李奕莛，劉璐，趙軍英，喬為倉(cāng)，陳君，劉彥品，侯俊財(cái)，陳歷俊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心北京市乳品工程技術(shù)研究中心母乳研究技術(shù)創(chuàng)新中心，北京 100163）

0 引言

膽固醇是參與人體生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但血清中膽固醇水平過(guò)高也會(huì)造成負(fù)面影響，研究表明血清膽固醇水平過(guò)高容易發(fā)生全身動(dòng)脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致心臟病，腦梗死等疾病[1]。隨著生活水平的提高，我國(guó)居民血清總膽固醇水平呈直線上升，2015年中國(guó)成年人血脂異?；疾÷蕿?7.5%，其中高膽固醇血癥患病率高達(dá)9.6%，高膽固醇疾病嚴(yán)重影響了我國(guó)居民的身體健康[2]。

目前對(duì)于膽固醇疾病的最主要的治療方式為藥物治療，但藥物治療存在成本高、副作用大、治療周期長(zhǎng)等弊端；此外還可以進(jìn)行飲食干預(yù)，但飲食干預(yù)不好控制，對(duì)患者自控能力要求嚴(yán)格；應(yīng)用乳酸菌來(lái)降低血清膽固醇成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)眾多研究表明，當(dāng)患者的血清膽固醇含量下降后，誘發(fā)其他疾病的可能性也顯著降低[3]，許多動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)也證明了通過(guò)乳酸菌來(lái)降解膽固醇是一種可行的方式[4-5]。腸道中的乳酸菌，對(duì)維持腸道微生態(tài)以及提高免疫能力有重要作用，因此通過(guò)乳酸菌來(lái)治療和預(yù)防膽固醇及心血管疾病是未來(lái)的有效途徑[6]。

人體腸道環(huán)境中含有豐富多樣的人源益生菌群，相較外源乳酸菌，人源乳酸菌能夠更好的適應(yīng)人體胃腸道環(huán)境，且有研究表明人源乳酸菌能夠更好的定植于腸道環(huán)境，并與其他菌群發(fā)揮協(xié)同作用使菌株的益生效果更加顯著[7]。同時(shí)，人源乳酸菌為人體固有益生菌，能夠有效避免因外源乳酸菌攝入而導(dǎo)致的腸道菌群失衡，是一種潛在的更為安全有效的治療和預(yù)防高膽固醇疾病的益生菌[8-9]。因此，本研究旨在從28株人源乳酸菌中篩選具有降膽固醇能力、特性良好的人源乳酸菌，為開發(fā)治療和預(yù)防高膽固醇疾病的產(chǎn)品提供技術(shù)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株樣本，保存于北京三元食品股份有限公司母嬰研究中心；鄰苯二甲醛、膽固醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛膽鹽，北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PBS磷酸緩沖液、?；敲撗跄懰徕c，北京索萊寶科技有限公司；冰醋酸、鹽酸和硫酸等均為分析純，羅恩試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)高壓滅菌鍋，湖北永大換熱設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；超凈工作臺(tái)，藝斯高貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

從-80℃冰箱中取出甘油保存的菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，一代菌液按1∶1的比例保存至滅菌后的30%甘油-80℃進(jìn)行保存，試驗(yàn)所用菌株菌活化三代后使用。

1.3.2 降解膽固醇菌株的初篩

采用鄰苯二甲醛法測(cè)定培養(yǎng)基中的膽固醇含量。取膽固醇含量為0.2 g/L培養(yǎng)基0.2 mL，鄰苯二甲醛工作液0.2 mL，冰醋酸2.6 mL，濃硫酸2.0 mL，混勻均勻后，室溫下靜置15 min，于550 nm處測(cè)定吸光度[10]。實(shí)驗(yàn)測(cè)定鄰苯二甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=17.32x-0.0043 R2=0.9983。

式中：N1-膽固醇總含量；N0-上清液中膽固醇含量。

1.3.3 膽固醇同化量、沉淀量試驗(yàn)

（1）沉淀量試驗(yàn)。

將乳酸菌發(fā)酵液于4℃下12 000 g離心10 min，得到沉淀，將沉淀用pH值7的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，同一條件離心，得到的上清液即為沉淀洗液，計(jì)算公式如下：

式中：B為沉淀率；C總為總膽固醇含量；C沉為PBS洗脫液中膽固醇含量。

（2）同化量試驗(yàn)。

膽固醇在發(fā)酵過(guò)程中減少，并且沒(méi)有在沉淀中出現(xiàn)的部分為膽固醇同化量，結(jié)果計(jì)算如下：

式中：A為同化率；C總為總膽固醇含量；C上為上清液中膽固醇含量；C沉為PBS洗脫液中膽固醇含量。

1.3.4 膽鹽水解酶定性試驗(yàn)

將乳酸菌在含有5 mg/L?；敲撗跄懰徕c鹽和0.37 g/L氯化鈣的MRS固體培養(yǎng)基中厭氧條件下37℃培養(yǎng)72 h。以菌落產(chǎn)生的不透明暈圈或不透明顆粒狀白色菌落特征表示膽鹽水解酶活性[11]。

