmXynB基因序列易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，在引物中分別插入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)。易錯(cuò)PCR 50 μL體系組成如下：7 mmol/L Mg2＋、0.1 mmol/L Mn2＋、0.2 mmol/L dATP、0.2 mmol/L dGTP、1 mmol/L dCTP、1 mmol/L dTTP、0.2 μmol/LTmXynBF和TmXynBR，2.5 UTaqDNA polymerase，5 ng重組質(zhì)粒（pET28a-TmXynB）。擴(kuò)增完成后，利用10 mg/mL瓊脂糖凝膠純化回收易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物TmXynB-m。

DNA改組：利用DNase I酶切上述易錯(cuò)PCR產(chǎn)物TmXynB-m，實(shí)現(xiàn)DNA的隨機(jī)片段化。利用20 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切產(chǎn)物，利用酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）純化并用乙醇沉淀得到DNA片段TmXynB-m/DNase I。以DNA片段TmXynB-m/DNase I作為模板進(jìn)行重疊延伸PCR。最后以重疊延伸PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增全長基因。

表1 本研究所用PCR引物總結(jié)Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

1.3.2 大腸桿菌隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建與篩選

使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切上述全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28(＋)，對(duì)酶切產(chǎn)物回收后連接構(gòu)成重組載體pET28(＋)-全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）純化并用乙醇沉淀得到重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌E. coliBL21，收集所有含有轉(zhuǎn)化子的菌落。突變體文庫的初篩利用AZCL-Xylan平板法，根據(jù)TmXynB水解平板中的樺木木聚糖產(chǎn)生透明圈的原理進(jìn)行陽性克隆的高通量篩選。

選取初篩為陽性的克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌體濕質(zhì)量OD600達(dá)0.6～0.8，加入1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)。分別測定不同菌株粗酶液的最適pH值與最適溫度。以最適pH值向酸性方向偏移且最適溫度下降的突變體為正向突變體。TmXynB正向突變體mTmXynB的純化參照余靜等[15]的方法。

1.3.3 木聚糖酶活力和蛋白含量的測定

木聚糖酶酶活力測定采用DNS法[16]，將酶液用檸檬酸-檸檬酸鈉（50 mmol/L，pH 5.5）緩沖液適當(dāng)稀釋，吸取稀釋后的酶液100 μL加入到900 μL櫸木木聚糖底物（1 g/100 mL 50 mmol/L pH 5.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）。在90 ℃反應(yīng)10 min，加入1 mL DNS溶液（1 g/100 mL）終止反應(yīng)，沸水浴15 min，加入1 mL酒石酸鉀鈉（40 g/100 mL）溶液后在OD540條件下測定吸光度，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)。木聚糖酶的活力單位定義：在此反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol木糖所需要的酶量。

蛋白含量的測定參照Lowry等[17]的方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）根據(jù)Laemmli法[18]進(jìn)行。

1.3.4 突變體mTmXynB的酶學(xué)性質(zhì)

在70 ℃，50 mmol/L不同pH值的緩沖溶液中測定mTmXynB純酶的酶活力，確定最適pH值。pH值穩(wěn)定性的測定是將酶液用上述不同體系不同pH值的緩沖液分別稀釋，于70 ℃水浴中保溫30 min，然后迅速置于冰水浴冷卻30 min，測定殘余酶活力。最適溫度的測定是將純酶用50 mmol/L pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液適當(dāng)稀釋，分別在35～100 ℃測定木聚糖酶酶活力確定最適溫度。溫度穩(wěn)定性的測定是將純酶用50 mmol/L pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液適當(dāng)稀釋，在不同溫度下孵育30 min，然后于冰水浴中冷卻30 min后，在最適溫度下測定殘余酶活力。

用50 mmol/L pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制不同種類的木聚糖底物（10 mg/mL），在70 ℃按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力。其中木聚糖底物包括：櫸木木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖。用50 mmol/L pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的木聚糖，在90 ℃、pH 5.5下測定TmXynB的酶活力，反應(yīng)時(shí)間為5 min，并通過“Grafit”軟件計(jì)算最大反應(yīng)速度Vmax和Km。

用50 mmol/L pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制10 mg/mL的燕麥木聚糖及木四糖，60 ℃水浴反應(yīng)，定時(shí)取樣并用沸水滅活，冷卻后離心取上清液進(jìn)行薄層層析分析。

