孔維麗，崔 筱，劉 芹，胡素娟，宋凱博，王彥坡，吳 杰，張玉亭

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

平菇 (Pleurotus ostreatus)又名糙皮側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycoat）蘑菇綱（Agaricomycetidae）蘑菇目 （Agaricales）側(cè)耳科 （Pleurotaceae）側(cè)耳屬 （Pleurotus）[1]。平菇是我國(guó)第三大品種，年產(chǎn)量686.47萬(wàn)噸，河南省是平菇生產(chǎn)大省，年產(chǎn)量約115萬(wàn)噸[2]。2019年我國(guó)人均GDP己經(jīng)突破一萬(wàn)美元大關(guān)[3]，城鄉(xiāng)居民的消費(fèi)需求不斷變化升級(jí)，消費(fèi)理念大幅改變；食用菌作為健康、綠色食品，受到消費(fèi)者喜愛(ài)，由季節(jié)性消費(fèi)向逐步周年消費(fèi)轉(zhuǎn)變，消費(fèi)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變促使食用菌由季節(jié)性栽培向工廠化周年栽培方式轉(zhuǎn)變。金針菇（Flammulina velutipes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、蟹味菇（Hypsizygus tessellatus）、雙孢蘑菇 （Agaricus bisporus）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工廠化周年化生產(chǎn)。品種是工廠化栽培的關(guān)鍵，金針菇、蟹味菇工廠化品種一茬菇的生物學(xué)效率達(dá)到100%以上[4-5]，平菇工廠化栽培成為近年研究熱點(diǎn)[6-7]。生產(chǎn)中平菇季節(jié)性栽培所用的平菇品種一般出三潮～四潮菇，生物學(xué)效率達(dá)到80%～100%，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，難以滿足工廠化生產(chǎn)方式的需要，因此急需選育出生產(chǎn)周期短，一茬菇生物學(xué)效率高，出菇整齊集中，適宜工廠化栽培的平菇新品種。試驗(yàn)以國(guó)審黑色高產(chǎn)平菇菌株P(guān)99和黑色野生菌株NY-2為親本，通過(guò)單孢雜交的方法選育出適宜工廠化栽培的平菇新品種；該品種在出菇集中，一茬菇生物學(xué)效率方面顯著高于生產(chǎn)主栽品種，為平菇工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

親本菌株P(guān)99，引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，保存于河南省食用菌種質(zhì)資源庫(kù)；親本菌株NY-2，于商丘地區(qū)野生采集，保存于河南省食用菌種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（去皮土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL）。培養(yǎng)料配方為棉籽殼98%，石灰2%。

1.3 方法

1.3.1 孢子收集及單孢分離

孢子收集及單孢分離的方法按照參考文獻(xiàn)[8]。

1）孢子收集

以平菇菌株P(guān)99和NY-2為親本，熟料栽培，挑選第一茬朵型圓整、顏色均勻的整朵子實(shí)體為種菇，8成～9成熟時(shí)采收。取單個(gè)菌蓋，菌褶向下置于潔凈干燥的有色紙上，25℃～28℃培養(yǎng)24 h，可見(jiàn)紙面有一層灰白色孢子印。

2）單孢分離

采用一步稀釋法，用接種鏟取0.1 mm2孢子印于400 mL無(wú)菌純凈水，搖勻。取1 mL涂布于9 cm的PDA平板培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5 d。孢子萌發(fā)后用1 μL槍頭的尖端部分，在孢子萌發(fā)處垂直打孔，移入新的平板。挑取數(shù)量80個(gè)～100個(gè)，插片25℃培養(yǎng)。菌絲長(zhǎng)至插片0.4 mm～0.5 mm時(shí)，顯微鏡檢有無(wú)索狀聯(lián)合，無(wú)索狀聯(lián)合的為單孢菌絲，分別編號(hào)。P99簡(jiǎn)稱P，編號(hào)P1～P100；NY-2簡(jiǎn)稱Y，編號(hào)Y1～Y80。

