含DHA藻油的茶油對初斷乳小鼠腦部和視網(wǎng)膜發(fā)育的影響

袁傳勛，王成成，吳月，單 琴，金日生

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 合肥 230601）

油茶（Camellia oleifera Abel）是山茶科山茶屬常綠灌木或中喬木，為中國特有木本油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物[1]。茶油是由油茶籽加工提煉得到的一種顏色透明、色澤較淺、氣味芳香的植物油，是一種優(yōu)質(zhì)的食用油。茶油的脂肪酸組成與橄欖油相似，也是唯一能與橄欖油媲美的植物油，素有“東方橄欖油”之稱[2]。茶油具有多種藥理活性和食療價值，可以調(diào)節(jié)血脂，降低膽固醇含量，高含量的不飽和脂肪酸可以起到清除組織中自由基的作用，對紫外線具有較強的吸收能力，可以減少色素沉積，起到抗衰老的功效[3-4]。DHA 是大腦皮質(zhì)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在體內(nèi)水平的高、低直接影響腦細胞的增殖、神經(jīng)傳導(dǎo)、突觸的生長和發(fā)育，它可以防治心腦血管疾病，并具有提高智力及保護視網(wǎng)膜的作用[5-6]。近年來，國家大力發(fā)展油茶種植產(chǎn)業(yè)，茶油的綜合利用得到人們的關(guān)注，然而，目前主要作為食用油，深度加工產(chǎn)品開發(fā)利用不足，產(chǎn)品形式單一。本文采用茶油為基礎(chǔ)原料，通過添加DHA 藻油研發(fā)一種茶油配方，以無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級初斷乳昆明小鼠為試驗對象，研究含不同劑量DHA 藻油的茶油對小鼠空間和學(xué)習(xí)記憶能力、組織發(fā)育和腦組織生化指標的影響，為DHA 藻油在茶油中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶油，六安市山美生物科技有限公司；DHA藻油（DHA 含量為40%），嘉必優(yōu)生物技術(shù)股份有限公司；4%多聚甲醛，賽維爾生物科技有限公司；魚油軟膠囊（DHA 含量為15%），湯臣倍健股份有限公司；生理鹽水，上?？祵幩帢I(yè)有限公司；MDA（丙二醛）試劑盒、T-AOC（總抗氧化能力）試劑盒、CAT（過氧化氫酶）試劑盒、A-ChE（乙酰膽堿酯酶）試劑盒、TP（總蛋白）試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司。

SPF 級雄性初斷乳昆明小鼠，體重（18.62±1.23）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗室室溫控制在（24±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12/24 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于試驗。其中，每天將1 粒魚油軟膠囊取出內(nèi)容物于10 mL 離心管中，準確添加1.5 mL 蒸餾水超聲成乳液用于動物實驗。含DHA 藻油的茶油制備工藝：在40 ℃條件下，將不同劑量的DHA 藻油與茶油混合置于燒杯中，于200 r/min 均勻攪拌10 min，取樣進行動物實驗。分組與飼食配方如表1所示。

表1 小鼠試驗分組及飼食配方Table 1 Groups and formulas of mice experiments

在喂養(yǎng)時間為4 周時，通過隨機數(shù)字法從每組中隨機選擇5 只小鼠，進行Morris 水迷宮行為學(xué)測試。

1.2 儀器與設(shè)備

JAG135 電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；3K15 低溫冷凍離心機，美國Sigma 公司；BSG-26 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-221L 超低溫冰箱，江蘇美菱冰箱有限公司；C2201 超聲波清洗器，上海杰理科技有限公司；UV-1600 紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；Leica EG1150H 石蠟包埋機、Leica RM2235 組織切片機，德國徠卡公司。