1.3.5 TmXynB突變體的定點(diǎn)突變與結(jié)構(gòu)分析

正向突變體基因（mTmXynB）經(jīng)測序后，根據(jù)其與TmXynB基因序列差異分析具體變化氨基酸，確定mTmXynB的突變位點(diǎn)。以野生型TmXynB基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)，向正向突變體的方向逐一進(jìn)行定點(diǎn)突變，具體引物見表1。獲得定點(diǎn)突變后的全長基因并測序驗(yàn)證無誤后，使用NdeI和XhoI對(duì)PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a雙酶切，再將酶切后產(chǎn)物和表達(dá)載體連接并轉(zhuǎn)化至E. coliBL21。

TmXynB突變體的晶體結(jié)構(gòu)已公開，登錄http://www.rcsb.org/網(wǎng)址根據(jù)（PDB∶1VBU）下載其晶體結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)。mTmXynB中相關(guān)氨基酸突變構(gòu)象變化、表面電荷分布和分子間作用力變化通過Pymol軟件觀察與分析。

1.3.6 突變體mTmXynB基因在畢赤酵母的重組表達(dá)與高密度發(fā)酵

用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotI對(duì)木聚糖酶突變體基因（mTmXynB）和載體pPIC9K雙酶切，凝膠回收后連接獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-mTmXynB。重組質(zhì)粒pPIC9K-mTmXynB用限制性內(nèi)切酶SalI線性化后電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）GS115中。取100～200 μL電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d后用無菌蒸餾水將MD平板上生長的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子洗脫和重懸。分別涂布于含有不同質(zhì)量濃度的YPD-G418平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～5 d。挑取不同質(zhì)量濃度G418平板培養(yǎng)基上的單菌落搖瓶發(fā)酵3 d，吸取上清液檢測木聚糖酶活力。

選取搖瓶發(fā)酵木聚糖酶活力最高的重組菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵。發(fā)酵方法及培養(yǎng)基的配制參照畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)（Version B，053002，Invitrogen）操作。

1.3.7 TmXynB和突變體mTmXynB在麥芽糖化中的應(yīng)用

參照QB/T 1686—2008《啤酒麥芽》。稱取50.0 g麥芽細(xì)粉放入糖化杯中，倒入已預(yù)熱至45 ℃的水200 mL，于45 ℃糖化儀中保溫30 min（加入一定量酶液，對(duì)照不加酶），不斷攪拌。然后使醪液以每分鐘1 ℃的速率在25 min內(nèi)升溫至70 ℃，再往糖化杯中加入已預(yù)熱好70 ℃的水100 mL，在70 ℃保溫1 h，糖化過程不斷攪拌。糖化結(jié)束后，測定其過濾時(shí)間和麥芽汁黏度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro 9.2軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TmXynB隨機(jī)突變文庫的篩選和突變體mTmXynB的純化

隨機(jī)突變文庫中每個(gè)基因中含2～7 個(gè)堿基替換，約1～4 個(gè)氨基酸突變，即氨基酸突變率約為0.55%。在pH 5.0酸性固體培養(yǎng)基初篩12 000 個(gè)突變體，大約有35%的突變體呈現(xiàn)透明圈，與野生型透明圈對(duì)比，將較大透明圈的菌株進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)，純化和酶學(xué)性質(zhì)測定，此過程共純化950 個(gè)突變體。最終，發(fā)現(xiàn)一株在酸性、70 ℃具有較高催化活力的突變株，命名為mTmXynB。

突變體mTmXynB經(jīng)Ni-IDA親和層析一步純化，mTmXynB的比活力為2 010 U/mg，純化倍數(shù)為3.87，回收率為81%。該酶分子質(zhì)量約為40 kDa（圖1），與野生型GH10家族TmXynB的分子質(zhì)量一致。

與野生型TmXynB最適條件下比活力（2 540 U/mg）相比，突變體mTmXynB的比活力（2 010 U/mg）下降約25%，但高于已報(bào)道的嗜鹽嗜堿菌（Alkalibacteriumsp. SL3，180 U/mg）[19]、巴倫葛茲類芽孢桿菌（P. barengoltzii，293 U/mg）[20]和Geobacillussp.WSUCF1（461 U/mg）[21]等大多數(shù)細(xì)菌GH10家族木聚糖酶。

圖1 突變體mTmXynB純化圖Fig. 1 The purification steps of mTmXynB

2.2 突變體mTmXynB的酶學(xué)性質(zhì)

與TmXynB相比，mTmXynB的最適pH值向酸性方向偏移0.5 個(gè)單位，降低至pH 5.5，在pH 3.5～5.5時(shí)，突變體相對(duì)酶活力上升了10%～30%（圖2a）。mTmXynB在pH 3.5～10.0之間保持穩(wěn)定，相比于野生型TmXynB，在pH 3.5下，相對(duì)酶活力上升約20%。mTmXynB的最適溫度為90 ℃，相比于野生型TmXynB的最適溫度（100 ℃）下降了10 ℃，在50～90 ℃條件下，相對(duì)酶活力出現(xiàn)較大幅度的提升（圖2b）。