1.3.2 單孢雜交

根據(jù)單孢菌絲生長(zhǎng)速度、氣生菌絲濃密度將單孢菌絲分類(lèi)。挑選菌絲濃密、長(zhǎng)速快的平板2皿，菌絲稀疏、長(zhǎng)速快的平板2皿，菌絲濃密、長(zhǎng)速慢的平板1皿，菌絲稀疏、長(zhǎng)速慢的平板1皿。每個(gè)親本挑選6個(gè)單孢菌絲為配子，每個(gè)配子培養(yǎng)基用4 mm打孔器打孔，挑取2個(gè)配子菌絲塊接種于同一培養(yǎng)皿，間距1 cm。25℃對(duì)峙培養(yǎng)5 d～7 d后，菌絲體融合，融合處形成拮抗線，于2個(gè)菌絲塊外側(cè)0.5 cm處挑取菌絲，轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基，每側(cè)轉(zhuǎn)接5皿～6皿。每2個(gè)配子雜交獲得2個(gè)雜交子，共獲得72個(gè)雜交子。

1.3.3 雜交子篩選

配子雜交之后的獲得的雜交子成為姊妹對(duì)，二者間根據(jù)菌絲長(zhǎng)勢(shì)，淘汰菌絲長(zhǎng)勢(shì)稀疏、生長(zhǎng)速度較慢的雜交子。各姊妹對(duì)兩兩之間挑選菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好的進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，挑選有拮抗反應(yīng)雜交子進(jìn)入出菇篩選試驗(yàn)。

1.3.4 熟料袋栽篩選

初篩栽培時(shí)間為2015年9月5日。按栽培料的配方，采用熟料栽培方式，菌袋使用規(guī)格為14 cm×18 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，2.5 cm套環(huán)封口，每袋裝干料200 g。每個(gè)雜交子接種10袋，24℃～25℃培養(yǎng)，菌絲滿袋后，去除套環(huán)，移入棚內(nèi)進(jìn)入出菇管理，棚內(nèi)溫度10℃～30℃，濕度70%～90%，光照、二氧化碳濃度自然。測(cè)量第一茬菇現(xiàn)蕾時(shí)間、產(chǎn)量、子實(shí)體外觀特性，篩選黑色或藍(lán)黑色、柄短、圓整、貝殼形或者扇形、出菇早、產(chǎn)量高的為優(yōu)勢(shì)菌株。

1.3.5 工廠化瓶栽篩選

以熟料袋栽篩選的優(yōu)勢(shì)菌株為試驗(yàn)菌株，采用工廠化栽培常用的1 100 mL塑料瓶，每瓶裝栽培料干料250 g，每個(gè)菌株接種4筐，每筐16瓶。24℃暗光培養(yǎng)，二氧化碳濃度≤0.08%，空氣濕度60%，菌絲滿瓶后，13℃～15℃低溫處理3 d～5 d?，F(xiàn)蕾揭去瓶蓋，移入出菇室，保持室內(nèi)溫度13℃～16℃，濕度80%～90%，二氧化碳濃度≤0.06%，光照強(qiáng)度150 lx～200 lx。子實(shí)體7成～8成熟時(shí)采收，比較菌株間出菇率（Rd，%），其計(jì)算公式為：

式中：S為總瓶數(shù)（瓶）；X為未出菇瓶數(shù)（瓶）。

觀察子實(shí)體性狀，測(cè)定產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率，篩選出一茬菇生物學(xué)效率50%以上的優(yōu)良菌株，作為下一輪參試品種。生物學(xué)效率（BE，%）的計(jì)算公式為：式中：Ffw為子實(shí)體鮮重（g）；Sdw為基質(zhì)干重（g）。

1.3.6 優(yōu)勢(shì)菌株品種比較

以1.3.5中篩選的優(yōu)勢(shì)菌株為參試菌株，以生產(chǎn)中灰美2號(hào) （CK1）、黑抗 650（CK2）、農(nóng)平 4號(hào)（CK3）主栽品種及P99（親本）為對(duì)照菌株，采用瓶栽和袋栽2種方式，每個(gè)品種接種10筐，每筐16瓶。6成～7成熟時(shí)采收，隨機(jī)抽取3筐測(cè)定子實(shí)體產(chǎn)量、單朵重、子實(shí)體性狀。計(jì)算生物學(xué)效率、成菇比例，分析優(yōu)勢(shì)菌株的生物學(xué)特性。

