文冠果葉提取物降血壓活性研究

王 亞，馬挺軍

（北京農(nóng)學院食品科學與工程學院 北京 102206）

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）是無患子科文冠果屬植物，是中國特有的古老的木本油料樹木類型，有200 多年的種植歷史，又被稱作“北方油茶”，在我國內(nèi)蒙古、河南、甘肅、新疆等地區(qū)廣泛種植[1]。其葉片、果殼、果仁、種皮[2-5]均含有多種活性物質(zhì)。文冠果葉含楊梅苷、槲皮素、蘆丁、香豆素等活性物質(zhì)，除此之外，文冠果葉中還含有皂苷類化合物，皂苷是一種存在于植物中的特殊苷類物質(zhì)，在組成上由皂苷元和大部分以分子狀態(tài)存在的糖、糖醛酸等物質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)皂苷元組成可將皂苷分為三萜類皂苷和甾體類皂苷，而文冠果中多為三萜類皂苷[6]。研究表明，皂苷類化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血壓等活性[7-9]。

高血壓是心血管疾病的重要因素之一。據(jù)2018年中國心血管疾病報告，中國有2.9 億心血管疾病患者[10]。慢性高血壓可導致心血管疾病，如心力衰竭、心臟病、中風、冠狀動脈疾病，以及其它疾病，如腎臟疾病、視力喪失、癡呆、抑郁等[11-12]。

近年來，文冠果作為特種經(jīng)濟作物被廣泛研究。有研究表明文冠果具有治療阿爾茲海默癥、抑菌、抗癌等活性[13-15]，然而，對于文冠果葉降血壓活性的研究報道較少。本文用文冠果葉正丁醇提取物做動物體內(nèi)試驗，期間檢測大鼠收縮壓、舒張壓、平均壓、心率、血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇等指標，探究文冠果葉正丁醇提取物對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR 大鼠）的影響，以及降血壓活性，為文冠果保健功能產(chǎn)品開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 文冠果葉，華清農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。用粉碎機粉碎，過60 目篩，備用。

文冠果葉正丁醇提取物 （N-butanol extract from Xanthoceras sorbifolia leaves，X-NE），將2 g 文冠果葉加入10 mL 石油醚脫脂后用60%乙醇回流提取3 次得提取物，將提取物用水溶解，3 500 r/min 離心15 min 后取上清液用正丁醇萃取3次得到。

蘆丁、沒食子酸、齊墩果酸標準品，中國食品藥品檢定研究院；香草醛、乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、亞硝酸鈉等均為分析純，西隴化工股份有限公司；福林酚試劑，美國Sigma 公司；碳酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、高氯酸等均為分析純，北京化工廠。氨氯地平，浙江新賽科藥業(yè)有限公司；羧甲基纖維素，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 試驗儀器 KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LabTech 紫外分光光度計UV9100D，北京萊伯泰科儀器有限公司；FW177 中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；7020 全自動生化分析儀，日本日立公司；BP2006A型智能無創(chuàng)血壓計，北京軟隆科技有限責任公司。

1.2 實驗動物

SPF 級大鼠（72 只，其中自發(fā)性高血壓SHR大鼠60 只，正常Wistar 大鼠12 只，平均質(zhì)量為200～240 g）均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0002。試驗期間以鼠全價顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲用無菌水，并適應性喂養(yǎng)5 d 后進行試驗。

1.3 方法

1.3.1 黃酮含量測定 取蘆丁標準品50 mg，用60%乙醇溶解并定容至50 mL。稱取5 mL 置于50 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/mL 的標準品儲備液。稱取上述標準液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL溶液于試管中，并添加60%乙醇至10.0 mL。依次加入5%的NaNO20.6 mL，靜置5 min，加入10%的AlCl30.6 mL，靜置6 min，加入4% NaOH 4 mL，混勻后添加60%乙醇至20 mL，靜置15 min后置于510 nm 吸光度下進行比色，測定其吸光值。以蘆丁含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性擬合得到回歸方程y=2.1633x-0.0161，R2=0.9993，式中，x 為文冠果葉黃酮含量（mg），y 為波長510 nm 處測定的吸光值。

用粉碎機將文冠果葉粉碎成末，準確稱取2 g的文冠果葉粉。按1∶10（g/mL）的比例用石油醚將葉粉脫脂15 min，離心，取下層沉淀，將其吹干，用60%乙醇定容至50 mL。樣品測定時準確吸取溶液2 mL，添加60%乙醇至5 mL，剩余操作同上。

1.3.2 酚酸的測定方法 取沒食子酸標準品10 mg，定容至100 mL，即配成0.1 mg/mL 的標準品儲備液，分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 沒食子酸標準液，定容至6 mL，即得10，20，30，40，50 μg/mL 的標準液。吸取上述標準液0.4 mL，加入2 mol/L 福林酚試劑0.1 mL 和15%的Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至8 mL。在25 ℃反應2 h，另吸取蒸餾水0.4 mL，同上操作。置于765 nm 吸光度下進行比色，測定其吸光值，以沒食子酸含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性擬合得到回歸方程y=0.0066x+0.0157，R2=0.9991，式中，x 為文冠果葉酚酸含量，y 為波長765 nm 處測定的吸光值。

準確稱取2 g 文冠果葉粉，加入60 mL 的60%的乙醇溶液，在50 ℃條件下回流提取40 min，抽濾后，取膏體用乙醇溶解，定容50 mL，取0.4 mL，按照上述標準曲線方法進行測定。

1.3.3 皂苷的測定方法[16]標準曲線按香草醛比色法操作。通過線性擬合得到回歸方程y=5.645x-0.233，R2=0.9994。式中，x 為大豆皂苷含量（mg），y為波長541 nm 處測定的吸光值。

