劉語涵 李莉 張來斌 馬光皇 陳家力 肖海兵 朱天生 楊明祿

摘要：家蠶腸道菌群與蠶體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及健康密切相關(guān)。通過飼喂蘇優(yōu)一號(hào)家蠶3種不同處理的桑葉，探討不同處理桑葉飼喂對(duì)家蠶腸道菌群的影響及可能的作用機(jī)制，為新疆蠶區(qū)家蠶腸道微生物種類組成及多樣性差異提供一定的理論依據(jù)。以正常飼喂組、含沙桑葉組、高濕桑葉組等3種處理方式，飼喂5齡幼蟲，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對(duì)家蠶腸道微生物進(jìn)行DNA提取，之后通過瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度，以16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)研究不同飼喂組家蠶腸道微生物種類組成及多樣性。結(jié)果表明，蘇優(yōu)一號(hào)優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria），優(yōu)勢(shì)菌科為Chloroplast-norank科和伯克氏菌科（Burkholderiaceae），優(yōu)勢(shì)菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、Tyzzerella-3屬等。正常桑葉飼喂組水桿菌屬的含量顯著高于其他處理，腸球菌屬（Enterococcus）僅存在于含沙桑葉飼喂組，而不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）僅在正常飼喂組。α多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Simpson指數(shù)B處理顯著高于其他處理，Chao1、Faith_pd、Goods_coverage和Observed_species指數(shù)組間無差異，而Shannon和Pielou_e指數(shù)有差異但不顯著。說明桑葉表面沙塵和水分都能影響家蠶腸道微生物豐度，其中沙塵能夠影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：家蠶;腸道菌群;多樣性;干旱蠶區(qū);豐度

中圖分類號(hào)：S881.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0156-06

收稿日期：2021-07-13

基金項(xiàng)目：新疆建設(shè)兵團(tuán)南疆重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2018DB004）。

作者簡(jiǎn)介：劉語涵（1993—），山東菏澤人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：569175037@qq.com。

通信作者：楊明祿，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：ymlzkytd@163.com。

家蠶（Bombyx mori L.）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蠶蛾科（Bombycidae），起源于我國(guó)北方野桑蠶（Bombyx mandarina），幼蟲均以桑葉為食，家蠶經(jīng)過幾千年的馴化與選育，已有3 000多個(gè)品種[1-3]。家蠶也是重要的生物學(xué)模型和模式昆蟲之一，具有遺傳背景清楚、個(gè)體大、易飼養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，在生物學(xué)、遺傳學(xué)和昆蟲免疫學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[4]。對(duì)于家蠶腸道微生物，早在20世紀(jì)60年代日本學(xué)者就利用培養(yǎng)基對(duì)家蠶幼蟲的腸道細(xì)菌有了初步的研究[4]。早期主要研究家蠶疾病相關(guān)微生物，如白僵菌、綠僵菌、微孢子蟲、病原細(xì)菌及病毒等病原微生物經(jīng)消化道的侵染過程。目前，越來越多的研究人員開始關(guān)注鱗翅目昆蟲腸道微生物的多樣性與宿主的關(guān)系及在昆蟲資源和保護(hù)中的作用[5]。家蠶腸道微生物以細(xì)菌為主，優(yōu)勢(shì)菌有微球菌科、芽孢桿菌科、短桿菌科、乳桿菌科、腸桿菌科、Peudomonadaceae、伯克氏菌科、毛螺菌科、針葉樹科，其次豐富的菌種為表皮葡萄球菌屬、Tyzzerella-3屬、Aquabacterium屬，蠟樣芽孢桿菌屬、金黃色葡萄群菌屬、克雷伯氏菌屬。1996年，孫雪奇等通過不同的培養(yǎng)基分離出家蠶腸道中的好氧微生物，并檢測(cè)出部分兼厭氧微生物，證明它們分別屬于16個(gè)屬[6]。1999 年魯興萌等運(yùn)用 API 20 STREP（V.5.0）系統(tǒng)對(duì)正常的家蠶消化道來源的89株腸球菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) Ent .casselif lavus 和 Ent .faecalis是家蠶消化道內(nèi)的主要腸球菌菌叢[7]。2006 年袁志輝等采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法研究家蠶腸道的細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)，顯示家蠶腸道中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillu）、大腸桿菌屬（Escherichia coli）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcu）、假單胞菌屬（Pseudomonas）豐度較高[8]。2007年田貞華等對(duì)家蠶 4 齡幼蟲腸道通過16S rDNA-RFLP分析，分離出14個(gè)不同類群，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在10個(gè)細(xì)菌屬及其分支中[9]。近期對(duì)家蠶腸道菌群基因組分析的報(bào)道表明，家蠶腸道菌在屬水平上主要包括腸球菌屬（Enterococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬[10]表明了家蠶腸道菌群的多樣性。

