王邦義,李 璐,李更田,鄭慧銘

(1上海潤(rùn)家司法鑒定中心,上海 200072;2上海市公安局靜安分局刑事科學(xué)技術(shù)研究所)

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STR)廣泛存在于人類(lèi)基因組中,核心序列一般由2～6個(gè)堿基構(gòu)成,其核心序列串聯(lián)重復(fù)排列的數(shù)目變化構(gòu)成序列長(zhǎng)度差異,具有高度多態(tài)性。短串聯(lián)重復(fù)序列作為一種遺傳標(biāo)記能在群體中穩(wěn)定遺傳,且遺傳遵循孟德?tīng)栠z傳定律。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,近年來(lái)多種由STR遺傳標(biāo)記組成系統(tǒng)的商品化試劑盒獲得認(rèn)可,STR自動(dòng)分型技術(shù)得以普及。因其具有高度多態(tài)性、穩(wěn)定的遺傳性和可重復(fù)性、自動(dòng)化程度高、鑒別能力強(qiáng)等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域[1,2]。

TPOX(thyroid peroxidase)基因座發(fā)現(xiàn)于人類(lèi)甲狀腺過(guò)氧化物酶基因的第10個(gè)內(nèi)含子,位于人類(lèi)2號(hào)染色體短臂近末端,核心重復(fù)單位AATG,是一個(gè)多態(tài)性適中、突變率低能穩(wěn)定遺傳的基因座[3](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M68651.1/)。

關(guān)于在TPOX基因座檢測(cè)時(shí),同一個(gè)個(gè)體可以檢出3個(gè)基因的現(xiàn)象于1999年由Crouse等[4]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,STRbase數(shù)據(jù)庫(kù)也列出TPOX發(fā)生三等位基因的頻率較高。本研究基于2例TPOX位點(diǎn)存在三等位基因的案例,特針對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行分析討論,并提供類(lèi)似問(wèn)題的參考解決方案。

1 案例

1.1 來(lái)源

案例來(lái)源于我中心申請(qǐng)親子鑒定的被鑒定人的末梢血,其中案例1為父、母、子三人的三聯(lián)體鑒定,案例2為父、子二人的二聯(lián)體鑒定,所報(bào)道結(jié)果均已征得委托人同意。

1.2 檢測(cè)方法

上述5份樣本采用Chelex-100快速提取法各自分別進(jìn)行基因組DNA抽提;以提取的DNA為模板,用試劑盒GoldeneyeTM20A DNA身份鑒定系統(tǒng)[基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)(北京)有限公司]分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增(設(shè)立對(duì)照組,陰性對(duì)照組模板為去離子水,陽(yáng)性對(duì)照組模板為9947A);再用試劑盒PowerPlex?21 system(美國(guó)Promega公司)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增(設(shè)立對(duì)照組,陰性對(duì)照組模板為去離子水,陽(yáng)性對(duì)照組模板為2800M);擴(kuò)增產(chǎn)物用3130XL型遺傳分析儀(Applied Biosystems,ABI)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)收集,用GeneMapper ID-X 1.4軟件分析數(shù)據(jù)并生成分型圖譜。

1.3 檢測(cè)結(jié)果

使用GoldeneyeTM20A試劑盒檢測(cè)結(jié)果中,陰性對(duì)照結(jié)果無(wú)分型,陽(yáng)性對(duì)照9947A分型準(zhǔn)確,所有檢測(cè)樣本除TPOX基因座外,其他位點(diǎn)分型均正常,為排除實(shí)驗(yàn)污染或電泳異常信號(hào)等其他外界因素影響,用GoldeneyeTM20A試劑盒重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致,檢測(cè)樣本的分型結(jié)果見(jiàn)表1。為防止試劑盒非特異性擴(kuò)增影響,用PowerPlex?21試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證,陰性對(duì)照結(jié)果無(wú)分型,陽(yáng)性對(duì)照2800M分型準(zhǔn)確,所有樣本分型結(jié)果與GoldeneyeTM20A試劑盒在相同基因座上分型結(jié)果一致。

案例1 TPOX基因座分型:母親的等位基因?yàn)?/11/12,孩子的等位基因?yàn)?/11/12,父親的等位基因?yàn)?/9(見(jiàn)圖1)。案例2 TPOX基因座分型:父親的等位基因?yàn)?/11/12,孩子的等位基因?yàn)?/11/12(見(jiàn)圖2)。

由上述結(jié)果仍可看出TPOX基因座上等位基因雖然數(shù)量異常,但是子代的等位基因依然可從親代基因型中找到來(lái)源。

表1 兩案例GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測(cè)分型結(jié)果

圖1 案例1 GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測(cè)TPOX基因座分型圖

圖2 案例2 GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測(cè)TPOX基因座分型圖

2 討論

在用軟件分析STR分型時(shí)發(fā)現(xiàn)此2個(gè)案例均出現(xiàn)了TPOX三等位基因現(xiàn)象,峰高比值接近1 ∶1 ∶1。根據(jù)上述檢驗(yàn)結(jié)果分析,以上2例案件TPOX基因座確為3個(gè)等位基因,由于在GoldeneyeTM20A或PowerPlex?21檢測(cè)系統(tǒng)中,基因座D2S1338也是位于2號(hào)染色體上,但其分型未出現(xiàn)超過(guò)2個(gè)以上等位基因或者峰高比異常的2個(gè)等位基因,以上分析表明并非染色體數(shù)量異常導(dǎo)致結(jié)果,所以該種情況應(yīng)注意與三體綜合征出現(xiàn)三等位基因的現(xiàn)象加以區(qū)別[5]。