1.3.7 品質(zhì)分析

1.3.6中篩選的優(yōu)勢(shì)菌株，子實(shí)體6成～7成熟時(shí)采收，40℃烘干后，測(cè)定優(yōu)勢(shì)菌株與對(duì)照菌株CK1、CK2、CK3、P99的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、氨基酸含量。氨基酸采用GB 5009.124-2016食品中氨基酸的測(cè)定方法[9]，蛋白質(zhì)采用GB 5009.5-2016食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[10]，粗脂肪采用GB 5009.6-2016食品中脂肪的測(cè)定方法[11]。

1.3.8 多點(diǎn)栽培試驗(yàn)

將1.3.6篩選得到的優(yōu)良平菇菌株分別在新鄉(xiāng)、周口、鄭州等地采用當(dāng)?shù)赜衩仔驹霞芭浞竭M(jìn)行熟料栽培，以當(dāng)?shù)刂髟云贩N為對(duì)照，檢測(cè)該品種的適應(yīng)性。

1.3.9 生物學(xué)特性分析

1）最適生長(zhǎng)溫度篩選

以PDA為培養(yǎng)基，母種試管接種后，25℃培養(yǎng)4 d，再分別置于0℃、3℃、5℃、10℃、15℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃培養(yǎng)，每個(gè)處理6皿。觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度，篩選出菌絲致死溫度及最適宜生長(zhǎng)溫度。

2）最適出菇溫度篩選

菌絲滿袋后，分別放置于區(qū)間溫度為10℃～15℃、16℃～20℃、21℃～25℃，每個(gè)溫度處理 30袋。觀察出菇早晚，計(jì)算產(chǎn)量生物學(xué)效率，產(chǎn)量最高的出菇溫度為最適出菇溫度。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2010，數(shù)據(jù)的差異顯著性分析采用SPSS 19。

2 結(jié)果分析

2.1 單孢菌絲篩選

根據(jù)單孢菌絲長(zhǎng)勢(shì)濃密度和快慢差異，分為：A1型（快、濃密）、B1型（快、稀疏）、A2型（慢、濃密）、B2型（較慢、濃密）。分別挑選A1型2個(gè)，B1型2個(gè)，A2型、B2型各1個(gè)，共6個(gè)單孢菌株作為雜交材料，見(jiàn)表1。

表1 單孢菌株編號(hào)Tab.1 Single spore strains number

2.2 雜交子篩選

單孢菌絲兩兩配對(duì)獲得36對(duì)、72個(gè)雜交子，根據(jù)雜交子菌絲形態(tài)差異篩選出菌絲生長(zhǎng)快、長(zhǎng)勢(shì)濃密的雜交子49個(gè)，49個(gè)雜交子兩兩之間做拮抗反應(yīng)，共1 176組，雜交子之間均有拮抗反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

圖1 姊妹對(duì)雜交子之間的拮抗反應(yīng)Fig.1 Antagonistic reaction between sisters to hybrids

由圖1所示，單孢菌株Y6分別與P3、P7、P9、P10、P14單孢菌株雜交，獲得Y6P3、Y6P7、Y6P9、Y6P14、Y6P10雜交子。Y6P3雜交子與 Y6P7、Y6P9、Y6P14、Y6P10姊妹對(duì)之間存在溝型拮抗線，表明Y6PX系列姊妹對(duì)之間為差異菌株。

2.3 初選優(yōu)勢(shì)菌株

初篩菌株部分子實(shí)體性狀見(jiàn)圖2，其產(chǎn)量及性狀特征統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

圖2 部分菌株子實(shí)體性狀Fig.2 Fruit body characters of some strains

表2 參試菌株產(chǎn)量及子實(shí)體性狀Tab.2 The yield and fruit body characteristics of tested strains

由圖2及表2可知，按照1.3.4的栽培方法，49個(gè)雜交菌株產(chǎn)量、生物學(xué)性狀表現(xiàn)出豐富的差異性。顏色從灰白到淺灰、深灰、藍(lán)黑和黑色，菌柄有短、中長(zhǎng)、長(zhǎng)類(lèi)型，菌蓋形狀有內(nèi)卷、平展、貝殼狀等，菌蓋厚、薄不同。最早出菇時(shí)間為2015年10月19日，最晚出菇時(shí)間2015年11月26日，P7Y6菌株由于感蟲(chóng)、感病未能出菇。設(shè)定初選指標(biāo)為菇型圓整、柄短，菌蓋顏色深、厚薄適中，生物學(xué)效率50%以上，共篩選出15個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株：P14Y6、P14Y9、Y9P9、Y9P7、Y9P10、Y6P10、P3Y6、Y6P3、Y6P9、Y6P14、Y9P14、P10Y9、Y9P3、Y8P3、P10Y6。