家蠶腸道微生物與其消化吸收和生長(zhǎng)狀況息息相關(guān)。研究家蠶腸道菌群有利于改善家蠶的健康狀況、減少疾病的發(fā)生從而提高蠶繭的產(chǎn)量和質(zhì)量。之前的研究是利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來檢測(cè)家蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)，不能全面地反映出家蠶腸道細(xì)菌的真實(shí)狀況，因此本試驗(yàn)利用16S rRNA基因高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析來全面準(zhǔn)確地了解家蠶腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

新疆地處亞歐大陸腹地，屬于典型的溫帶大陸性氣候，是絲綢之路的重要通道。最早的種桑養(yǎng)蠶起源于和田地區(qū)，和田地區(qū)位于新疆最南端，南枕昆侖山和喀喇昆侖山，北部深入塔克拉瑪干沙漠腹地，處于干旱荒漠氣候區(qū)，風(fēng)沙天氣頻發(fā)[11-12]，形成具有新疆特色的養(yǎng)蠶方式——水洗桑葉飼喂。本研究利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，研究不同飼喂處理對(duì)其腸道微生物的影響，為研究家蠶對(duì)桑葉濕度和沙塵耐受性奠定基礎(chǔ)，闡明腸道微生物與家蠶之間的互作可以為通過改變腸道微生態(tài)改善家蠶生長(zhǎng)狀況及提高經(jīng)濟(jì)效益提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇優(yōu)一號(hào)三眠蠶由新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶桑科學(xué)研究所提供;桑樹品種為桂桑12，沙地滴灌栽培，三年生條桑桑葉。

1.1.1 試驗(yàn)地設(shè)置

試驗(yàn)地位于新疆維吾爾自治區(qū)和田桑蠶科學(xué)研究所。新疆最早的種桑養(yǎng)蠶起源于和田，和田位于新疆最南端，地處喀喇昆侖山與塔克拉瑪干大沙漠之間，屬于干旱荒漠性氣候，四季多風(fēng)沙，形成新疆獨(dú)具特色的養(yǎng)蠶方式。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶飼育及取樣

2020年8月，取同一批次的家蠶，桑葉水洗晾干后飼喂4齡起蠶，挑選 1 200 頭長(zhǎng)勢(shì)均一的家蠶用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理、重復(fù)4次。將飼喂水洗高濕桑葉（洗凈桑葉，補(bǔ)水20%，SY1-A）、水洗晾干正常桑葉（飼喂前 2 h 用水洗凈的桑葉，桑葉表面干爽無水珠，SY1-B）和采回含沙桑葉（采摘回來的新鮮桑葉，補(bǔ)水20%，SY1-C），其中SY1-B為對(duì)照組。取5齡第3天的家蠶腸道為樣本，每個(gè)重復(fù)取10頭家蠶，取其腸道，并置于離心管中，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 提取家蠶腸道微生物DNA

每個(gè)離心管內(nèi)的中腸進(jìn)行勻漿后，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法取樣提取DNA基因組，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度，用無菌水稀釋至1 ng/μL備用。

1.2.3 16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測(cè)序

以稀釋的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇通用引物（27F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA;1492R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT），采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用相同的擴(kuò)增條件，并設(shè)置陰性對(duì)照，保證操作過程無污染。以Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit制備測(cè)序文庫，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit將構(gòu)建好的測(cè)序文庫在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，合格后采用Illumina平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

