牟愛生 葉丹 彭維祺 孫衛(wèi)平 榮光

摘要為了解儋州市鴨高致病性禽流感 H5和 H7亞型二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，于 2020年 6月在全市12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)鴨場（戶）采集289份血清，采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)（ HA-HI ）對(duì)禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，2020年 6月采集的289份鴨血清樣品中，鴨禽流感 H5以及 H7陽性個(gè)體數(shù)分別為249、203份，免疫抗體合格率分別為 86%、70%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的免疫抗體水平達(dá)到70%的標(biāo)準(zhǔn)。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果較好，有較強(qiáng)的保護(hù)力。

關(guān)鍵詞高致病性禽流感;免疫效果;評(píng)估

中圖分類號(hào) S852.4??????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A?????? ??DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.013

Evaluation of Immune Effect of Highly Pathogenic Avian Influenza in Ducks in Danzhou， Hainan

MOU Aisheng1??? YE Dan2??? PENG Weiqi2??? SUN Weiping2??? RONG Guang2

（1. Danzhou Service Center for Animal Husbandry and Fisheries， Danzhou， Hainan 571700， China;2. Tropical Crops Genetic Re-

sources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract?? In order to understand the immune effect of the subtypes H5 and H7 of highly pathogenic avian influenza in ducks in Danzhou， Hainan， 289 serum samples were collected from duck farms （households） in 12 towns of Danzhou in the spring of 2020. The hemagglutination and hemagglutination inhibition tests （HA-HI） were used to detect the immune antibodies of avian influenza subtypes H5 and H7. The results showed that in the 289 duck serum samples collected in the spring of 2020， there are 249 and 203 duck individuals having positive antibody of avian influenza subtypes H5 and H7， respectively， with 86% and 70% of the duck individuals with qualified immune antibodies against the subtypes H5 and H7， respectively， which are in line with the immune antibody level of upto 70% provided for by the Ministry of Agriculture and Rural Areas. The results showed that the bivalent H5+ H7 avian influenza inactivated vaccine has good immune effect and strong protection.

Keywords?? highly pathogenic avian influenza; immune effect; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI ），又稱為禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian? Influenza? Virus， AIV ）引發(fā)多種禽類感染的疾病綜合征[1]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ OIE ）列為 A 類傳染病，在我國被列為一類傳染病[2-5]。根據(jù)對(duì)禽類致病性不同，可分為高、低和非致病性3 種類型[6]。其中，高致病性禽流感（Highly? Pathogenic? Avian? Influenza，? HPAI ）H5亞型和 H7亞型，傳染性最強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率最高，造成的疫情程度最重，對(duì)家禽和人類危害最嚴(yán)重[7]。因此，接種疫苗以及對(duì)家禽進(jìn)行禽流感的檢測是預(yù)防和控制禽流感發(fā)生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5 和 H7免疫過程中，由于場地、母源抗體干擾、操作方法等，往往造成免疫保護(hù)不夠[9-11]。本研究對(duì)儋州市12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鴨場隨機(jī)采樣，分離血清，采用血凝（ HA ）和血凝抑制（ HI ）試驗(yàn)方法對(duì)鴨禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進(jìn)行檢測，并對(duì)抗體水平進(jìn)行分析?？陀^評(píng)價(jià)儋州市鴨 H5、H7亞型免疫效果，以期對(duì)儋州市鴨禽流感抗體水平有一個(gè)正確的認(rèn)識(shí)，對(duì)海南省無規(guī)定動(dòng)物疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設(shè)具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑阿氏（Alsevers）液（自配）; 1%雞紅細(xì)胞懸液（自配）;pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亞型（ Re-11株）血凝血抑實(shí)驗(yàn)抗原（國生生物，試劑批號(hào)：20191106）;禽流感病毒 H7亞型（ Re-2株）血凝血抑實(shí)驗(yàn)抗原（國生生物，試劑批號(hào)：20191014）。

1.1.2? 儀器設(shè)備微量移液器;槍頭;96孔 V 型微量反應(yīng)板;微型振蕩器;高速離心機(jī);恒溫箱。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品采集于2020年 6月在儋州市12個(gè)鎮(zhèn)的養(yǎng)鴨場（戶）采集血樣289份。采血時(shí)，使家禽側(cè)臥保定，展開內(nèi)側(cè)翅膀，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球?qū)Σ裳课贿M(jìn)行消毒，然后將采血器針尖斜口向上，以 30°傾斜插入翅靜脈，緩緩抽取血液，達(dá)到所需血量后，用酒精棉球按壓止血[12-13]。取血樣2 000 r/min 離心5～8 min，取上清液于1.5 mL 滅菌離心管中，?20℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2? 血凝血抑實(shí)驗(yàn)（ HA ）

