廖美華，張 濤，賴冬萍，楊 武，丁明健

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

中醫(yī)有“無濕不成泄”之說。王叔和有云：“濕多成五泄”；《景岳全書》云：“泄瀉之本，無不由于脾胃，泄瀉當實脾利水”。脾虛濕盛是泄瀉的主要病機?！渡鼾S遺書》有云：“諸病不愈，必尋到脾胃之中”；《金匱要略》云：“四季脾旺不受邪”。因此，應用中醫(yī)藥治療泄瀉多半從“健脾、利濕”入手。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，由四君子湯加山藥白扁豆蓮肉薏苡仁砂仁桔梗而成，后又加之以陳皮，有益氣健脾、滲濕止瀉之功，治療腹瀉型腸易激綜合征（diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D）療效確切［1，2］。參苓白術散干預IBS 的機制尚不明確，而既往研究都是單體或碎片式研究，未形成網絡，不利于系統(tǒng)化新藥研發(fā)。本文利用網絡藥理學、分子對接等手段挖掘參苓白術散干預IBS 的可能機制，為新藥研發(fā)、中醫(yī)藥的現代化提供思路。

1 數據來源及分析方法

1.1 活性化合物及有效靶點篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學和分析平臺CMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以該網站推薦的生物利用度指標OB≥30% 及類藥性指標DL≥0.18 為條件，分別篩選出參苓白術散各組成藥物符合條件的化合物（活性化合物），同時從對應藥物的Related Targets 欄目中搜集出該方劑涉及的所有靶點，并借助Perl 語言程序篩選出其活性化合物對應的靶點，然后使用uniprot 數據庫和Perl 語言程序將活性化合物對應的靶點轉換為對應的Gene Symbol 并剔除Gene Symbol 為空白的靶點，剩余靶點即為參苓白術散的有效靶點。

1.2 IBS-D 疾病靶點獲取

以“IBS-D”、“D-IBS”、“Diarrhea irritable bowel syndrome”、“Diarrhea irritable bowel syndrome”、“Diarrhea-irritable bowel syndrome”、“irritable bowel syndrome-Diarrhea”、“irritable bowel syndrome-D”和“D-irritable bowel syndrome”為關鍵詞分別在Gene-Cards（https：/ /www. genecards. org /）和OMIM（https：//omim.org/）中查找出與腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）相關的靶點，匯總并刪除重復靶點后得到IBS-D 對應的疾病靶點。

1.3 參苓白術散有效靶點與IBS-D 疾病靶點的交互關系分析

通過R 語言程序對參苓白術散有效靶點與IBS-D 疾病靶點進行Venny 分析，查找兩者之間的交集靶點。

1.4 參苓白術散對IBS-D 的調控網絡分析

使用Perl 語言程序從參苓白術散有效靶點的Gene Symbol 列表和參苓白術散與IBS-D 的交集靶點列表中整理出參苓白術散-參苓白術散的活性化合物-參苓白術散對IBS-D 的作用靶點及IBS-D 疾病四者之間的關系網絡、各個對應節(jié)點的屬性（疾病、基因、藥物或有效成分分子）和有效成分分子列表，然后采用Cytoscape 對獲得的數據進行可視化處理，構建參苓白術散-參苓白術散的活性化合物-參苓白術散對IBS-D 的作用靶點及IBS-D 疾病四個要素間的全局性調控網絡，并利用CytoNCA插件對該調控網絡進行拓撲分析，篩選出網絡中最關鍵的節(jié)點。

1.5 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點蛋白互作網絡（PPI 網絡）構建及核心基因篩選

將Venny 分析得到的參苓白術散有效靶點與IBS-D 疾病靶點間的交集靶點導入String 數據庫（https：//string-db. org/cgi/input. pl）的“Multiple Proteins”欄目中，物種選擇“Homo sapiens”，選取置信度高于0.7 的數據，去掉游離點后導出蛋白互作網絡圖及對應的互作關系列表，然后使用R 語言程序對互作關系列表中各蛋白的連接節(jié)點數進行計數，篩選出連接節(jié)點數最多的蛋白基因作為核心基因并作柱狀圖進行可視化。

