李勛章,吳 婷,李萬敏,邸 學(xué),王海波

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院分析實(shí)驗(yàn)室,大連 116000;*通訊作者,E-mail:whb-email@126.com)

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵葉遠(yuǎn)志(Polygala.sibiricalL.)的干燥根[1],具有安神益智、祛痰、消腫的作用,廣布全國各地,以西南和華南地區(qū)最盛[2]。遠(yuǎn)志鑒別方法主要有薄層色譜法[3-5]、高效液相色譜法[6-12]。其中,薄層色譜法具有快速有效、價(jià)格低廉、高通量等特點(diǎn),通過人眼觀察比較不同條帶斑點(diǎn)進(jìn)行定性分析。劉艷麗等[4]和范梅娟等[13]采用薄層色譜對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行鑒別,但條帶斑點(diǎn)多、顏色復(fù)雜,僅少量有對(duì)應(yīng)特征斑點(diǎn)能選取作為特征斑點(diǎn)來簡(jiǎn)單比較樣品之間關(guān)系。

近年來,隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展,自動(dòng)分析技術(shù)在中藥領(lǐng)域中也逐漸被應(yīng)用[14,15]。以遠(yuǎn)志對(duì)照藥材、不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志飲片及同科植物的薄層色譜圖為對(duì)象,進(jìn)行智能分析方法研究。此方法能避免人眼對(duì)相近顏色的識(shí)別誤差,更好地處理樣品條帶顏色信息,提高色彩識(shí)別靈敏度。本文采用自動(dòng)分析方法,利用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù),將薄層色譜圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)進(jìn)行分析處理,更加全面客觀地呈現(xiàn)樣本間薄層色譜斑點(diǎn)結(jié)果情況,為遠(yuǎn)志的真?zhèn)舞b別準(zhǔn)確性和質(zhì)量等級(jí)自動(dòng)化控制評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2F-2C型暗箱式自動(dòng)紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠);B-260恒溫水浴鍋,移液槍(上海蘇陽儀器有限公司);KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Linomat5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪公司);ACCULABALC-110.4萬分之一天平(德國sartorius,型號(hào):ALC-110.4)。

1.2 試藥

硅膠G(中國青島海洋化工);甲醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);純凈水(遼東半島飲用純凈水有限公司);三氯甲烷、乙酸乙酯(分析純,天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司);遠(yuǎn)志對(duì)照藥材(批號(hào):120989-201107,中國食品藥品檢定研究院);17批遠(yuǎn)志樣品(S1～S17)及小金牛草(S18)來源信息見表1。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)邸學(xué)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定,17批遠(yuǎn)志樣品均為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥根,小金牛草為遠(yuǎn)志科植物小花遠(yuǎn)志(PolygalatelephioidesWilld.)的全草。

表1 遠(yuǎn)志藥材產(chǎn)地信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 樣品溶液的制備 取不同遠(yuǎn)志樣品粉碎,精密稱定粉末0.5 g,置具塞錐形瓶中,加70%甲醇15 ml,超聲處理30 min,濾過,濾液水浴蒸干,殘?jiān)蛹状? ml溶解,作為供試品溶液。

2.1.2 薄層層析條件 用硅膠G鋪板,105 ℃活化30 min,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10,4 ℃靜置30 min的下層溶液)為展開劑。

2.1.3 薄層色譜測(cè)定方法 照《中國藥典》項(xiàng)下薄層色譜鑒別方法(通則0502)試驗(yàn)[16],分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2 μl,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,展開、取出、晾干、在紫外燈光(366 nm)下檢視,結(jié)果見圖1。薄層板檢視拍照,圖像保存為JPG格式。

1-4，6-9，11-14，16-20.S1～S17；5，15.對(duì)照藥材；10.S18圖1 18批遠(yuǎn)志藥材薄層色譜圖Figure 1 TLC of 18 batches of Radix Polygala

2.2 薄層色譜目視觀察

遠(yuǎn)志樣品在比移值(Rf)0.8處,可見清晰強(qiáng)藍(lán)色熒光斑點(diǎn);在Rf 0.3～0.5處可見淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn),各遠(yuǎn)志樣品顏色強(qiáng)度相似。偽品S18樣品在Rf 0.8處有淺藍(lán)色熒光斑點(diǎn),在Rf 0.4～0.6處有密集紅色熒光斑點(diǎn),在Rf 1.0處有強(qiáng)紅色熒光斑點(diǎn),與遠(yuǎn)志對(duì)照品不一致。

2.3 薄層色譜自動(dòng)分析

對(duì)薄層展開條帶進(jìn)行自動(dòng)取色分析,采用相似度和聚類分析判斷遠(yuǎn)志樣品之間的相關(guān)性和分類情況。

2.3.1 色值處理 按條帶位置及展開高度對(duì)圖像取色區(qū)域進(jìn)行劃分,通過取色軟件對(duì)彩色圖像進(jìn)行16進(jìn)制代碼的顏色輸出,改變色彩模式表達(dá),計(jì)算每個(gè)像素點(diǎn)的總色值。