圖2 TmXynB和mTmXynB的最適pH值（a）和最適溫度（b）Fig. 2 Optimal pH (a) and temperature (b) of TmXynB and mTmXynB

如表2所示，mTmXynB對(duì)燕麥木聚糖具有最大的比活力，為2 205 U/mg，其次為樺木木聚糖（2 039 U/mg）和櫸木木聚糖（2 010 U/mg），最后是小麥阿拉伯木聚糖（1 565 U/mg）。在pH 5.5和90 ℃條件下，mTmXynB的比活力約是野生型TmXynB比活力的3 倍。

表2 TmXynB和突變體mTmXynB的底物特異性Table 2 Substrate specificity of TmXynB and mTmXynB from T. maritima

在pH 5.5和90 ℃條件下，mTmXynB對(duì)櫸木木聚糖的最大催化速率（Vmax）為1 903 μmol/（min·mg），是相同條件下TmXynB對(duì)櫸木木聚糖的2.8 倍。mTmXynB對(duì)燕麥木聚糖的最大催化速率（Vmax）為2 013 μmol/（min·mg），是相同條件下TmXynB對(duì)燕麥木聚糖的2.9 倍。這表明mTmXynB在酸性高溫條件下催化效率顯著提高。mTmXynB相比于TmXynB的Km值稍微下降，這表明突變體稍微提高了酶與底物的親和性。mTmXynB可以迅速降解燕麥木聚糖產(chǎn)生木二糖和少量的木三糖，同樣水解木四糖主要產(chǎn)生木二糖。mTmXynB保留了野生型TmXynB優(yōu)良的水解特性[13]，產(chǎn)物以木二糖為主，僅有微量木糖存在，在低聚木糖生產(chǎn)的應(yīng)用上具有較大的潛力。

通常來說，細(xì)菌來源木聚糖酶的最適pH值大多在pH 6.0～7.5之間。進(jìn)化后的海棲熱袍菌GH10木聚糖酶的最適pH值為5.5，低于枯草芽孢桿菌（B. subtilis，pH 6.5）[22]、C. algeriensis（pH 6.5）[23]、Geobacillussp. WSUCF1（pH 6.5）[21]、Marinimicrobiumsp. LS-A18（pH 8.0）[24]和嗜鹽嗜堿菌（Alkalibacteriumsp. SL3 pH 9.0）[19]等細(xì)菌來源的木聚糖酶。絕大多數(shù)細(xì)菌木聚糖酶的最適溫度處于50～60 ℃[2]，例如嗜鹽嗜堿菌（Alkalibacteriumsp.）SL3[19]、巴倫葛茲類芽孢桿菌（P. barengoltzii）[20]和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[22]木聚糖酶的最適溫度分別為55、55 ℃和60 ℃。此外，少數(shù)細(xì)菌木聚糖酶為耐熱木聚糖酶，例如C. algeriensisGH10家族木聚糖酶的最適溫度為80 ℃，可以在75 ℃以下保持穩(wěn)定[23]。TmXynB為目前報(bào)道的最耐熱木聚糖酶[14]，進(jìn)化后突變體最適溫度稍有下降，但仍舊保持了該酶的耐熱性。

2.3 突變體mTmXynB的突變位點(diǎn)與性質(zhì)改變關(guān)系

根據(jù)序列比對(duì)，相對(duì)于野生型TmXynB，突變體mTmXynB總共發(fā)生3 處氨基酸突變，分別為Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。將野生型TmXynB與其他序列同源性較高的GH10家族木聚糖酶進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Asn91和Trp129為保守氨基酸，而Arg129為非保守氨基酸。為進(jìn)一步明確各突變氨基酸對(duì)野生型木聚糖酶TmXynB酶學(xué)性質(zhì)改變?cè)斐傻挠绊?，設(shè)計(jì)3 個(gè)單一突變體和一個(gè)組合突變體。3 個(gè)單一突變體為Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu，組合突變體為Asn91Ser/Arg143Glu。4 個(gè)突變體的最適pH值、最適溫度和比活力如表3所示。與野生型TmXynB相比，突變體Asn91Ser的最適pH值和溫度沒有明顯改變，但比活力提高至3 551 U/mg；突變體Trp129Arg的最適pH值沒有明顯變化，最適溫度下降了10 ℃，比活力出現(xiàn)大幅度下降（1 565 U/mg）；突變體Arg143Glu的最適pH值下降了0.5，最適溫度沒有明顯變化，比活力稍微下降（2 286 U/mg）。相比于野生型TmXynB，組合突變體Asn91Ser/Arg143Glu的最適pH值下降了0.5，最適溫度沒有明顯變化，比活力提高（3 180 U/mg）；相比于突變體Asn91Ser，最適pH值下降了0.5，溫度沒有明顯變化，比活力稍微下降。結(jié)果表明，Trp129Arg是突變體mTmXynB最適溫度改變的關(guān)鍵突變位點(diǎn)，Arg143Glu是突變體mTmXynB最適pH值改變的關(guān)鍵突變位點(diǎn)，但Trp129Arg和Arg143Glu兩個(gè)突變位點(diǎn)均造成了比活力的下降，尤其是Trp129Arg，而Asn91Ser則是一個(gè)可以提高比活力的關(guān)鍵突變位點(diǎn)。