1.6 關鍵活性化合物與核心靶蛋白的分子對接模擬分析

取參苓白術散對IBS-D 的調控網絡關鍵靶點及PPI 網絡關鍵靶點的交集作為參苓白術散對IBS-D 作用潛在的最佳靶點，在RCSB PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）中導出各蛋白評分最高的PBD 格式分子結構文件，物種選擇“Homo sapiens”；在CMSP 數據庫中（http：//tcmspw.com/ tcmsp.php）導出參苓白術散對IBS-D 調控網絡中篩選出的關鍵化合物的mol2 格式分子結構文件并在ZINC數據庫（http：//zinc.docking.org/）中導出IBS-D 治療常用西藥匹維溴銨的mol2 格式分子結構文件。采用Ledock 軟件（http：//www.lephar.com/）對上述核心靶點進行預處理后再與上述關鍵化合物進行分子對接模擬，得到分子對接的最小結合能。

1.7 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點（gene ontology，GO）功能富集注釋分析

將參苓白術散有效靶點與IBS-D 疾病靶點間的交集靶點導入DAVID6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），物種選擇“Homo sapiens”，對交集靶點進行GO 功能富集分析，包括生物過程（BP，biological process），細胞組分（CC，cellular component），分子功能（MF，molecular function）三個方面的富集分析。

1.8 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點（ kyoto encyclo-pedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用R 語言程序和Bioconductor 數據庫（https：//www.bioconductor.org/）中的“clusterProfiler”包對Venny 分析得到的交集靶點以物種“hsa”，P-value =0.05，Q-value =0.05 進行KEGG 富集分析。根據KEGG 富集結果使用R 語言程序作相應的氣泡圖并在Bioconductor 數據庫的“pathview”包中下載得到對應的通路圖。

2 結果

2.1 活性化合物及有效靶點篩選

通過TCMSP 軟件以OB≥30% 和DL≥0.18為條件篩選出參苓白術散的活性化合物共184 個，其中人參22 個，茯苓15 個，白術7 個，白扁豆1 個，陳皮5 個，山藥15 個（已去掉1 個重復化合物），甘草89 個（已去掉3 個重復化合物），蓮子10 個（已去掉1個重復化合物），砂仁8 個（已去掉2 個重復化合物），薏苡仁6 個（已去掉3 個重復化合物），桔梗6 個（已去掉1 個重復化合物）。各藥物對應的部分活性化合物信息見表1。

表1 參苓白術散部分活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of some active compounds in Shenlingbaizhu powder

從參苓白術散各組成藥物的Related Targets 欄目中搜集出該方劑涉及的不重復靶點共926 個，其中上述184 個活性化合物對應的靶點為293 個，轉換后得到有Gene Symbol 的有效靶點為244 個。

2.2 IBS-D 疾病靶點獲取

刪除重復項后，從GeneCards 和OMIM 中共搜集到IBS-D 相關靶點共2 724 個。

2.3 參苓白術散有效成分與IBS-D 靶點的Venny分析

Venny 分析結果顯示，參苓白術散的244 個有效靶點中有175 個同時為IBS-D 相關的疾病靶點，如圖1 所示。交集靶點名稱詳見表2。

表2 參苓白術散的活性化合物與IBS 的交集靶點Tab 2 Intersection targets of active compounds of Shenlingbaizhu powder and IBS

圖1 參苓白術散活性成分與IBS-D 靶點Venny 分析圖Fig 1 The active ingredients of Shenlingbaizhu powder and the Venny analysis diagram of IBS-D target

2.4 參苓白術散對IBS-D 的調控網絡分析

采用Cytoscape 軟件將參苓白術散-參苓白術散的184 個活性-參苓白術散對IBS-D 的175 個作用靶點及IBS-D 疾病4 個要素構成的調控網絡進行可視化，如圖2。

圖2 參苓白術散及其活性成分與IBS-D 及參苓白術散對其有效作用靶點的調控網絡Fig 2 The regulatory network of Shenlingbaizhu powder and its active components，IBS-D and Shenlingbaizhu powder on its effective target

表3 中的拓撲分析結果顯示連接節(jié)點數前50位中包含了quercetin、luteolin、kaempferol 等25 個關鍵化合物和PTGS2、ESR1、AR 等23 個關鍵靶點。