2.3.2 薄層條帶色值自動(dòng)分析 打開軟件,設(shè)置自動(dòng)選點(diǎn)、取色、復(fù)制顏色代碼的操作腳本,對(duì)拍照?qǐng)D片進(jìn)行自動(dòng)取色及顏色信息匯總,進(jìn)行相似度和聚類分析。

2.4 自動(dòng)分析方法學(xué)考察

2.4.1 取樣量考察 取相同批次遠(yuǎn)志樣品0.2,0.5,0.8,1.0 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,點(diǎn)樣展開。展開后,按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行自動(dòng)分析。確定遠(yuǎn)志樣品取樣量為0.5 g,條帶清晰,斑點(diǎn)圓整,結(jié)果見圖2A。

2.4.2 點(diǎn)樣量考察 取相同批次遠(yuǎn)志樣品0.5 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣展開,點(diǎn)樣量分別為1,2,3 μl,進(jìn)行展開。按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行自動(dòng)分析。確定點(diǎn)樣量為2 μl時(shí),色譜斑點(diǎn)清晰,自動(dòng)取色分析結(jié)果好,結(jié)果見圖2B。

1-4.分別為樣品量0.2,0.5,0.8,1.0 g A.取樣量考察結(jié)果 1-3.分別為點(diǎn)樣量1,2,3 μl B.點(diǎn)樣量考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取相同批次遠(yuǎn)志樣品0.5 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣展開,共點(diǎn)8個(gè)條帶,點(diǎn)樣量為2 μl,按2.3項(xiàng)下方法對(duì)8個(gè)條帶分別進(jìn)行自動(dòng)分析。結(jié)果表明,8個(gè)條帶相似度RSD(n=6)分別為0.27%,0.91%,0.37%,0.71%,0.84%,0.80%,0.36%,1.42%,表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取5批遠(yuǎn)志樣品0.5 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣展開,點(diǎn)樣量為2 μl,按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行取色分析,共分析6次。結(jié)果表明,6次分析后的條帶相似度RSD(n=6)分別為0.59%,1.42%,0.69%,0.84%,0.87%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 取色高度考察 取相同遠(yuǎn)志樣品0.5 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣展開,點(diǎn)樣量為2 μl,共點(diǎn)3個(gè)條帶。按2.3項(xiàng)下操作對(duì)其進(jìn)行取色分析,條帶取色分析高度間距分別為2像素、3像素、4像素重復(fù)進(jìn)行相似度分析。結(jié)果表明,取色高度間距為3像素時(shí),色譜條帶分析結(jié)果好。

2.4.6 取色位置考察 取相同遠(yuǎn)志樣品0.5 g,按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣展開,點(diǎn)樣量為2 μl,共點(diǎn)4個(gè)條帶。取色分析時(shí),分別取條帶中心位置、三等分位、五等分位、五等分中間三位。按2.3項(xiàng)下操作對(duì)其進(jìn)行取色分析,相同高度的取色點(diǎn)色值取平均值,進(jìn)行相似度考察。結(jié)果表明,取色寬度為五等分中間三值的平均值,結(jié)果最好。

2.5 相似度評(píng)價(jià)

將20批遠(yuǎn)志薄層顏色信息導(dǎo)入SPSS 22.0系統(tǒng)中進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,計(jì)算遠(yuǎn)志樣品與對(duì)照藥材顏色數(shù)據(jù)之間的相似度。17批遠(yuǎn)志樣品與對(duì)照藥材相似度為0.851～0.955,偽品S18與標(biāo)準(zhǔn)品相似度為0.445(見表2)。說明該方法可鑒別出遠(yuǎn)志藥材偽品。

表2 18批樣品與對(duì)照藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

按照相似度劃分等級(jí),大于0.93為一等品有5批(S3、S9、S10、S11、S13);大于0.89為二等品有6批(S1、S4、S6、S12、S14、S16);大于0.85為三等品有6批(S2、S5、S7、S8、S15、S17)。17批遠(yuǎn)志樣品雖在肉眼觀察下近似一致,但經(jīng)自動(dòng)分析后,可根據(jù)相似度差異進(jìn)行等級(jí)劃分。

2.6 聚類分析

以18批遠(yuǎn)志薄層顏色數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù),運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析見圖3。根據(jù)Pearson相關(guān)性分析,將對(duì)照藥材1、對(duì)照藥材2、S1、S15、S17樣品聚為一類,S2～S14、S16樣品聚為一類,S18樣品單獨(dú)為一類(見圖3A)。

