基于MAPK/ERK 信號通路探討冷凍消融對肺癌小鼠的作用機制

林事成，劉殿娜，周相男，莊垚雪，梁天宇，王瀟凡，胡凱文，孫靜宜，李泉旺

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腫瘤科，北京 100078）

根據(jù)2020 年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤，2020 年死亡人數(shù)高達(dá)180 萬，遠(yuǎn)超其他惡性腫瘤［1］。手術(shù)切除作為早期肺癌首選方法，然而肺癌起病隱匿，大多肺癌發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，失去手術(shù)機會。近年來冷凍消融作為新興靶向治療手段，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中被證實療效顯著。冷凍消融治療中發(fā)現(xiàn)除了物理直接殺傷腫瘤作用，還能降低腫瘤侵襲力，降低腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率，激活抗腫瘤免疫，但對其具體作用機制及分子水平的變化，尚缺乏進(jìn)一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是表皮生長因子受體（EGFR）的重要下游，表皮生長因子受體接收細(xì)胞外生長、增殖信號通過MAPK/ERK 信號通路傳遞到細(xì)胞核，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長、生存、修復(fù)與增殖［2］。研究表明腎癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中MAPK/ERK 信號異常激活［3-5］。本研究通過建立Lewis 肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型探討冷凍消融對MAPK/ERK 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞

雄性C57BL/6 小鼠10 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，本實驗中所有的實驗動物被飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物中心，SPF 級飼養(yǎng)環(huán)境，動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，批號為202020。小鼠肺癌Lewis 細(xì)胞株，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要實驗材料及設(shè)備

DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；胎牛血清購自默克公司；胰蛋白酶及青鏈霉素混合液購自GIBCO 公司；RIPA（強）裂解液購自碧云天公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自賽默飛公司；SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒購自Novoprotein 公司；NucleoZol RNA提取試劑購自基因公司；KRAS、RAF1、ERK1/2、P-ERK1/2 多克隆抗體均購自Proteintech 公司，P-RAF1、P-MEK1 均購自Abcam 公司，MEK1 多克隆抗體購自Santa Cruz 公司，山羊抗兔（鼠）IgG 二抗均購自Proteintech 公司；氬氦刀冷凍治療系統(tǒng)及1.2 mm 冷凍刀頭（美國Endocare 公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 7300），小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司1658033）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及動物模型的建立

Lewis 細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1% 雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液一次，細(xì)胞貼壁面積達(dá)70%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，取對數(shù)生長期Lewis細(xì)胞，胰酶消化，重懸，以每只小鼠0.2 mL 細(xì)胞懸液含2×106個細(xì)胞接種于小鼠右腿內(nèi)側(cè)皮下，1 周后游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑10 mm×10 mm，開始實驗。

1.4 小鼠冷凍方案及分組

將造模成功的小鼠隨機分為假手術(shù)組和冷凍消融組，每組各5 只，手術(shù)時將冷凍消融組小鼠麻醉，固定，備皮，消毒，切開皮膚，暴露腫瘤，1.2 mm冷凍刀頭插入腫瘤中央。采用雙循環(huán)冷凍方法：利用釋放氬氣將刀頭溫度迅速降低至-120℃冷凍10 s，隨后釋放氦氣復(fù)溫至15℃，重復(fù)上述冷凍消融循環(huán)1 次。假手術(shù)組小鼠麻醉固定后，切開皮膚，暴露腫瘤，直接縫合。兩組小鼠麻醉復(fù)蘇后繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠，于14 d 后同時處死小鼠，取材，盡量完整剝離腫瘤組織。

1.5 Western blot 檢測腫瘤組織中MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取50 mg 剝離的小鼠腫瘤組織，將組織剪碎放入玻璃勻漿器中，加入RIPA 裂解液500 μL，反復(fù)研磨充分裂解組織蛋白，離心取上清液獲取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定法檢測樣本蛋白含量，并將所有樣本總蛋白濃度調(diào)為3 μg/μL。樣本蛋白經(jīng)100 ℃8 min 高溫煮沸變性，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，取30 μg 樣本上樣，100 V 恒壓電泳至條帶到底部，100 mA 恒流電轉(zhuǎn)100 min，取下轉(zhuǎn)好的PVDF 膜加入TBST 潤洗5 min×3 次，10%脫脂奶粉封閉1 h結(jié)合PVDF 膜上無關(guān)蛋白反應(yīng)位點，TBST 潤洗5 min×3 次，分別加入兔（鼠）多克隆蛋白一抗工作液KRAS（1∶5 000）、RAF1（1∶3 000）、MEK1（1∶200）、ERK1/2（1∶3 000）、P-RAF1（1∶3 000）、P-MEK1（1∶3 000）、P-ERK1/2（1∶3 000）、GAPDH（1∶50 000）室溫孵育1.5 h，TBST 潤洗5 min×3 次，加入山羊抗兔（鼠）二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 潤洗5 min×3 次，使用超敏ECL 發(fā)光液孵育PVDF 膜，調(diào)整曝光條件進(jìn)行顯影，保存圖片，采用Imagel J 軟件分析條帶灰度值。