1.3 測定方法

1.3.1 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮（Morris water maze MWM）實驗是用來研究小鼠空間記憶能力和學(xué)習(xí)能力的裝置，由英國心理學(xué)家Morris在20世紀80年代初進行設(shè)計[7]。包括圓形水池、自動錄像記錄系統(tǒng)、圖像采集和分析軟件4 個部分。池壁標注4 個入水點并將其均分為4 個象限，隨機選擇1 個象限中央作為平臺放置點。利用嚙齒動物在水中逃避的行為表現(xiàn)一種學(xué)習(xí)能力，通過向水中平臺游往的行為體現(xiàn)空間記憶能力。試驗總歷時6 d，共兩個階段[8]：

1）定位航行實驗 （Place navigation） 訓(xùn)練開始時將平臺放置在一個固定象限，再將小鼠依次從池壁4 個象限的起始點面對池壁放入水池，從剛?cè)胨畷r啟動計時，到找到平臺的這段時間被稱為逃避潛伏期（Escape lateney）。當(dāng)小鼠爬上平臺，使其停留15 s，若在100 s 時間內(nèi)沒有找到平臺，那么試驗者就將其引導(dǎo)到平臺上，逃避潛伏期記錄為100 s，記錄4 次訓(xùn)練的平均值作為當(dāng)天逃避潛伏期。匯總數(shù)據(jù)后將第5 天的逃避潛伏期作為最終成績研究小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2）空間探索實驗 （Spastial probe） 在實驗進行的第6 天移開平臺，將小鼠從距離原先平臺位置對立象限的池壁處放入水中，開始進行空間探索實驗。記錄小鼠在100 s 內(nèi)穿過原先平臺位置的次數(shù)，用來考查小鼠的空間記憶能力。

1.3.2 腦組織蘇木精-伊紅 （Hematoxylin-eosin HE）染色 在解剖的過程中，即刻提取各組別小鼠的大腦組織，用4%多聚甲醛固定，放在冰箱保存?zhèn)溆肹9]。操作步驟如下：

1）石蠟切片脫蠟至水 依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-75%酒精5 min，自來水洗。

2）蘇木素染色 切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗。

3）伊紅染色 切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min。

4）脫水封片 切片依次放入無水乙醇I 5 min-無水乙醇II 5 min-無水乙醇Ⅲ5 min-二甲Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min 透明，中性樹膠封片。

5）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析 細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色。

1.3.3 海馬組織尼氏染色 水迷宮實驗后，各組小鼠麻醉后解剖，取出各組別小鼠的大腦組織，用4%多聚甲醛固定，將冠狀面切片[10]。具體操作步驟如下：

1）石蠟切片脫蠟至水 依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-75%酒精5 min，自來水洗。

2）甲苯胺藍染色 組織切片入染液 2～5 min，水洗，0.1%的冰醋酸稍分化，自來水洗終止反應(yīng)，顯微鏡下控制分化程度，自來水洗后，將切片置于烤箱烤干。

3）透明封片 切片入干凈的二甲苯透明10 min，中性樹膠封片。

4）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析 腦組織尼氏體呈深藍色，背景淡藍色。

1.3.4 視網(wǎng)膜過碘酸-雪夫 （Periodic acid-schiff PAS）染色 在解剖的過程中，即刻提取小鼠各組的眼睛組織，用4%多聚甲醛固定，放在冰箱保存?zhèn)溆肹11]。具體操作步驟如下：

1）取材 取視神經(jīng)功能正常的小鼠眼球，用4%多聚甲醛固定12 h 以上。

2）剝離 從4%多聚甲醛中取出眼球，用PBS 洗滌除去固定液，再放入盛有PBS 溶液的培養(yǎng)皿中。將眼球取出，用食指和拇指夾住眼球，用針頭扎使房水流出，剪開虹膜后輕輕剝出角膜和晶狀體，再浸入PBS 溶液之中漂洗后均勻分成3～4 份，用鑷子剝離出視網(wǎng)膜層后在PBS 溶液中浸洗一段時間。