1.3.5 特性試驗(yàn)

耐酸試驗(yàn)：無(wú)菌條件下將活化并富集3次后的乳酸菌菌株稀釋至108CFU/mL，離心后去除上清液，用PBS緩沖液洗滌3次后分別置于pH 1.5、pH 2.0、pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別在0、1、3 h取樣并用PBS緩沖液梯度稀釋后取100μL涂布于MRS平板，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)[12]。

耐膽鹽試驗(yàn)：步驟同耐酸試驗(yàn)，洗滌后置于含有0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中。

2 結(jié)果與分析

2.1 28株人源乳酸菌膽固醇總降解能力的初步篩選

本試驗(yàn)對(duì)菌庫(kù)中現(xiàn)有的28株人源乳酸菌進(jìn)行活化后通過(guò)鄰苯二甲醛法對(duì)其進(jìn)行膽固醇降解率進(jìn)行初步測(cè)定，其中母乳來(lái)源的菌株23株，嬰兒糞便來(lái)源的菌株5株。

膽固醇降解結(jié)果如圖1所示，共有13株乳酸菌降解率達(dá)到了20%以上，其中格氏乳桿菌F020、F024降解率最高，且均為嬰兒糞便來(lái)源，降解率高達(dá)31.62%、31.11%。同時(shí)，來(lái)自母乳的B1-26至B1-30菌株的膽固醇降解率也較好，均為25%左右，降解率最低的菌株為來(lái)自嬰兒糞便的格氏乳桿菌F002，降解率僅有2.61%，其次是來(lái)自母乳的植物乳桿菌R9（4.13%）；陳怡婷與吳慧昊等人進(jìn)行的乳酸菌降解膽固醇實(shí)驗(yàn)中，菌株最高降解率也在30%~35%之間[13-14]，因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)得乳酸菌具有較高的降解能力。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果最終選擇了降解率高的前6株乳酸菌作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

圖1 28株人源乳酸菌膽固醇降解率

2.2 6株膽固醇降解能力較強(qiáng)的人源乳酸菌的膽固醇同化量、沉淀量的測(cè)定

乳酸菌在含有游離膽鹽的培養(yǎng)基中可以發(fā)生共沉淀作用，膽鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase，BSH）可以特異性結(jié)合含有酰胺鍵的膽汁酸，釋放出游離的膽汁酸與?；撬帷⒏拾彼釁⑴c膽固醇的代謝從而降解膽固醇；此外，乳酸菌可以通過(guò)同化作用降解膽固醇，還可以通過(guò)細(xì)胞壁對(duì)膽固醇進(jìn)行吸附以及細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)膽固醇進(jìn)行吸收[15]。

如圖2所示，沉淀作用最強(qiáng)的為格氏乳桿菌F020，沉淀率10.49%；同化作用最強(qiáng)的為格氏乳桿菌F024，同化率25.93%，但格氏乳桿菌F024沉淀率最低為5.19%，格氏乳桿菌B1-29的同化率最低，比格氏乳桿菌F024少10.01%；由此可以看出總降解率較高的格氏乳桿菌F020、F024其沉淀作用與同化作用也相對(duì)較高，具有良好的膽固醇降解能力。

圖2 6株人源乳酸菌膽固醇沉淀量與同化量

2.3 6株膽固醇降解能力較強(qiáng)的人源乳酸菌的膽鹽水解酶定性分析

6株乳酸菌在添加?；敲撗跄懰徕c的培養(yǎng)基中均產(chǎn)生不透明的白色菌落沉淀圈，如圖3所示，因此6株乳酸菌均具有膽鹽水解酶活性，這是由于在試驗(yàn)中，被生物酸化的培養(yǎng)基出現(xiàn)解共軛作用形成的游離膽汁酸質(zhì)子化引起的[16]。其中格氏乳桿菌B1-26的沉淀圈最小直徑為8.07 mm，羅伊氏乳桿菌B1-28產(chǎn)生的沉淀圈最大為11.27 mm，其他4株乳酸菌沉淀圈在9.87~10.31mm之間，因此羅伊氏乳桿菌B1-28的BSH活性最高。研究發(fā)現(xiàn)清除膽固醇的主要機(jī)制與細(xì)胞的BSH活性有關(guān)[17]，通過(guò)解共軛膽鹽釋放未共軛的膽汁酸，誘導(dǎo)膽固醇的沉淀。

圖3 6株人源乳酸菌膽鹽水解酶定性

綜合6株人源乳酸菌體外降解膽固醇的試驗(yàn)結(jié)果，分別選取總降解率最高的格氏乳桿菌F020，同化量最高的格氏乳桿菌F024，膽鹽水解酶活性最強(qiáng)的羅伊氏乳桿菌B1-28進(jìn)行耐酸耐膽鹽特性試驗(yàn)。