2.4 工廠化栽培初選

15個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株一茬菇產(chǎn)量及子實(shí)體性狀統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 15個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株產(chǎn)量及子實(shí)體特性Tab.3 The yield and fruit body characteristics of 15 superiority strains

由表3可知，參試菌株出菇整齊度、產(chǎn)量、子實(shí)體性狀、顏色等差異顯著。P14Y6菌株現(xiàn)蕾整齊，出菇整齊度為93.8%，較其他菌株高6.3%～62.5%；一茬菇每瓶平均產(chǎn)量達(dá)到178 g，生物學(xué)效率71.2%，較其他菌株高5.2%～38%；菌蓋幼時(shí)黑色，成熟藍(lán)黑，直徑3.0 cm～4.5 cm，厚1.0 cm～1.2 cm，韌性強(qiáng)；菌柄短，長(zhǎng)1.0 cm～1.2 cm，直徑0.5 cm～1.0 cm；較其他品種更符合工廠化生產(chǎn)要求，因此該菌株確定為優(yōu)勢(shì)菌株。

2.5 品種比較試驗(yàn)

優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)14Y6與對(duì)照菌株的出菇情況及子實(shí)體性狀見(jiàn)表4、表5。

表5 參試菌株子實(shí)體性狀Tab.5 Fruit body characteristics of the tested strain

由表4可知，采用瓶栽P14Y6菌株的菌絲滿瓶天數(shù)為29 d，與3個(gè)對(duì)照菌株（CK1、CK2、CK3）差異不顯著，較親本菌株慢2 d；參試菌株出菇率的整齊度為93.8%，與親本菌株P(guān)99一致，較3個(gè)對(duì)照菌株高12.5%～25.0%；平均單瓶產(chǎn)量185 g，一茬菇平均生物學(xué)效率為74%，顯著高于3個(gè)對(duì)照品種及親本菌株10%～14%，最高達(dá)到88%；該菌株成菇率為64.5%，較親本及對(duì)照高24.5%～32.2%。6成～7成熟時(shí)，菌蓋藍(lán)黑色，直徑5 cm～6 cm，韌性強(qiáng)，菌柄長(zhǎng)0.5 cm～0.7 cm，較其他品種短，菌蓋厚薄適中，較適合瓶栽工廠化生產(chǎn)。

2.6 品質(zhì)分析結(jié)果

菌株P(guān)14Y6的營(yíng)養(yǎng)分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 參試菌株?duì)I養(yǎng)分析結(jié)果Tab.6 Results of nutrition of test strain analysis

由表6可知，優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)14Y6菌株含有17種氨基酸，每100克干菇總氨基酸含量17.12 g，蛋白質(zhì)含量25 g，比親本略低，高于3個(gè)對(duì)照菌株1.3%～3.4%；粗脂肪含量1.6 g，與親本相當(dāng)，高于CK2、CK3；粗纖維7.72 g低于CK3，高于其他菌株。

2.7 多點(diǎn)栽培試驗(yàn)結(jié)果

在新鄉(xiāng)、鄭州、原陽(yáng)3個(gè)試點(diǎn)進(jìn)行瓶栽和袋栽2種模式栽培試驗(yàn)；每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)100袋，以黑抗650為對(duì)照，其參試結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同地區(qū)參試菌株生物學(xué)效率Tab.7 Biological efficiency of tested strains in different regions

由表7可知，新鄉(xiāng)、鄭州試驗(yàn)點(diǎn)該菌株袋栽第一茬菇生物學(xué)效率分別為63.6%，69.5%，較對(duì)照高8.3%～13.1%。原陽(yáng)試驗(yàn)點(diǎn)瓶栽生物學(xué)效率67.8%，較對(duì)照高13.2%。3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)在生產(chǎn)過(guò)程中均未出現(xiàn)黃枯病。

該品種2017年通過(guò)河南省農(nóng)作物品種鑒定，獲得證書(shū)，定名為黑平16-1。

2.8 菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)特性結(jié)果分析

2.8.1 菌絲生長(zhǎng)溫度分析

菌株黑平16-1在不同溫度下菌絲生長(zhǎng)情況見(jiàn)表8。

表8 不同培養(yǎng)溫度菌絲生長(zhǎng)速度Tab.8 Mycelial growth rates at different culture temperatures