1.2.2.1? 血凝實(shí)驗(yàn)（ HA ）（1 ）分別吸取0.025 mL PBS 液加到酶標(biāo)板微孔的1～12孔中，換滴頭。

（2 ）吸取病毒懸液0.025 mL 加入至第1 孔混勻，再從第1 孔吸取0.025 mL 加入至第2 孔混勻，如此反復(fù)，依次稀釋至第11孔，再從第11孔吸取 0.025 mL，棄之，換滴頭。

（3 ）每孔分別加入 PBS 0.025 mL、體積分?jǐn)?shù)為 1%的雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL ，振蕩混勻，室溫（20～25℃）靜置40 min，觀察結(jié)果。

結(jié)果判定∶傾斜反應(yīng)板，以紅細(xì)胞無呈淚滴狀流淌（完全血凝）的抗原的最高稀釋倍數(shù)表示一個(gè)血凝單位（ HAU ）。本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)血凝單位為256。

1.2.2.2? 血凝抑制實(shí)驗(yàn)（ HI ）（1 ）根據(jù)血凝（HA ）試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU 的病毒抗原。

（2 ）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加入0.05 mL PBS。

（3 ）吸取0.025 mL 血清加入第1 孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025 mL 于第2 孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.25 mL 棄去。

（4 ）1～11孔為加入含4HAU 混勻的病毒抗原液 0.025 mL，室溫（20℃）靜置至少30 min。

（5 ）每孔加入0.025 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液輕輕混勻，靜置約40 min （室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)紐扣狀沉于孔底。

結(jié)果判定：以完全抑制4 個(gè) HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。 HI 價(jià)小于或等于3log2判定 HI 試驗(yàn)陰性; HI 價(jià)大于4log2為陽性。

2? 結(jié)果與分析

于2020年 6月檢測儋州市12個(gè)鎮(zhèn)的養(yǎng)鴨場（戶）鴨血清289份，抗體檢測結(jié)果見表1。從表1 可以得出，2020年春季儋州市12個(gè)鎮(zhèn)的鴨禽流感 H5免疫合格率分別為100%、100%、0、 100%、100%、100%、67%、100%、67%、95%、100%、100%，12個(gè)鎮(zhèn)中有9 個(gè)鎮(zhèn)的抗體合格率均達(dá)到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標(biāo)準(zhǔn)（群體抗體水平≥ 70%）。其中，鴨禽流感 H5亞型抗體合格率達(dá)到 100%的鎮(zhèn)有 A 鎮(zhèn)、 B 鎮(zhèn)、 D 鎮(zhèn)、 E 鎮(zhèn)、 F 鎮(zhèn)、 H 鎮(zhèn)、 K 和 L 鎮(zhèn)，達(dá)到90%≤抗體合格率<100%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 J 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明大多數(shù)地區(qū)鴨禽流感 H5 亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實(shí)到位，筑牢了免疫屏障。除此之外， C 鎮(zhèn)、 G 鎮(zhèn)和 I 鎮(zhèn)的抗體水平不達(dá)標(biāo)（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，鴨禽流感 H5 亞型的防疫工作還應(yīng)進(jìn)一步扎實(shí)。

從表2 可以得出，2020年春季儋州市12個(gè)鎮(zhèn)的鴨禽流感 H7 免疫合格率分別為100%、 100%、0、100%、100%、70%、67%、3%、100%、100%、95%、0，12個(gè)鎮(zhèn)中有8 個(gè)鎮(zhèn)的抗體合格率均達(dá)到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標(biāo)準(zhǔn)（群體抗體水平 ≥70%）。其中，鴨禽流感 H7亞型抗體合格率達(dá)到100%的有 A 鎮(zhèn)、 B 鎮(zhèn)、 D 鎮(zhèn)、 E 鎮(zhèn)、 I 鎮(zhèn)和 J? 鎮(zhèn)，達(dá)到90%≤抗體合格率<100%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 K 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明這些地區(qū)鴨禽流感 H7 亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實(shí)到位，筑牢了免疫屏障。在70% ≤抗體合格率<80%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 F 鎮(zhèn)，表明 F 鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進(jìn)一步加強(qiáng)，努力做得更好。除此之外， C 鎮(zhèn)、 G 鎮(zhèn)、 H 鎮(zhèn)和 L 鎮(zhèn)的抗體水平不達(dá)標(biāo)（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，鴨禽流感 H5亞型的防疫工作還應(yīng)進(jìn)一步扎實(shí)。

結(jié)合表1 、2可知，檢測的289份鴨血清中，鴨禽流感 H5、H7 亞型免疫抗體陽性數(shù)分別是249、203份，合格率分別是86%、70%，H5、H7亞型免疫抗體合格率均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。