1.6 qRt-PCR 法檢測腫瘤組織中KRas 基因表達(dá)情況

根據(jù)制造商說明書，取50 mg 腫瘤組織加入NucleoZol RNA 提取試劑500 μL，用玻璃勻漿器充分研磨，加入200 μL 無菌無酶水，渦旋15 s 后室溫靜置5 min，12 000g離心15 min，取上層清液于另一離心管中，加入500 μL 異丙醇，室溫靜置10 min，12 000g離心10 min，棄上清液，此時RNA 沉于管底，加入500 μL 75%乙醇8 000g離心3 min 洗滌RNA，用移液器吸除上層乙醇，再次加入75% 乙醇，干燥管中RNA，加入50 μL 無菌無酶水溶解提取到的RNA。紫外分光光度計測定OD260/OD280，計算各組總RNA 濃度，參照產(chǎn)品說明書使用引物Oligo（dT）18 primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，反應(yīng)時間為：42°C 60 min，70°C 5 min。使用SYBR Green作為熒光染料，以β-actinmRNA作為內(nèi)參，KRas引物上游：5′-TGTGGACGAATATGATCCAACA-3′，下游：5′-GCAAATACACAAAGAAAGCCCT-3′；β-actin引物上游：5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′，下游5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′。使用ABI 7300 qRt-PCR 系統(tǒng)檢測相關(guān)mRNA的表達(dá)，反應(yīng)程序為：95 ℃1 min，95 ℃20 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)，最后一步60°C 時記錄熒光信號，依程序設(shè)定溶解曲線，按照2-ΔΔCt計算KRasmRNA 的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計數(shù)據(jù)選用SPSS 20.0，圖形構(gòu)建選用Graphpad Prism8.0，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布且方差齊的兩組樣本采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷凍消融對MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白的調(diào)控

Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，冷凍消融組KRAS 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），非磷酸化蛋白RAF1、MEK1、ERK1/2 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，磷酸化蛋白P-RAF1、P-MEK1、P-ERK1/2 表達(dá)均受到抑制（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 兩組小鼠腫瘤中MAPK/ERK 通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of MAPK / ERK pathway related protein expression in tumor of mice between two groups（n=5，±s）

表1 兩組小鼠腫瘤中MAPK/ERK 通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of MAPK / ERK pathway related protein expression in tumor of mice between two groups（n=5，±s）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05。

指標(biāo)KRAS/GAPDH P-RAF1/RAF1 P-MEK1/MEK1 P-ERK1/2 / ERK1/2假手術(shù)組0.866±0.060 1.475±0.211 2.437±0.286 1.106±0.082冷凍消融組0.471±0.233 0.931±0.132 1.485±0.678 0.733±0.171 t 2.842*4.884*2.896*4.412*

圖1 兩組小鼠腫瘤組織中MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量Fig 1 Relative expression of MAPK /ERK pathway related proteins in tumor tissues of mice in two groups

2.2 冷凍消融對KRas mRNA 表達(dá)的影響

qRt-PCR 結(jié)果表明，與假手術(shù)組小鼠相比，小鼠肺腺癌組織經(jīng)冷凍消融后腫瘤組織中KRasmRNA 表達(dá)降低（1.000±0.073vs.0.645±0.053）（t=6.825，P＜0.05）。見圖2。

圖2 兩組小鼠腫瘤組織中KRas mRNA 的表達(dá)情況Fig 2 Expression of KRas mRNA in tumor tissue of mice in two groups

3 討論

肺癌目前仍然位居我國惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率之首［6］。對于大部分失去手術(shù)切除機會的晚期患者，冷凍消融治療具有副作用小、局部微創(chuàng)、安全有效的特點，可以較好地控制肺癌的病情進(jìn)展，提高患者的生活質(zhì)量，減輕病痛，延長生存期。冷凍消融技術(shù)通常是利用氬氣或液氮等媒介迅速在病灶形成-140 ℃～-160 ℃的冰球，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)外快速形成冰晶，逐漸復(fù)溫至30 ℃過程中冰晶消融，使腫瘤細(xì)胞破裂及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)理化變性，引起腫瘤組織的機械性損傷［7］。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死產(chǎn)物會抑制殘余腫瘤的進(jìn)展，并可能影響到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤［8-10］，冷凍消融對腫瘤的作用除了直接機械性損傷，可能涉及到更復(fù)雜的分子機制。本研究通過動物實驗，探究冷凍消融對腫瘤經(jīng)典信號通路MAPK/ERK 的影響，以期在臨床上對冷凍消融與分子靶向藥物的聯(lián)合治療有所指導(dǎo)。

肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多階段、多步驟的過程，在腫瘤進(jìn)展的每個階段，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常激活都起著重要作用［11］。目前針對肺癌研究較多的通路有MAPK 通路、PI3K/AKT 通路、DLL4-Notch1 通路、TGFβ/Smad 通路等，其中MAPK 信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的主要途徑，在肺癌的病情進(jìn)展中扮演重要角色。MAPK 通路有4種主要的分支路線：ERK、JNK、p38/MAPK 和ERK5。其中，MAPK/ERK 主要參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡、遷移，上游信號是著名的Ras 及Raf蛋白，Ras基因是一種原癌基因，是發(fā)現(xiàn)最早并且突變率最高的人類癌基因之一。KRas基因突變是肺癌中最常見的基因突變之一，約32%的非小細(xì)胞肺癌存在KRas 突變［12］。該信號通路主要是Ras 在細(xì)胞外信號刺激下，與三磷酸鳥苷結(jié)合而激活，從而使Raf 蛋白磷酸化活化，由Raf 再激活Mek，Mek 經(jīng)磷酸化最終激活Erk，只有p-Erk 才具有活性，p-Erk通過轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，激活多種轉(zhuǎn)錄因子和激酶，借此完成將細(xì)胞外刺激信號傳至細(xì)胞內(nèi)過程，引起一系列細(xì)胞反應(yīng)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等。

本研究結(jié)果表明，對Lewis 肺癌荷瘤小鼠冷凍消融與假手術(shù)組相比，冷凍消融可以直接抑制KRas基因的轉(zhuǎn)錄，減少了KRAS 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而引起下游RAF1、MEK1 蛋白磷酸化激活過程的抑制，最終抑制了ERK1/2 磷酸化表達(dá)的進(jìn)程，可能會引起腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移過程的抑制。

正常情況下KRas表達(dá)受上游EGFR 受體傳遞胞外信息，肺癌中較常見的KRas基因突變，使KRas在無EGFR 外源信號刺激下仍處于激活狀態(tài)，且不可控，持續(xù)的激活狀態(tài)將導(dǎo)致腫瘤的無序增殖。因而KRas 基因突變影響了EGFR-TKI 靶向治療的療效，而本次實驗結(jié)果提示冷凍消融除了具有直接機械殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，還可以抑制KRas基因的表達(dá)，抑制MAPK/ERK 信號通路的活化。KRas基因突變患者在接受冷凍消融后聯(lián)合EGFR-TKI 靶向用藥可能有更好的療效。

綜上所述，冷凍消融可以通過下調(diào)KRas基因的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控MAPK/ERK 信號通路，可能與冷凍消融抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于MAPK/ERK 信號通路作為表皮生長因子受體（EGFR）的重要下游通路，冷凍消融與EGFR 靶向藥物聯(lián)合治療可能會產(chǎn)生增敏效果，進(jìn)一步提高療效，而這需要我們進(jìn)一步研究探索。

作者貢獻(xiàn)度說明：

林事成：實驗方案的設(shè)計，小鼠喂養(yǎng)，小鼠冷凍消融手術(shù)主刀，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測，文章撰寫；劉殿娜：完善實驗方案，指導(dǎo)小鼠冷凍消融實驗的進(jìn)行，指導(dǎo)相關(guān)檢測實驗；周相男：協(xié)助完成各項指標(biāo)檢測，檢查修改論文；莊垚雪：協(xié)助小鼠冷凍實驗，小鼠取材，協(xié)助提總蛋白，提總RNA，WB 檢測，PCR 檢測；梁天宇：協(xié)助小鼠冷凍實驗，小鼠取材，協(xié)助WB檢測；王瀟凡：協(xié)助小鼠冷凍實驗，小鼠取材，協(xié)助PCR 檢測；胡凱文：課題設(shè)計及校審；孫靜宜：購買實驗耗材，協(xié)助完成WB 和PCR 檢測，整理數(shù)據(jù)；李泉旺：課題負(fù)責(zé)人，提供文章整體思路，完善實驗方案，修改論文。

所有作者聲明沒有利益沖突。