郭 睿,趙世平,張 娜,楊 軍

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

胸腹水是惡性腫瘤進展、復發(fā)的常見體征之一,也是判定腫瘤分期和是否進展的重要參數(shù)。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常規(guī)細胞病理學檢查實際的陽性檢出率并不高,細胞蠟塊技術又耗時耗力。從而導致腫瘤患者難以得到及時診斷和治療。因此,探索新的床旁診斷技術(point-of-care-testing,POCT)實現(xiàn)對胸腹水的快速檢測具有重要的臨床意義[1,2]。

腫瘤細胞異?；钴S的有氧糖酵解(也稱Warburg效應)、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)和高代謝狀態(tài)及由此造成的活性氧(reactive oxygen species, ROS)和細胞游離亞鐵原卟啉(cell free ferrous protoporphyrin, FH)的異常聚集不僅是惡性腫瘤細胞典型的代謝特征,也直接參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3-9]。因而,聯(lián)合檢測腫瘤細胞或組織中的ROS和FH的含量,即可實現(xiàn)對惡性腫瘤細胞的早期診斷。目前,ROS+FH聯(lián)合檢測已被用于多種惡性腫瘤的早期篩查和診斷[10-12]。但是,并未見將ROS和FH聯(lián)合檢測用于胸腹水樣本診斷的報道。本研究擬通過對胸腹水樣本中ROS和FH進行檢測,評估床旁檢測ROS+FH在鑒別良惡性胸腹水樣本中的臨床價值和意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科2021年1月2021年10月胸腹水樣本196例,其中,臨床診斷惡性腫瘤患者(包括初次確診和治療后復發(fā)患者)樣本108例(其中肺癌患者71例,其他惡性腫瘤患者37例),非惡性腫瘤患者樣本88例(其中炎癥患者62例,其他原因患者26例)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

上皮細胞ROS+FH染色試劑盒由深圳海柔思生物醫(yī)學科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 細胞蠟塊制備 所有胸腹水樣本在制作傳統(tǒng)細胞涂片(conventional cytological smear, CS)的同時,均制備成細胞蠟塊(cell block,CB),并經石蠟切片、HE染色后,由有資質的病理醫(yī)師閱片進行細胞病理學診斷,判定胸腹水的良惡性。必要時,依據HE鏡下形態(tài)選擇合適抗體進行免疫組化染色進行輔助診斷。

1.3.2 細胞學診斷 所有胸腹水樣本的診斷標本均經常規(guī)細胞涂片、HE染色和細胞蠟塊、石蠟切片HE染色后,由具有資質的病理醫(yī)師進行初步診斷。并根據不同樣本石蠟蠟塊的HE切片中細胞的鏡下形態(tài),選擇適宜的抗體進行免疫組化染色。再由具有資質的病理醫(yī)師進行復診,確定最終病理診斷。發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞者歸為惡性組,未見惡性腫瘤細胞者歸為良性組。

1.3.3 ROS+FH染色 取離心富集的胸腹水細胞混懸液1 ml置于細胞保存液中,嚴格按照ROS+FH染色試劑盒的操作步驟說明進行。3 min內,ROS試劑管反應后呈紅色、紅紫色或紫色判讀為陽性(+),FH試劑管反應后呈藍色、墨綠色、綠色判讀為陽性(+),ROS和FH均為陽性者判讀為陽性(+)。均陽性顯示該樣本瓦博格效應陽性,預示該樣本存在惡性風險;均陰性顯示該樣本瓦博格效應陰性,預示尚無惡性風險。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用列聯(lián)表、Fisher精確概率法及SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞病理學診斷結果

經細胞蠟塊和常規(guī)細胞涂片細胞病理學檢查發(fā)現(xiàn),在196例胸腹水樣本中,檢出惡性腫瘤細胞者67例(記為惡性),未檢出惡性腫瘤細胞者129例(記為良性)。

2.2 ROS和FH聯(lián)合染色結果

ROS和FH聯(lián)合染色發(fā)現(xiàn)在196例胸腹水樣本中,ROS陽性者82例,FH陽性者171例,ROS+FH雙陽性者82例(見表1)。其中,以ROS、FH和ROS+FH鑒別診斷胸腹水良惡性的陰性預測值卻分別高達71.05%,72.00%,69.57%(見表2)。

表1 ROS和FH聯(lián)合檢測鑒別良惡性胸腹水結果 (例)

表2 采用床旁檢測ROS和FH鑒別良惡性胸腹水的臨床價值 (%)

3 討論

胸腹水是進展期惡性腫瘤最常見體征之一,也是判斷臨床分期和病情進展的重要參數(shù)。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常規(guī)細胞病理學檢查流程繁瑣、耗時耗力,實際的陽性檢出率并不高,常因腫瘤細胞數(shù)量有限而漏診或無法診斷,而且,還必須由具有資質的病理醫(yī)生才能診斷;雖然細胞蠟塊技術能顯著提高胸腹水樣本確診率,但制作流程更復雜、耗時更長,而且,也同樣必須要由具有資質的病理醫(yī)生才能診斷[13,14];細胞DNA定量技術則須依賴特殊試劑、專用設備和分析軟件[15]。因此,探索能實現(xiàn)對胸腹水樣本快速檢測和定性診斷的床旁診斷(point-of-care-testing,POCT)新方法具有重要的臨床意義。