1.2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

首先使用cutadapt切除序列的引物片段（設(shè)置-O為10），棄去未匹配引物的序列用Vsearch的fastq_mergepairs模塊拼接序列;使用fastq_filter模塊對(duì)拼接序列進(jìn)行質(zhì)控;使用 derep_fulllength模塊去除重復(fù)序列;使用cluster_size模塊，在98%相似度水平對(duì)去重后的序列聚類，并使用uchime_denovo模塊去除嵌合體;再使用perl腳本（https：//github.com/torognes/vsearch/wiki/VSEARCH-pipeline），過濾質(zhì)控后序列集中的嵌合體，從而獲得高質(zhì)量序列;使用cluster_size模塊，在97%相似度水平對(duì)高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表，去除OTU表格中的singletons OTUs及其代表序列。

1.2.4.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

使用QIIME2 （2019.4）、自編perl腳本等繪制物種分類組成圖表;使用QIIME2 （2019.4）、R語言、ggplot2包，計(jì)算Chao1、Observed species指數(shù)、Shannon、Simpson指數(shù)、Faiths PD指數(shù)、Pielous evenness 指數(shù)和Goods coverage指數(shù);使用QIIME2 （2019.4）軟件繪制稀釋曲線;R腳本將上表中數(shù)據(jù)繪制Alpha多樣性指數(shù)箱線圖和PCoA點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶腸道微生物16S rDNA序列組裝和拼接

對(duì)不同飼育處理組家蠶腸道的有效測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由表1可知，SY1-B2的有效序列數(shù)據(jù)量是最多的，為106 377條，其次為SY1-A3（105 303條）、SY1-A1（104 019條）;總有效序列量為1 133 549條，平均有效序列量為94 462.42條，測(cè)序數(shù)目較大，可以充分保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2.2 家蠶腸道細(xì)菌的種類及豐度

本研究分別從界、門、綱、目、科、屬、種 7 種不同分類階元水平分析分類序列的變化情況。在界、門、綱、目、科 5 種分類階元水平上，序列的減少比較緩慢，而在科、屬、種 3 個(gè)分類階元水平上序列數(shù)驟減，表明待測(cè)樣本菌群中微生物的差異主要集中在科、屬、種的分類水平上?；?OTUs 注釋結(jié)果，所測(cè)樣本在門水平分布最多的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（ Firmicutes） 、藍(lán)細(xì)菌門（Gyanobacteria）和變形菌門（ Proteobacteria） 。SY1-A組和SY1-B的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門，SY1-C組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門（圖1）。

科水平上SY1-A組的優(yōu)勢(shì)菌科為Chloroplast-norank科、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae），SY1-B組的優(yōu)勢(shì)菌科為伯克氏菌科、Chloroplast-norank科，SY1-C組的優(yōu)勢(shì)菌科為伯克氏菌科、Chloroplast-norank科、腸球菌科（Enterococcaceae）（圖2）。

屬水平上SY1-A組的優(yōu)勢(shì)菌屬為Tyzzerella-3屬、Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬（Aquabacterium）等;SY1-B組的優(yōu)勢(shì)菌屬菌為水桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）;SY1-C組的優(yōu)勢(shì)菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）（圖3）。

根據(jù)OTU數(shù)據(jù)繪制稀疏性曲線（圖4），Spe-caccum 物種累積曲線（圖5）。稀疏性曲線末端趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)有效反映了家蠶腸道微生物菌群的多樣性。物種累積曲線反映了持續(xù)抽樣下新OTU（新物種）出現(xiàn)的速率。在樣本量為1～10組內(nèi)，曲線急劇上升，表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)，樣本量約為11組左右時(shí)，曲線趨于平緩，表示微生物的種類不會(huì)隨飼喂的增加而有明顯的增加。

分析各組樣本屬水平的韋恩圖可知，對(duì)照組獨(dú)有的OUT數(shù)量為1 321種，SYI-C組和SYI-A組獨(dú)有的OUT數(shù)量分別為1 355、1 758種，說明各個(gè)組在屬水平上的腸道微生物存在一定差異;SYI-C和 SYI-A 組與對(duì)照組共有的OUT數(shù)量分別為268、211種，SYI-C和SYI-A共有的OUT數(shù)量為92種，說明SYI-A腸道菌屬的數(shù)量影響較大，但是在屬水平的物種豐富度上SYI-C和SYI-A均高于對(duì)照組（圖6）。