表3 調控網絡拓撲分析結果Tab 3 Topology analysis results of regulatory network

2.5 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點蛋白互作網絡（PPI 網絡）構建及核心基因篩選

圖3 為參苓白術散對IBS-D 的作用靶點的PPI網絡圖，統(tǒng)計各靶點的連接節(jié)點數，取排名前30 的節(jié)點作為蛋白互作網絡中的核心基因，包括AKT1、IL6 及JUN 等基因，如圖4 所示。

圖3 交集靶點的PPI 網絡圖Fig 3 PPI network diagram of the intersection targets

2.6 分子對接

取調控網絡中點度中心性排序前50 的節(jié)點中的靶點和參苓白術散活性成分與IBS-D 交集靶點PPI 網絡連接節(jié)點數前30 位的靶點之間的4 個交集靶點PTGS2、ESR1、AR、MAPK14（PDB ID 分別為5KIR、5ACC、2Q7K、5ETC）作為干預網絡中潛在的最佳靶點，分別與調控網絡中點度中心性排序前50 的節(jié)點中包含的全部25 個參苓白術散的核心化合物及參照物匹維溴銨進行分子對接。

由表4 結果可知，參苓白術散25 個關鍵化合物中與PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 這4 個潛在最佳靶點的分子對接結合能低于匹維溴銨與同一靶蛋白結合能的數量分別有12 個、20 個、23 個和5 個，與4 個靶蛋白對接結合能均低于匹維溴銨的潛在最核心合物有4 個，分別是quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）和isorhamnetin（異鼠李素）。說明參苓白術散中有較多組分與IBS-D相關蛋白網絡具有很好的結合作用，即參苓白術散對IBS-D 可進行多靶點干預。

表4 分子對接結果Tab 4 Results of molecular docking

2.7 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點GO 功能富集注釋分析

參苓白術散對IBS-D 的作用靶點的GO 富集分析網絡共涉及246 個生物過程（BP），其中92 個過程P＜0.01，取P最小的20 個BP 過程作圖，如圖5，顯示參苓白術散干預IBS-D 過程最可能與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、不含配體的外源性凋亡信號通路、細胞因子應答、DNA 轉錄和免疫應答等過程相關。

圖5 GO-BP 分析結果Fig 5 GO-BP analysis results

GO 富集分析網絡涉及的細胞組分（CC）共33種，其中P＜0.01 的有18 種，如圖6 所示，結果顯示參苓白術散干預IBS-D 過程最可能與細胞外空隙、細胞質液、細胞核、細胞外基質和原生質膜的組成部分等細胞組分相關。

圖6 GO-CC 分析結果Fig 6 GO-CC analysis results

GO 富集分析網絡涉及的分子功能（MF）總共有54 個，其中P＜0.01 的有21 個，如圖7 所示，顯示參苓白術散干預IBS-D 過程最可能與蛋白質同源二聚活性、蛋白質異源二聚活性、藥物結合、MAP 激酶活性、血紅素結合及腎上腺素結合等分子功能相關。

圖7 GO-MF 分析結果Fig 7 GO-MF analysis results

2.8 參苓白術散對IBS-D 的作用靶點KEGG 通路富集分析

參苓白術散對IBS-D 的作用靶點KEGG 通路富集共涉及172 條，取基因占比前20 的通路作氣泡圖，如圖8 所示。

圖8 KEGG 通路富集分析結果Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis results

KEGG 通路富集分析結果顯示，參苓白術散對IBS-D 的干預最有可能與卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙肝通路、人巨細胞病毒感染、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路、丙肝通路、前列腺癌、TNF 信號通路等相關。典型通路圖見圖9。

圖9 TNF 信號通路圖Fig 9 TNF signaling pathway diagram

3 討論

參苓白術散是治療脾虛濕盛型IBS-D 的主方，由人參、茯苓、白術、白扁豆、陳皮、山藥、甘草、蓮子、砂仁、薏苡仁和桔梗共11 味藥組成，活性化合物數量達到184 個，可作用于IBS-D 的靶點達到175個，因此對IBS-D 干預機制的排列組合極其豐富。