目前也有較多文章報(bào)道過(guò)類(lèi)似現(xiàn)象[6-8],以上案例及本案件中出現(xiàn)的3個(gè)等位基因從測(cè)序結(jié)果分析都是真正的TPOX基因[9],只是由于染色體序列結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致其中一條2號(hào)染色體有兩個(gè)包含了TPOX基因座的區(qū)域。目前這種特殊序列結(jié)構(gòu)已被報(bào)道的整合方式是2號(hào)染色體序列在1201551～1201552 bp之間插入了三部分序列段,分別為chr2:1201552～1257216 bp序列段、長(zhǎng)度52 bp的連接序列段和反向排序的chr2:1377990～1516026 bp序列段[10],其中反向排序的chr2:1377990～1516026 bp序列段包含了TPO基因外顯子1～14段的全部區(qū)域[11],而TPOX基因座便位于其中,故該染色體呈現(xiàn)了2個(gè)真實(shí)的TPOX基因。當(dāng)然研究中也有案例并未按照此整合方式排序,但是推測(cè)原理相近,都是包含了2個(gè)TPOX基因座所在區(qū)域。

這種序列結(jié)構(gòu)異常現(xiàn)象產(chǎn)生機(jī)制尚無(wú)明確報(bào)道,周單華等[12]文中提及國(guó)內(nèi)外較為認(rèn)同的幾種出現(xiàn)3個(gè)等位基因可能的觀(guān)點(diǎn)中,同源染色體在減數(shù)分裂過(guò)程中基因重組時(shí)不等價(jià)交換所致更符合本次的2個(gè)案例現(xiàn)象。

由上述2個(gè)案例可以看出這種序列結(jié)構(gòu)異常的2號(hào)染色體依然可以“綁定”遺傳給子代,如此分析依然符合孟德?tīng)栠z傳定律。根據(jù)GB/T 37223-2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》的要求:

(1)案例1的TPOX基因座親權(quán)指數(shù)計(jì)算:母親8/11/12,孩子9/11/12,父親8/9,PI=X/Y;X=母親同時(shí)提供等位基因11&12的概率×父親提供等位基因9的概率=0.5×0.5,Y=母親同時(shí)提供等位基因11&12的概率×隨機(jī)男子提供等位基因9的概率=0.5×P9,三聯(lián)體PI=1/2P9;

(2)案例2的TPOX基因座親權(quán)指數(shù)計(jì)算:父親為8/11/12,孩子為9/11/12,此項(xiàng)親權(quán)指數(shù)分析僅考慮在母親TPOX基因座為正常分型的情況,PI=X/Y;X=母親提供等位基因9的概率×父親同時(shí)提供等位基因11&12的概率=P9×0.5,Y=母親提供等位基因9的概率×隨機(jī)男子同時(shí)提供等位基因11&12的概率=P9×P11&12,二聯(lián)體PI=1/2P11&12。

不難看出,不論二聯(lián)體或三聯(lián)體,這種異常的雙等位基因來(lái)源于母親,親(父)權(quán)指數(shù)并不會(huì)受影響。如果來(lái)源于父親則親(父)權(quán)指數(shù)計(jì)算都會(huì)涉及人群中隨機(jī)男子同時(shí)提供已存在的雙等位基因的概率問(wèn)題,目前尚無(wú)官方數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)該種綁定現(xiàn)象出現(xiàn)的概率。常用的處理方法有3種:①將這種異常結(jié)構(gòu)的基因座看作整體,以出現(xiàn)稀有等位基因的方式處理,即出現(xiàn)的基因頻率為以該基因座最小基因頻率計(jì)算[13];②出現(xiàn)的基因頻率以案件中出現(xiàn)的雙等位基因頻率的乘積計(jì)算[14];③據(jù)Yang等[11]在報(bào)道中提到TPOX基因座三等位基因在中國(guó)漢族人群中出現(xiàn)的頻率約為0.018 9%,可以參考此數(shù)值作為該現(xiàn)象的基因頻率。

本文中列舉的TPOX在一條染色體上有2個(gè)區(qū)域的現(xiàn)象也可能還有別的表現(xiàn)形式,如TPOX基因座上有2個(gè)等位基因峰,峰高比例接近2:1,甚至僅1個(gè)等位基因峰存在也有可能具備該現(xiàn)象(這種情況容易被當(dāng)做正常結(jié)果忽略),且在其他基因座上也會(huì)有類(lèi)似情況出現(xiàn)[15],在實(shí)際案例中注意根據(jù)具體情況分析辨別。本文意在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范短缺的情況下,對(duì)出現(xiàn)這種特殊三帶型基因座分析及PI值計(jì)算提供借鑒和參考。