3）消化 用粗口玻璃吸管吸出步驟2 中的視網(wǎng)膜，放入裝有胰酶消化液玻璃小瓶中，于37℃烤箱過夜消化，時間22～24 h。

4）吹打 采用粗口玻璃吸管，吸出1 瓣視網(wǎng)膜，放入裝滿純水的培養(yǎng)皿中，吹打視網(wǎng)膜幾次，轉(zhuǎn)入裝有熱水的培養(yǎng)皿中，再去除黏附細胞直至呈現(xiàn)透明狀。

5）鋪片 用玻璃吸管吸取透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，使血管網(wǎng)完全展開在玻片上，自然晾干。

6）PAS 染色 視網(wǎng)膜毛細血管呈紅色，細胞核呈藍色。

1.3.5 腦組織MDA、T-AOC、CAT 和A-ChE 測定方法 從冰柜中取出腦組織解凍，準確稱取0.1 g，按1∶9（質(zhì)量體積比）加入生理鹽水，置于高速勻漿機內(nèi)充分研磨使細胞破碎，所得勻漿在3 500 r/min 離心10 min，取上清液參照試劑盒上的方法進行操作[12]。TP 總蛋白采用考馬斯亮藍法試劑盒檢測，各組通過TP 進行歸一化處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS22.0 軟件作單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，并用origin 9.0 軟件進行繪圖。當(dāng)P<0.05 時，差異性顯著，當(dāng)P<0.01，差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

從圖1可知，含DHA 藻油的茶油低、中、高劑量組小鼠的逃避潛伏期分別從空白組的（26.47±1.6）s 縮短到（14.77±1.94）s（P<0.01）、（12.13±2.17）s（P<0.01）和（14.03±2.05）s（P<0.01），中劑量組相對于陰性組具有極顯著差異（P<0.01）；陽性對照組的逃避潛伏期縮短至（16.99±1.16）s（P<0.01），與陰性組相比具有顯著性差異（P<0.05）。從圖中可知，陰性組相較于空白組，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，均具有顯著性（P<0.05）。這是因為茶油具有良好的抗氧化能力，可以清除腦組織中的自由基，長期食用可以起到保護腦細胞的效果，有利于增強記憶力，這與參考文獻[3]中的結(jié)論一致。其中，中劑量組的小鼠跨越平臺次數(shù)從空白組的（2.87±0.47）增加到（9.67±1.94）（P<0.01），陰性組與空白組相比具有顯著性差異（P<0.05），陽性組和茶油低、高劑量組相較于空白組具有極顯著性差異（P<0.01），并且中劑量組相比陰性組具有極顯著性差異（P<0.01）。上述結(jié)果表明，與空白組相比，陽性組和茶油各劑量組小鼠的逃避潛伏期均呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.05，P<0.01），茶油組隨著劑量的增加，逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)增加。但高劑量組的效果不及中劑量組，說明適當(dāng)?shù)腄HA 藻油劑量范圍內(nèi)的茶油攝入可以增強小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶能力，過量的DHA 藻油的茶油攝入反而不具有良好的效果。

圖1 各組別小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)Fig.1 Escape latency and number of crossing platforms in each group of mice