采用相同聚類條件分析176個(gè)樣品點(diǎn),共聚成7類,分別與條帶Rf值相對(duì)應(yīng)。條帶上1～9斑點(diǎn)(Rf:0.005～0.051)聚為一類,分為第一區(qū)域;條帶上10～32斑點(diǎn)(Rf:0.056～0.182)聚為一類,分為第二區(qū)域;條帶上33～50斑點(diǎn)(Rf:0.188～0.284)聚為一類,分為第三區(qū)域;條帶上51～93斑點(diǎn)(Rf:0.290～0.528)聚為一類,分為第四區(qū)域;條帶上94～145斑點(diǎn)(Rf:0.534～0.824)聚為一類,分為第五區(qū)域;條帶上146～150斑點(diǎn)(Rf:0.830～0.852)聚為一類,分為第六區(qū)域;條帶上151～176斑點(diǎn)(Rf:0.858～1.000)聚為一類,分為第七區(qū)域(見圖3B)。

A.18批遠(yuǎn)志樣品結(jié)果 B.遠(yuǎn)志條帶176個(gè)斑點(diǎn)結(jié)果圖3 遠(yuǎn)志樣品聚類分析結(jié)果圖Figure 3 Cluster analysis results of Radix Polygala samples

2.7 樣品條帶色譜斑點(diǎn)主成分綜合評(píng)分

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)17批樣品的176個(gè)樣品點(diǎn)進(jìn)行主成分分析,得到各取色點(diǎn)的綜合評(píng)分,部分結(jié)果見表3。結(jié)果表明,176個(gè)樣品點(diǎn)綜合評(píng)分高的前24個(gè)點(diǎn)主要分布在第七區(qū)域,其次分布在第三、第五兩個(gè)區(qū)域,剩余四個(gè)區(qū)域的樣品點(diǎn)綜合得分接近于0。由此推測(cè),Rf:0.188～0.284、Rf:0.534～0.824、Rf:0.830～0.852這三個(gè)區(qū)域可能對(duì)樣品聚類分析有明顯的影響。

3 討論

使用自動(dòng)分析與目視比較法同時(shí)對(duì)圖1進(jìn)行分析。結(jié)果表明,通過目視比較法得出S18樣品為偽品小金牛草,S6樣品斑點(diǎn)較少,S2、S7、S12、S16、S17樣品的斑點(diǎn)比較多,各遠(yuǎn)志樣品與對(duì)照藥材在Rf為0.5～0.8之間有不明顯斑點(diǎn)。采用本實(shí)驗(yàn)建立的薄層色譜自動(dòng)分析方法對(duì)18批遠(yuǎn)志樣品進(jìn)行定性鑒別,分析比較18批遠(yuǎn)志樣品與對(duì)照藥材之間的色譜條帶數(shù)值相似度,發(fā)現(xiàn)S18樣品為偽品小金牛草,其余17批遠(yuǎn)志樣品與對(duì)照藥材的相似度均高于0.85,說明17批遠(yuǎn)志樣品均一性較好;并根據(jù)相似度結(jié)果對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行等級(jí)劃分:相似度大于0.93為一等品有5批,大于0.89為二等品有6批,大于0.85為三等品有6批。

表3 176個(gè)樣品點(diǎn)綜合評(píng)分結(jié)果

主成分綜合評(píng)分高的24個(gè)樣品點(diǎn)集中分布在第三、第五、第七3個(gè)區(qū)域。第七區(qū)域的樣品點(diǎn)是遠(yuǎn)志樣品聚類分析結(jié)果的主要影響因素,第三、第五2個(gè)區(qū)域?qū)Ψ治鼋Y(jié)果也存在明顯影響;其中第五區(qū)域Rf:0.534～0.824在目視比較時(shí),僅有不明顯暗斑,各條帶間無明顯差異;但采用自動(dòng)分析法時(shí),第五區(qū)域?qū)l帶間相似性存在明顯影響。

對(duì)自動(dòng)分析相似度值的影響因素除17批遠(yuǎn)志樣品質(zhì)量存在差異外,薄層圖譜條帶是否規(guī)整、拍照角度是否垂直、薄層板是否有邊緣效應(yīng)、斑點(diǎn)條帶熒光亮度等都會(huì)對(duì)相似度評(píng)價(jià)以及聚類分析類別劃分產(chǎn)生明顯影響,且斑點(diǎn)圓整性、背景顏色、展開距離、點(diǎn)樣點(diǎn)大小等也會(huì)對(duì)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)處理結(jié)果產(chǎn)生一定程度上的干擾。

本方法通過對(duì)薄層板顏色識(shí)別,可用于不同品種遠(yuǎn)志的定性鑒別,克服人眼對(duì)相近顏色識(shí)別誤差,準(zhǔn)確性好,且適用廣泛;對(duì)條帶數(shù)目多、斑點(diǎn)復(fù)雜的薄層板鑒別靈敏度高,條帶間相似度判斷準(zhǔn)確,實(shí)現(xiàn)了薄層結(jié)果自動(dòng)、直觀、數(shù)據(jù)化分析,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。同時(shí)可對(duì)市售不同品種不同來源的遠(yuǎn)志進(jìn)行等級(jí)劃分,為遠(yuǎn)志的等級(jí)劃分也提供參考依據(jù),為進(jìn)一步完善遠(yuǎn)志藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供研究依據(jù),有助于遠(yuǎn)志品種質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的提高。