3? 討論與結(jié)論

從檢測結(jié)果上看，儋州市鴨禽流感 H5和 H7亞型整體免疫效果良好，免疫抗體合格率均達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)，表明2020年春季儋州市的鴨總體上已建立起較好的免疫機(jī)能屏障，禽流感流行風(fēng)險(xiǎn)較低;但同時(shí)地存在少數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)禽流感抗體水平較低的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能與鴨群產(chǎn)生抗體時(shí)間、疫苗的質(zhì)量、免疫操作的規(guī)范程度、鴨群的飼養(yǎng)環(huán)境、鴨機(jī)體的健康情況等因素有關(guān)[15-18]。

從不同類型鴨禽流感免疫抗體水平上看， H5亞型抗體合格率整體高于 H7 亞型，這與冬春季節(jié)的防疫工作落實(shí)情況、水禽機(jī)體有關(guān)，也可能與不同疫苗毒株有不同的免疫原性有關(guān)[14，19]。

從檢測結(jié)果可知，2020年春季儋州市鴨禽流感 H5以及 H7合格率分別是86%、70%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的標(biāo)準(zhǔn)。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)苗的免疫效果較好，有較強(qiáng)的保護(hù)力。同時(shí)，針對(duì)抗體水平合格率不達(dá)標(biāo)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，建議全面排查原因，及時(shí)補(bǔ)免，進(jìn)一步提高免疫抗體合格率，強(qiáng)化免疫屏障。

參考文獻(xiàn)

[1]?? 胡玉軍. 烏魯木齊地區(qū)特種經(jīng)濟(jì)禽類高致病性禽流感免疫效果評(píng)估與應(yīng)用[D]. 烏魯木齊： 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[2]?? 尹麗萍. 農(nóng)村散養(yǎng)土雞禽流感免疫效果初探[J]. 山東畜牧獸醫(yī)， 2015， 36（6）：14-15.

[3]?? 汪淑芳， 周春宇. H5型高致病性禽流感免疫抗體監(jiān)測及免疫效果分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007（30）： 9537-9537+9540.

[4]?? HuaLan Chen. H5N1 avian influenza in China[J]. Science in China Series C： Life Sciences， 2009， 52（5）.

[5]?? 肖拉拉， 楊立強(qiáng)， 王燚， 等. 重組禽流感 H5+H7二價(jià)滅活疫苗的免疫效果評(píng)估與分析[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)， 2019， 43（6）：9-10.

[6]?? 陸偉偉， 呂新慧， 熊勇兵， 等. 湖北鄂州市春季養(yǎng)禽高致病禽流感免疫效果監(jiān)測[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志， 2021， 40（1）：23-24+27.

[7]?? 蔣彩霞， 陶宏衛(wèi). 蛋雞禽流感母源抗體監(jiān)測及免疫效果評(píng)估[J]. 中國動(dòng)物保健， 2020， 22（12）：29-31.

[8]?? 李苗， 劉香林， 甘一波， 等. 玉林市規(guī)模場重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗免疫效果評(píng)估[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)， 2021， 37（3）：137-140.

[9]?? 韋珊珊， 王益鵬， 周運(yùn)先， 等. 2018年—2019年賓陽縣高致病性禽流感免疫抗體檢測結(jié)果分析[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)， 2021， 37（2）：61-63+85.

[10]? 呂文波. 影響雞疫病免疫效果原因調(diào)查與建議[J]. 中國畜禽種業(yè)， 2020， 16（3）：181.

[11]? Abdelwhab E M， Grund C， Aly M M， et a1. Influence ofmate-rnal immunity on vaccine efficacy and susceptibility of one d- ay old chicks against Egyptian highly pathogenic avian influ- eliza H5N1[J]. Veterinary Microbiology， 2012， 155（1）：13-20.

[12]? 范坤江， 張?jiān)o， 何立雄. 淺談家禽采血方法與體會(huì)[J].中國畜禽種業(yè)， 2020， 16（7）：23.

[13]? 李斌. 基層家禽采血技術(shù)的應(yīng)用方法[J]. 當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2019（2）：59.

[14]? 王娟娟.2014年柳城縣畜禽主要疫病免疫抗體水平監(jiān)測及分析[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2016.

[15]? 唐丹萍. 影響放養(yǎng)雞疫病免疫效果的原因調(diào)查與建議[J].湖北畜牧獸醫(yī)， 2017， 38（2）：13-14.

[16]? 張明會(huì). 如何保證雞群疫苗免疫效果的高效性[J]. 家禽科學(xué)， 2013（2）：39-40.

[17]? 池建峰. 影響禽流感免疫效果的因素分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)， 2012（5）：35-36.

[18]? 顧蕓， 姚占軍， 陳偉， 等. 通過抗體監(jiān)測分析影響免疫水平的原因[J]. 中國動(dòng)物保健， 2013， 15（11）：47-48.

[19]? 宋果， 歐陽昌勇， 李家輝， 等. 寧遠(yuǎn)縣2020年秋季家禽禽流感抗體水平檢測和分析[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)， 2021（2）：15-17.

（責(zé)任編輯林海妹）