由表8結(jié)果表明，該菌株在3℃以下菌絲不能生長(zhǎng)，3℃～35℃均能正常生長(zhǎng)。菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著，最適宜生長(zhǎng)溫度25℃～28℃；菌絲生長(zhǎng)致死溫度為40℃（24 h）；溫度升高至30℃以上，菌絲長(zhǎng)勢(shì)稍稀疏。

2.8.2 出菇溫度分析

不同溫度對(duì)菌株黑平16-1出菇的影響見(jiàn)表9。

表9 溫度對(duì)出菇率、產(chǎn)量的影響Tab.9 Influence of temperature on the rate of fruiting and yield

由表9可知，10℃～15℃條件下，該菌株出菇率93.5%，分別較 16℃～20℃、21℃～26℃高 3.5%～6.0%。每瓶平菇產(chǎn)量185 g，生物學(xué)效率74%，產(chǎn)量分別較其他處理高60 g，生物學(xué)效率提高17.2%～20.8%；因此該品種最適宜出菇溫度為10℃～15℃。

3 結(jié)論與討論

平菇工廠化生產(chǎn)是未來(lái)食用菌生產(chǎn)發(fā)展的趨勢(shì)，對(duì)品種的要求與傳統(tǒng)栽培模式差異較大。韓國(guó)對(duì)工廠化瓶栽平菇的研究較多，據(jù)現(xiàn)有報(bào)道一茬菇的生物效率最高為84%[12]。目前國(guó)內(nèi)工廠化平菇的栽培尚處于起步階段，專用品種的選育未見(jiàn)報(bào)道；單孢雜交仍然是食用菌品種選育的重要途徑，如何從大量的孢子中挑選優(yōu)良的單孢菌絲是單孢雜交育種的關(guān)鍵，根據(jù)陳士瑜等[13]的經(jīng)驗(yàn)以不超過(guò)10個(gè)單孢為適宜。而香菇（Lentinus edodes）中同種交配型的孢子單核體遺傳相似性僅僅分別為66.3%，71.7%[14]；平菇與香菇均屬于典型的四極性異宗配合[15]；因此單孢之間的遺傳差異性較為豐富，挑選的單孢雜交菌株需要具備較高的代表性，否則很難通過(guò)雜交選育出優(yōu)良菌株。

在篩選單孢的過(guò)程中，一些生長(zhǎng)較慢的單孢往往被忽略，但是生長(zhǎng)緩慢的菌株可能與帶有不親和的因子有關(guān)，在雜交過(guò)程生長(zhǎng)緩慢的單孢菌絲并不影響雙核菌絲的生長(zhǎng)。因此試驗(yàn)以長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度2個(gè)指標(biāo)結(jié)合選取了6個(gè)不同類(lèi)型的單孢子菌株，在雜交組合菌株的篩選過(guò)程中則淘汰了雙核菌絲生長(zhǎng)較慢、長(zhǎng)勢(shì)稀疏的菌株，減少了后續(xù)栽培篩選數(shù)量。如果這種單孢菌絲形態(tài)表型差異可作為篩選鑒定的途徑，則會(huì)大大提高育種效率，當(dāng)然，后續(xù)還需要進(jìn)一步研究菌絲形態(tài)差異與單核體遺傳配合力研究作為理論支撐。

以黑色高產(chǎn)平菇菌株P(guān)99與野生平菇菌株NY-2為親本，通過(guò)單孢雜交，多次栽培篩選，獲得了優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)14Y6。該菌株子實(shí)體疊生，短柄，藍(lán)黑色，菌蓋較厚，韌性強(qiáng)；菌絲生長(zhǎng)溫度為3℃～35℃，最適宜出菇溫度11℃～15℃。與親本及3個(gè)生產(chǎn)菌株相比，該菌株工廠化瓶栽出菇整齊度為93.8%，高于對(duì)照菌株12.5%～25%；平均產(chǎn)量185 g/瓶，最高產(chǎn)量220 g/瓶，一茬菇平均生物學(xué)效率74%；高于3個(gè)對(duì)照品種及親本菌株10%～14%；在多點(diǎn)試驗(yàn)中瓶栽和袋栽均高于對(duì)照菌株。2017年通過(guò)了河南省農(nóng)作物品種鑒定，命名為黑平16-1。