2.2 小鼠腦組織HE 染色結(jié)果

由圖2可知，茶油各劑量組具有完整的細胞結(jié)構(gòu)、紫色的細胞核且細胞質(zhì)分布較為均勻，具有規(guī)則的細胞形狀，呈現(xiàn)正常的狀態(tài)，并且不具有炎癥細胞感染的癥狀，視野中海馬結(jié)構(gòu)完整，齒狀回（Dentate gyrus DG） 區(qū)可見較多錐體細胞固縮深染，嗜堿性增強；空白組視野中海馬結(jié)構(gòu)完整，CA1 區(qū)及DG 區(qū)可見有錐體細胞固縮深染，細胞形狀不規(guī)則（黑色箭頭）；陰性組細胞形態(tài)正常，但零星出現(xiàn)白色斑點，是因為切片時在脫蠟溶劑中停留時間過短產(chǎn)生的，并不影響腦組織細胞結(jié)構(gòu)整體形態(tài)。陽性組細胞結(jié)構(gòu)較為清晰，細胞核形狀完整，結(jié)構(gòu)規(guī)則，染色均勻，但局部皮層可見淤血（紅色箭頭）。綜合以上所述，中劑量組具有更加完整的腦組織細胞結(jié)構(gòu)，無皮層淤血現(xiàn)象，CA1 區(qū)和DG 區(qū)細胞形狀規(guī)則，嗜堿性增加（腦組織中的核糖體、細胞核等數(shù)量更多），觀察清晰，更有利于小鼠腦組織的發(fā)育。

圖2 小鼠腦組織HE 染色（40×）Fig.2 HE staining of mice brain tissue （40×）

2.3 小鼠海馬神經(jīng)組織尼氏染色結(jié)果

由圖3可知，小鼠海馬組織尼氏染色結(jié)果顯示，陰性組海馬區(qū)與空白組相比，尼氏體略有增加；陽性組相較于空白組，海馬組織細胞數(shù)量增多，形態(tài)更加完整，排列也更加有序；茶油各劑量組相較于空白組，細胞數(shù)量并無減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)無變性部分，錐體細胞、神經(jīng)元和顆粒細胞連接緊密，排列較為整齊，尼氏體較為明顯。其中尼氏體是海馬神經(jīng)元內(nèi)合成蛋白質(zhì)的重要部位，茶油中、高劑量組尼氏體豐富，形狀、數(shù)量和分布位置合理，說明中、高劑量DHA 藻油的茶油具有促進腦組織海馬區(qū)細胞及神經(jīng)元的發(fā)育，而海馬區(qū)是幫助處理學(xué)習(xí)和記憶的區(qū)域，當(dāng)一個短期記憶被重復(fù)提及后會被海馬區(qū)轉(zhuǎn)存進入大腦皮層[13]，所以茶油組小鼠海馬的發(fā)育也說明了Morris 水迷宮實驗中結(jié)果的準確性。

圖3 小鼠海馬組織尼氏染色（200×）Fig.3 Nissl staining of mice hippocampus （200×）

2.4 小鼠眼球視網(wǎng)膜PAS 染色結(jié)果

由圖4可知，空白組小鼠視網(wǎng)膜鋪片染色后結(jié)構(gòu)正常，血管略細，可觀察到細胞整體形態(tài)；陰性組與空白組相比無明顯差別；其中陽性組細胞結(jié)構(gòu)分層清晰，無水腫現(xiàn)象，視網(wǎng)膜血管分布均勻，走向規(guī)則，有部分扭曲和聚集的現(xiàn)象，主要是視網(wǎng)膜細胞數(shù)量增多，枝節(jié)血管增加導(dǎo)致。茶油各劑量組視網(wǎng)膜細胞間隙正常，無增大現(xiàn)象，各層細胞排列整齊，可清晰的觀察到視網(wǎng)膜血管的分布及延伸方向，分支清晰完整，無斷裂現(xiàn)象發(fā)生。細胞核可較為清晰的顯示，細胞整體形態(tài)清晰，血管密度適中。其中中、高劑量組視網(wǎng)膜血管分層清晰，空間分布均勻，具有更規(guī)則的走向[14-15]。說明含DHA 藻油的茶油組可以起到促進小鼠視網(wǎng)膜細胞發(fā)育的效果。