參苓白術散對IBS-D 的調控網絡中，槲皮素以221 個連接節(jié)點數在核心化合物中占據首位，木犀草素、山奈酚、豆甾醇和柚皮素等緊隨其后，成為有效化合物的熱門選項。而調控網絡中的靶點則以前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）和前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）的連接節(jié)點數最多，即具有最大概率參與參苓白術散對IBS-D 的干預過程。在參苓白術散對IBS-D 的作用靶點蛋白互作網絡中，蛋白激酶（AKT1）、白細胞介素-6（IL6）、JUN 蛋白、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）和信號傳導與活化轉錄因子3（STAT3）等蛋白具有最多的連接節(jié)點數，即在參苓白術散對IBS-D 的調控信號通路中最有可能居于核心地位，是潛在的最理想藥物干預靶點選項。在前30 位的核心蛋白中，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 在參苓白術散對IBS-D 的調控網絡中亦居于主導地位，即既可多路徑向上接收藥物有效成分的調控信號，亦可將接收的調控信號向下傳導作用于IBS-D。因此，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14四個靶蛋白是參苓白術散干預IBS-D 潛在的最佳靶點選項。從分子對接結果分析，發(fā)現參苓白術散25 個關鍵化合物中的槲皮素、木犀草素、山奈酚和異鼠李素與PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 這4 個靶蛋白的對接結合能均低于匹維溴銨與相應靶蛋白的對接結合能，即槲皮素、木犀草素、山奈酚和異鼠李素4 個化合物與4 個潛在最佳靶點的結合能力優(yōu)于匹維溴銨。由此可知，參苓白術散對IBS-D 的干預效果無論從靶點的數量上還是與靶點的結合容易程度上評估均優(yōu)于匹維溴銨。槲皮素、木犀草素、山奈酚和異鼠李素均是常見的生物類黃酮，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用［3-9］。前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2），又稱環(huán)氧合酶2（COX-2），是一種誘導酶，在疼痛和炎癥機制等方面發(fā)揮著重要作用，制藥界高度關注的靶點分子之一［10，11］；雌激素受體1（ESR1）為類固醇激素核受體，是雌激素功能的重要中介，在人體內介導各種疾病，調節(jié)生殖、心血管、骨骼、內分泌、神經和免疫系統(tǒng)的生理和病理過程，與多種內分泌相關疾病及多種癌癥等疾病相關［12，13］；雄激素受體（AR）也是一種類固醇激素受體，在人體組織中表達廣泛，與雌激素受體1 一樣，與多種內分泌相關疾病及多種癌癥等疾病相關［14-16］；絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是一種能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其能調節(jié)炎癥介質的產生，并控制細胞的增殖、分化、遷移和存活，其在內皮細胞中的激活導致肌動蛋白重塑、血管生成、DNA 損傷反應，從而對心血管穩(wěn)態(tài)和癌癥進展產生重大影響［17-19］。因此，無論是從關鍵化合物還是潛在最佳靶點方向考慮，參苓白術散干預IBS-D 過程與炎癥、癌癥及內分泌失調等相關反應和通路密切相關。這與諸多研究中炎癥反應參與了IBS-D 的發(fā)生的結論一致［20，21］。GO 分析結果表明，參苓白術散干預IBS-D 過程在生物過程方面最可能與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、不含配體的外源性凋亡信號通路、細胞因子應答、DNA 轉錄和免疫應答等相關，在細胞組分方面最有可能與細胞外空隙、細胞質液、細胞核、細胞外基質和原生質膜的組成部分等相關，而在分子功能方面則最可能與蛋白質同源二聚活性、蛋白質異源二聚活性、藥物結合、MAP 激酶活性、血紅素結合及腎上腺素結合等相關。而KEGG 通路富集分析結果顯示，參苓白術散對IBS-D 的干預最有可能與卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙肝通路、人巨細胞病毒感染、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路、丙肝通路、前列腺癌、TNF 信號通路等相關，與前述分析及文獻報道結果相符。

綜上所述，參苓白術散對IBS-D 的干預效果無論從靶點的數量上還是與靶點的結合容易程度上評估均優(yōu)于匹維溴銨，其干預IBS-D 過程可能與炎癥、癌癥及內分泌失調等相關反應和通路密切相關，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚和異鼠李素為干預網絡中潛在的最核心化合物，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 這4 個靶蛋白為干預網絡中潛在的最佳靶點選項。