表3 TmXynB與5 個(gè)突變體的基本酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Enzymatic characteristics of TmXynB and five mutants from T. maritima

與其他的GH10家族木聚糖酶整體結(jié)構(gòu)相似，TmXynB的整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)經(jīng)典的(β/α)8-TIM桶結(jié)構(gòu)，如圖3所示。其中，mTmXynB中2 個(gè)突變氨基酸（Asn91Ser和Arg143Glu）位于酶分子的表面，而Trp129Arg位于酶分子的內(nèi)部。通常來說，蛋白質(zhì)的剛性越強(qiáng)，酶的耐熱性越好[6]。TmXynB是迄今報(bào)道的極端耐熱酶，其脯氨酸含量為3.7%且多位于loop區(qū)或α-螺旋處，它存在幾個(gè)強(qiáng)疏水網(wǎng)絡(luò)，在C端有一些可形成鹽橋的氨基酸，這些都會(huì)增加該酶的剛性[14]。Trp129位于β-折疊上，與它距離4 ?以內(nèi)的氨基酸基本上都為疏水氨基酸，分別為Met51、Leu87、Val118、Val119、Val126、Ile128、Val131、Ile171、Leu172和Ile173，這些疏水氨基酸與Trp129共同形成一個(gè)強(qiáng)疏水網(wǎng)絡(luò)，Trp129突變?yōu)锳rg129打破了強(qiáng)疏水網(wǎng)絡(luò)，酶的穩(wěn)定性受到破壞，因此突變體mTmXynB相比于野生型TmXynB溫度穩(wěn)定性和比活力均有一定下降（圖3c、d）。一般來說，這種強(qiáng)疏水穩(wěn)定性網(wǎng)絡(luò)距離催化凹槽越近，對(duì)酶的催化活性影響越為關(guān)鍵[14]，而Trp129存在的強(qiáng)疏水網(wǎng)絡(luò)距離催化凹槽較遠(yuǎn)，因此并沒有使該酶失去催化活力。

通過預(yù)測TmXynB和mTmXynB表面的電荷分布，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Arg143突變?yōu)镚lu143后，局部表面電荷由強(qiáng)正電變?yōu)閺?qiáng)負(fù)電，此位置距離催化凹槽較近，這可能是Arg143Glu提高該酶耐酸性的主要原因[25-26]（圖3e、f）。此外，當(dāng)Arg143突變?yōu)镚lu143時(shí)，由于側(cè)鏈變短，該位置處與Tyr177的氫鍵消失了，而Tyr177可與催化氨基酸Glu153形成疏水作用力，這可能是Arg143Glu突變體造成酶活力稍微下降的原因[27]（圖3g、h）。突變體Asn91Ser可提高野生型TmXynB約25%的比活力。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)位于89位的Trp與底物結(jié)合具有疏水作用力，是關(guān)鍵氨基酸，而其作為芳香氨基酸擁有共軛π體系，π電子（負(fù)電子）多集中于芳香環(huán)的中心位置，可與91位的氨基酸相互作用[14]；此外，Ser91氨基酸側(cè)鏈（CH2—OH）上的氧原子具有較強(qiáng)的電負(fù)性，可吸引與之相連碳原子的電子，導(dǎo)致側(cè)鏈上電荷分布不均勻，形成類似于中等強(qiáng)度氫鍵的偶極矩作用力，當(dāng)Asn91突變?yōu)镾er91后，氧原子正好位于Trp89位置的正上方，2 個(gè)負(fù)電子形成互斥，可能改變Trp89的構(gòu)象，使之與糖環(huán)間的疏水作用力增強(qiáng)，從而影響該酶的比活力[28-29]（圖3a、b）。