2.3 家蠶腸道細(xì)菌多樣性分析

分析α多樣性指數(shù)可知，Goods-coverage指數(shù)為0.99，說明對(duì)16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析有一定的代表性;從Chao1指數(shù)可以看出SY1-A組和 SY1-B 組的群落豐富度大于SY1-C組;從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知，SY1-A組和SY1-B組細(xì)菌的物種多樣性大于SY1-C組（圖7）。

3 結(jié)論與討論

家蠶腸道菌群結(jié)構(gòu)與其生長(zhǎng)發(fā)育、生理變化、機(jī)體免疫密切相關(guān)，同時(shí)受品種、性別及發(fā)育時(shí)期、生長(zhǎng)環(huán)境、飼料的影響。本研究中以正常家蠶為對(duì)照，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，為全面了解家蠶腸道細(xì)菌種群的組成提供了強(qiáng)有力的手段，本研究通過高通量測(cè)序16S rRNA 基因序列的方法，從家蠶品種蘇優(yōu)一號(hào)的中腸中所檢測(cè)到的細(xì)菌種類大大多于簡(jiǎn)單純培養(yǎng)或變性梯度凝膠電泳（DGGE）檢測(cè)到的細(xì)菌種類[4-5]，表明家蠶腸道細(xì)菌類群非常豐富，通過16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)可獲得更加全面的家蠶腸道細(xì)菌多樣性信息。探究飼喂不同處理桑葉后家蠶蘇優(yōu)一號(hào)腸道微生物結(jié)構(gòu)，并分析菌群結(jié)構(gòu)的共性與差異。

蘇優(yōu)一號(hào)在門分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，科分類水平上為Chloroplast-norank科、伯克氏菌科，在屬分類水平上優(yōu)勢(shì)菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、Tyzzerella-3屬等。與正常桑葉飼喂組相比Chloroplast_norank的含量均低于高濕桑葉飼喂組和含沙桑葉飼喂組，而水桿菌屬的含量顯著高于其他2個(gè)組;水桿菌屬的含量顯著高于其他2個(gè)組;腸球菌屬只存在于 SY1-C 組中，在其他2個(gè)組中均未發(fā)現(xiàn);不動(dòng)桿菌屬只在SY1-B組中被發(fā)現(xiàn)，其他2個(gè)組均未發(fā)現(xiàn)該屬細(xì)菌。

對(duì)柞蠶5齡中腸微生物研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群中包含Tyzzerella-3屬[13]，有研究發(fā)現(xiàn)在人體腸道中存在該屬，與人類抑郁癥有關(guān)[14-15]。含沙桑葉飼喂組的優(yōu)勢(shì)菌屬腸球菌屬也是一類較為常見的細(xì)菌，在家蠶腸道內(nèi)是主要的消化細(xì)菌之一[16-17]，許多昆蟲體內(nèi)含有大量的腸球菌，腸道細(xì)菌影響昆蟲消化液的pH值，并與對(duì)家蠶的致病性相關(guān)聯(lián)。腸球菌屬是家蠶腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬，能產(chǎn)生乙酸鹽，導(dǎo)致消化液的pH值降低[18]，也可以保護(hù)寄主免受一些毒素的攻擊[6]，家蠶在受到BmBDV病毒感染時(shí)腸道內(nèi)腸球菌的比例也會(huì)逐漸增加[19]。魯興萌等的研究在一定程度佐證了家蠶腸道細(xì)菌有抑制致病微生物感染的作用[7]。3種桑葉處理飼喂對(duì)家蠶的腸道微生物組成和多樣性有較大影響，桑葉表面沙塵可改變家蠶腸道微生物的結(jié)構(gòu)，高濕度可能在一定程度上造成家蠶腸道微生物結(jié)構(gòu)改變，濕度對(duì)家蠶的取食量也影響較大，桑葉不進(jìn)行處理直接飼喂家蠶取食量明顯降低。

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