活性氧是一組含有氧自由基的高活性化學物質的統(tǒng)稱,是細胞生物氧化還原過程中自然產生的正常產物。研究發(fā)現(xiàn),癌基因突變、抑癌基因失活、轉錄因子活化、線粒體損傷、非特異性的慢性炎癥、腫瘤細胞的高代謝狀態(tài)及放化療和生物免疫治療等等因素均可直接或間接引起腫瘤細胞內ROS的聚集,并由此導致腫瘤細胞氧化還原態(tài)的失衡,而處于一個強氧化應激、低抗氧化的狀態(tài)。而且,ROS常以濃度依賴性方式引起不同程度的DNA、蛋白質、脂質過氧化和損傷,從而發(fā)揮雙重生物學效應[16]:急性高濃度ROS可直接導致細胞凋亡和壞死;中濃度ROS可引起細胞周期暫時性或永久性阻滯,誘導細胞分化;慢性低濃度ROS則可造成非致死性蛋白質、線粒體和細胞膜損傷功能異常,誘導核DNA(nDNA)交聯(lián)及堿基突變或單/雙鏈斷裂和線粒體DNA(mt-DNA)突變、基因組不穩(wěn)定性,促進細胞分裂、增殖及上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT),而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移[17,18]。

異?；钴S的有氧糖酵解和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)是惡性腫瘤細胞葡萄糖代謝的主要方式,也是與腫瘤細胞內高ROS引起的氧化還原失衡相伴隨的另一種典型的代謝特征[19-21]。有氧糖酵解產生的葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)可作為PPP途徑底物,在葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PD)的作用下生成5-磷酸核糖和NADPH[22,23]。而NADPH則可直接參與細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持,將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH),而谷胱甘肽過氧化物酶則以GSH為供氫體,分解H2O2減低ROS濃度,并生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)[24]。而這一過程造成的腫瘤細胞的低氧環(huán)境可引起低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)的磷酸化,并通過活性氧族(ROS)激活下游激酶系統(tǒng),產生一種親脂性分子(hydrophilic fatty molecules,HF),HF進入血紅素結合蛋白(HP蛋白)的疏水核內,改變蛋白質α鏈CD3His和β鏈CD3Ser、E10Lys的極性,使位于疏水核中的亞鐵原卟啉脫落,成為細胞游離亞鐵原卟啉[25]。

由此可見,ROS和FH含量增高不僅是腫瘤發(fā)生的極早期代謝事件,也是惡性腫瘤典型的代謝特征,且FH含量與惡性腫瘤細胞的異常糖代謝間存在因果性關系。同時,ROS和FH含量只與腫瘤細胞的高代謝狀態(tài)相關,而與腫瘤的組織學類型無關。因而,ROS和FH可作為惡性腫瘤特異的廣譜代謝性分子標志物,檢測細胞內ROS+FH的含量,即可判斷細胞代謝功能狀態(tài),從而實現(xiàn)對惡性腫瘤的篩查、極早期診斷、隨訪及病情監(jiān)測[26,27]。

由于ROS和FH具有較高的反應活性,可與相應的化學試劑反應生成有色物質而進行定性或定量檢測。其中,比色法具有成本低、操作簡便、無需復雜儀器設備,數(shù)分鐘內采用肉眼觀察反應液顏色即可判定結果,且對判讀人員無資質要求,具有典型的床旁檢測(POCT)技術特征。尤其適用于惡性腫瘤的床旁檢測和篩查。目前,ROS+FH聯(lián)合檢測已被用于子宮頸癌、子宮內膜癌、直腸癌、鼻咽癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的普查、極早期診斷、隨訪及病程監(jiān)測,并顯示出明顯的臨床價值。

該研究通過在196例胸腹水樣本評估ROS和FH聯(lián)合檢測在胸腹水定性診斷中的價值。結果發(fā)現(xiàn),以ROS為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標的敏感性、特異性、陽性預測值和準確率分別50.75%,62.79%,41.46%和58.67%;以FH為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標的敏感性、特異性、陽性預測值和準確率分別89.55%,13.95%,35.09%和39.80%;以ROS+FH聯(lián)合檢測為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標的敏感性、特異性、陽性預測值和準確率分別為89.55%,12.40%,34.68%和38.78%(見表2)。由此可見,分別以ROS、FH和ROS+FH聯(lián)合為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標的敏感性、特異性、準確率并不盡如人意。顯然,這與ROS和FH的產生不僅與癌細胞特異性代謝有關,也與感染、炎癥等因素密切相關。因而,ROS+FH聯(lián)合染色并不能用于胸腹水樣本良惡性的有效診斷。

盡管如此,該研究結果還顯示,ROS、FH和ROS+FH作為診斷指標的陰性預測值卻分別高達71.05%,72.00%,69.57%。這說明,ROS和FH聯(lián)合染色雖不能用于胸腹水樣本良惡性的有效診斷,但仍可憑借其較高的陰性預測值而用于排除胸腹水的惡性風險。

而且,相較于傳統(tǒng)細胞病理學檢查、細胞蠟塊和細胞DNA定量等技術,ROS和FH聯(lián)合檢測依賴其顯著的床旁檢測特征,可有效用于胸腹水樣本的排陰性篩查,從而快速實現(xiàn)對胸腹水患者的分層管理。ROS+FH陽性樣本具有惡性風險,應進一步制作細胞蠟塊以明確胸腹水的性質;ROS+FH陰性樣本惡性風險不大,可免于制作細胞蠟塊等復雜的細胞病理學檢查。從而有效節(jié)約患者費用和醫(yī)療資源。

總之,盡管ROS+FH染色并不能用于診斷胸腹水的良惡性,但可有效用于胸腹水樣本的排陰性篩查,從而快速排除良性腫瘤患者樣本,實現(xiàn)對胸腹水患者的分層管理,有效節(jié)約患者費用和醫(yī)療資源。