圖3 TmXynB和mTmXynB的結(jié)構(gòu)、改變位點(diǎn)、作用力和表面電荷分布示意圖Fig. 3 Structure, mutation sites, molecular force changes and surface charge distribution

2.4 TmXynB突變體mTmXynB的高效表達(dá)

將重組質(zhì)粒pPIC9K-mTmXynB電轉(zhuǎn)化至P. pastorisGS115中成功表達(dá)，根據(jù)轉(zhuǎn)化子對(duì)G418遺傳抗性差異篩選出高拷貝菌株中酶活力最高為4 mg/mL G418質(zhì)量濃度下的4-3，木聚糖酶活力為170 U/mL。選取4-3菌株在5 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)180 h后，發(fā)酵上清液木聚糖酶活力為18 000 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為12 mg/mL，菌體濕質(zhì)量為510 g/L（圖4a）。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白在42 kDa中處存在一些彌散的條帶，這與TmXynB現(xiàn)象類似，是因?yàn)樘腔F(xiàn)象造成的。目的蛋白約占總蛋白含量的90%以上，僅有少量雜蛋白分泌至培養(yǎng)基中（圖4b）。

圖4 重組畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)mTmXynB歷程Fig. 4 Time course of mTmXynB production by P. pastoris in a 5 L fermentor, and SDS-PAGE pattern of the supernatant

迄今，已有多種木聚糖酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。mTmXynB的表達(dá)水平高于大多數(shù)木聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)水平，例如來源于構(gòu)巢曲霉（A. nidulans，80.5 U/mL）[30]、里氏木霉（T. reesei，780 U/mL）[31]、鏈霉菌屬（Streptomycessp. FA1，1374 U/mL）[32]、黑曲霉（A. niger，1827 U/mL）[33]和枝鏈霉菌（S. rameus，13626 U/mL）[34]的木聚糖酶，但mTmXynB的表達(dá)水平低于嗜熱擬青霉（P. thermophila，52 490 U/mL）[35]。mTmXynB的高效表達(dá)使其在工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力。

2.5 突變體mTmXynB在麥芽糖化中的應(yīng)用

如表4所示，在模擬糖化條件下，野生型木聚糖酶TmXynB的添加量為600 U/g麥芽時(shí)，過濾時(shí)間達(dá)到最低，相比于對(duì)照，下降了39%，同時(shí)黏度下降了8.1%，繼續(xù)提高加酶量過濾時(shí)間和黏度變化不大。而突變體mTmXynB在150 U/g麥芽加酶量時(shí)，過濾時(shí)間達(dá)到最低，相比對(duì)照下降了45%，黏度下降了8.7%，繼續(xù)提高加酶量過濾時(shí)間和黏度變化不大。

表4 TmXynB與突變體mTmXynB對(duì)麥芽糖化的影響Table 4 Effect of TmXynB and mTmXynB on malt mashing

相比于TmXynB，突變體mTmXynB在麥芽糖化中的應(yīng)用效果更好，且加酶量下降了75%倍，這與mTmXynB的酶學(xué)性質(zhì)與麥芽糖化條件更加接近有關(guān)。目前，已有一些木聚糖酶在麥芽糖化應(yīng)用的研究報(bào)道。例如，來源于毛殼霉（Achaetomiumsp.）Xz-8[36]、密黏褶菌（G. trabeum）[3]、特異腐質(zhì)霉（H. insolens）[37]和嗜松青霉（P. pinophilum）[38]的木聚糖酶分別可降低過濾時(shí)間14.3%、17.2%、30.2%和35.6%，同時(shí)可降低麥芽汁黏度6.3%、7.1%、6.4%和9.6%?？梢?，突變體mTmXynB在麥芽糖化中的作用效果處于已報(bào)道的很好水平，表明該酶在啤酒工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

定向進(jìn)化海棲熱袍菌GH10家族TmXynB，獲得在酸性高溫下比活力更高的突變體mTmXynB。相比野生型TmXynB，mTmXynB耐酸性提高，耐熱性下降，在pH 5.5和90 ℃反應(yīng)條件下對(duì)木聚糖的催化酶活力提高了3 倍左右。突變體mTmXynB在畢赤酵母實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，經(jīng)5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵酶活力可達(dá)18 000 U/mL。在協(xié)定糖化條件下，mTmXynB于150 U/g添加量時(shí)效果最佳，過濾時(shí)間下降45%，料液黏度下降8.7%。因此，突變體mTmXynB在啤酒工業(yè)中具有很大的應(yīng)用前景。