圖4 小鼠視網(wǎng)膜鋪片PAS 染色（200×）Fig.4 PAS staining of mice retina spread （200×）

2.5 小鼠大腦組織MDA、T-AOC、CAT 和AChE 活性測定結(jié)果

MDA 是膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還可以加劇膜的損傷[16]。由表2可知，與空白組相比，陰性組具有顯著性差異（P<0.05），陽性組和茶油各劑量組具有極顯著性差異 （P<0.01）；與陰性組相比，茶油各劑量組均具有顯著性差異（P<0.01）；與陽性組相比，茶油各劑量組均具有顯著性差異 （P<0.01）。隨著茶油中DHA 劑量的增加，小鼠腦組織中MDA 含量呈現(xiàn)先降低而后升高的趨勢，說明含DHA 藻油的茶油在一定劑量范圍內(nèi)可以促進對機體脂質(zhì)的保護，但是當(dāng)不飽和脂肪酸含量增加時，氧化可能性增強，這種保護作用就會被解除[13]。

表2 各組別對小鼠腦組織中MDA、T-AOC、CAT 和A-ChE 活性水平的影響Table 2 Effects of each group on the activity levels of MDA，T-AOC，CAT and A-ChE in mice brain tissue

T-AOC 是組織中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等總抗氧化能力[17]。與空白組相比，陰性組和低劑量組沒有顯著性差異（P＞0.05），陽性組和中、高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01），與陽性組相比，茶油中劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。說明相比于茶油，隨著DHA 劑量的增加，活性物質(zhì)含量增高，T-AOC 的活性逐漸增強，劑量越高，效果就越明顯，對腦組織抗氧化活性具有一定的促進作用，但是當(dāng)DHA 劑量過多時，抗氧化能力反而有所下降。

CAT 酶促活性為大腦組織提供了抗氧化防御機制[18]。與空白組相比，陰性組沒有顯著性差異（P＞0.05），茶油低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），陽性組和茶油中、高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01）；與陽性組相比，茶油低劑量組沒有顯著性差異（P＞0.05），中劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01），高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。這說明含DHA 藻油的茶油能顯著性的增強小鼠腦組織中的CAT 活性，且隨著劑量的增加，其CAT 活性也呈現(xiàn)先增強后降低的趨勢，這與腦組織中總抗氧化能力的檢測結(jié)果一致。

A-ChE 在生物神經(jīng)傳導(dǎo)中是一種關(guān)鍵性酶，與動物學(xué)習(xí)和記憶能力關(guān)系密切[19]。結(jié)果顯示，與空白組相比，陰性組和低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），陽性組和中、高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01）。中劑量組相對于陽性組具有顯著性差異（P＜0.05）。說明含DHA 藻油的茶油可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，降低小鼠腦組織分解乙酰膽堿的能力，間接的增加腦部乙酰膽堿的含量，從而有利于神經(jīng)信號在突觸間的傳遞[20]，最終體現(xiàn)為小鼠學(xué)習(xí)能力和空間能力的增強，這與水迷宮實驗結(jié)果相符合。

3 結(jié)論

通過Morris 水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，茶油各劑量組小鼠的逃避潛伏期均呈現(xiàn)下降趨勢，穿越平臺次數(shù)增加，說明含DHA 藻油的茶油的攝入可以增強小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶能力。

組織染色結(jié)果顯示茶油組小鼠腦組織中具有完整的細胞結(jié)構(gòu)、紫色的細胞核且細胞質(zhì)分布較為均勻，海馬組織細胞數(shù)量增多，尼氏體豐富，視網(wǎng)膜血管分布均勻，無扭曲和聚集的現(xiàn)象，走向規(guī)則，血管密度適中。說明含DHA 藻油的茶油攝入可以促進小鼠腦部及視網(wǎng)膜的發(fā)育。雖然高劑量組有利于海馬區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育，但腦組織中MDA含量相較于中劑量組含量更高，過多的DHA 攝入會引起腦組織產(chǎn)生較多的脂質(zhì)過氧化物。中劑量組具有更完整的腦組織結(jié)構(gòu)，綜合水迷宮實驗及組織染色結(jié)果，認為中劑量組更有利于小鼠腦部及視網(wǎng)膜的發(fā)育。