2.4 3株膽固醇降解能力較強(qiáng)的人源乳酸菌的耐酸試驗(yàn)

人體在進(jìn)食后會(huì)分泌大量胃酸使胃內(nèi)pH值下降至2-3左右，從而更有利于消化酶消化食物，而乳酸菌只有在低pH的條件下存活才能進(jìn)入人體腸道發(fā)揮作用[18]。因此對(duì)上述3株人源乳酸菌進(jìn)行酸性環(huán)境的耐受性試驗(yàn)，分別選取了pH 1.5、2.0、3.0三個(gè)梯度，研究乳酸菌在1 h與3 h的活菌數(shù)及存活率。

如圖4所示，在pH為1.5的條件下格氏乳桿菌F020、F024的活菌數(shù)菌均小于104CFU/mL存活率小于0.1%，因此格氏乳桿菌對(duì)該濃度的酸性條件不耐受；而格氏乳桿菌F020在pH為2.0與3.0件下的活菌數(shù)一直在增加，并且都大于100%，而格氏乳桿菌F024在該條件下存活率較低，pH 2.0條件下3 h后菌株的存活率降到了1.03%，pH 3.0時(shí)存活率僅有34.38%，總體存活率較低；羅伊氏乳桿菌B1-28在3個(gè)濃度的酸性條件下1 h存活率都不足10%，3 h均低于25%。綜合上述結(jié)果，F(xiàn)020的對(duì)酸性條件的耐受性最好。

圖4 3株人源乳酸菌在不同酸性條件下的耐受性

2.5 3株膽固醇降解能力較強(qiáng)的人源乳酸菌的耐膽鹽試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)胃消化吸收后的乳酸菌進(jìn)入小腸，小腸中膽鹽會(huì)影響乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，因此，對(duì)膽鹽耐受性良好的乳酸菌是在腸道中存活、定植，發(fā)揮益生作用的前提[19]。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加0.3%膽鹽，研究乳酸菌在1 h與3 h的活菌數(shù)及存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 3株人源乳酸菌在0.3%膽鹽條件下的耐受性

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h羅伊氏乳桿菌B1-28對(duì)膽鹽的耐受性最好，達(dá)到了82.98%，但在3 h時(shí)格氏乳桿菌F020的耐受性最好，達(dá)到了102.94%，而B1-28的存活率則降低到了74.47%，格氏乳桿菌F024在0.3%膽鹽濃度下的活菌數(shù)降低到了104CFU/mL，存活率不足0.1%，對(duì)膽鹽的耐受性最差；由此可以看出在0.3%的膽鹽濃度下，格氏乳桿菌F020的耐受性最好，可在0.3%膽鹽濃度下生長(zhǎng)繁殖。

3 結(jié)果與討論

本研究以人源乳酸菌為研究對(duì)象，篩選出具有膽固醇降解能力并且特性良好的人源乳酸菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本菌庫(kù)中人源乳酸菌降解率最高達(dá)到了31.62%，而陳怡婷的研究得到從發(fā)酵食品中得到的乳酸菌膽固醇降解率為35.33%[13]，表明本研究中的人源乳酸菌具有良好的膽固醇降解能力并且相對(duì)于外源乳酸菌，有良好的人體環(huán)境的適應(yīng)能力，更有利于定植在腸道中發(fā)揮作用。膽固醇降解能力高的乳酸菌同時(shí)具有較高的能力的沉淀作用，乳酸菌對(duì)膽固醇的降解與細(xì)胞的膽鹽水解酶活性有重要關(guān)系，通過(guò)解共軛膽鹽釋放未共軛的膽汁酸，誘導(dǎo)膽固醇的沉淀[20]；本實(shí)驗(yàn)6株乳酸菌雖都具有膽鹽水解酶活性，但對(duì)于膽固醇的降解能力并不相同，這是由于膽鹽水解酶受不同基因的調(diào)控，所以不同種屬間具有較大差異，即使相同種屬下，乳酸菌的膽固醇降解能力也不相同[21]。乳酸菌可以耐受腸道環(huán)境在腸道中定植是發(fā)揮乳酸菌功能性的先決條件。格氏乳桿菌F020的耐受性最好，可以在低pH和高膽鹽條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。陳大衛(wèi)等人也研究發(fā)現(xiàn)具有膽固醇降解能力的人源乳酸菌同時(shí)具有較好的耐酸耐膽鹽能力[22]。由于消費(fèi)者對(duì)健康生活方式的渴望以及對(duì)來(lái)自天然來(lái)源的具有增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)和治療價(jià)值的食品的需求增加，食品行業(yè)對(duì)所謂的功能性食品表現(xiàn)出越來(lái)越大的興趣。Sahoo等人將從本地乳制品中篩選出的高膽固醇降解能力乳酸菌加入調(diào)制乳中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠的血清膽固醇具有明顯的改善[23]。綜上，本研究篩選出格氏乳桿菌F020膽固醇降解能力良好，對(duì)酸性及膽鹽環(huán)境耐受性強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。