將文冠果葉正丁醇提取物按照上述標準曲線方法進行測定。

1.3.4 X-NE 提取物降血壓活性試驗 雄性Wistar 大鼠12 只，測量其血壓值并做為空白對照組，雄性SHR 大鼠60 只，測量其血壓值，根據(jù)血壓隨機分為5 組，分別為陰性對照組、陽性對照組、XNE 高劑量組（2 g/kg）、X-NE 中劑量組（1 g/kg）、X-NE 低劑量組（0.5 g/kg）。于分組當天開始給藥，空白對照組和陰性對照組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素溶液，陽性對照組灌胃給予氨氯地平混懸液（5 mg/kg），X-NE 低、中、高劑量組分別灌胃給予X-NE，每天給藥1 次，連續(xù)給藥4 周，每周測量動物血壓1 次。

試驗期間室內(nèi)通風狀況良好，控制溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%；每日12/12 h 交替照明；每小時換氣15 次以上。所有大鼠均喂飼鼠全價顆粒飼料及無菌水，自由攝取。每周測量動物收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）1 次，并計算其平均壓（mean blood pressure，MBP），于給藥結(jié)束當天動物眼眶靜脈叢采血、在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，然后取上清凍存，檢測血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇含量。

1.3.5 統(tǒng)計學處理 將試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件整理，結(jié)果以±s 表示。用SPSS 16.0 軟件分析試驗結(jié)果，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表明具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果葉提取物中黃酮、酚酸、皂苷含量分析

由圖1可知，文冠果葉提取物中黃酮、酚酸的含量分別為3.84%，3.35%，皂苷含量相對較高，為5.3%。邱悅等[17]通過醇提法提取文冠果葉中的總皂苷，最優(yōu)條件下皂苷得率為4.952%，而本試驗提取物中皂苷含量更高，這可能是由于文冠果葉原料不同，通過回流提取后提取率更高。

圖1 文冠果葉黃酮、酚酸及皂苷含量Fig.1 Contents of flavonoids，phenolic acids and saponins in Xanthoceras sorbifolia leaves

2.2 灌胃4 周對大鼠血壓的影響

由表1～表3可知，陰性對照組SHR 大鼠的血壓（SBP、DBP 和MBP）持續(xù)保持較高的水平，與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.01、P<0.05、P<0.05）。與陰性對照組相比，陽性對照組（5 mg/kg）在給藥觀察期間能夠持續(xù)穩(wěn)定的降低動物的SBP、MBP，在1～4 周均具有極顯著差異（P<0.01），而DBP 在1～2 周具有極顯著差異（P<0.01），在3～4 周具有顯著差異（P<0.05）。這表明氨氯地平可以降低SHR 大鼠血壓，較好地控制血壓水平。氨氯地平是一種鈣通道阻滯劑，可以有效地降低血壓[17]。Mohd 等[19]通過對SHR 大鼠口服1 mg/kg 的氨氯地平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨氯地平治療可有效降低高血壓大鼠的SBP、DBP 和MBP，本試驗采取灌胃給藥，且氨氯地平質(zhì)量濃度較高（5 mg/kg），因此降壓效果更為明顯。

X-NE 高劑量組收縮壓和平均壓在第4 周有下降趨勢且差異極顯著（P<0.01），而舒張壓在第3周有下降趨勢，在第4 周具有顯著差異（P<0.05）且達到最低（101.20±20.54）mmHg。X-NE 中劑量組收縮壓和平均壓在3、4 周均有極顯著差異（P<0.01），并逐漸趨于穩(wěn)定，舒張壓在第3 周有顯著差異（P<0.05），第4 周差異極顯著（P<0.01）。X-NE低劑量組SHR 大鼠收縮壓逐漸升高，但與陰性對照組相比在第4 周差異顯著（P<0.05），而舒張壓和平均壓均在第二周有所增加，隨后開始下降，降壓效果不穩(wěn)定，而且與X-NE 中高劑量組比較，降壓效果更差。曹敏等[20]通過口服給予SHR 大鼠三七花皂苷，發(fā)現(xiàn)其高、中、低劑量組[60 mg/（kg·d）、30 mg/（kg·d）、15 mg/（kg·d）]大鼠的收縮壓、舒張壓均在第2 周后開始出現(xiàn)顯著降低。陳梅卿[21]通過腹腔注射人參皂苷Rb1 對SHR 大鼠作用12 周后，高、低劑量組【60 mg/（kg·d）、30 mg/（kg·d）】血壓均較治療前明顯下降（低劑量降低7.91%，高劑量組降低19.25%），但較氨氯地平組 【5 mg/（kg·d）】（降低24.17%）差。這與本試驗的結(jié)果略有差異，由表1、表3可知，X-NE 高、中劑量組血壓下降且均高于陽性對照組，這是由于劑量的不同，并且X-NE 提取物中皂苷含量較高所導致。至今并未有研究表明文冠果葉的降血壓機理，而文冠果葉中皂苷含量高達5.3%，因此推斷可能是X-NE中的皂苷起到了降血壓作用。

表1 灌胃4 周對SHR 大鼠收縮壓的影響Table 1 Effect of X-NE on systolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding

表3 灌胃4 周對SHR 大鼠平均壓的影響Table 3 Effect of X-NE on mean blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding

2.3 灌胃4 周對大鼠血清心率的影響

表2 灌胃4 周對SHR 大鼠舒張壓的影響（±s，n=12）Table 2 Effect of X-NE on diastolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding （±s，n=12）

表2 灌胃4 周對SHR 大鼠舒張壓的影響（±s，n=12）Table 2 Effect of X-NE on diastolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding （±s，n=12）

組別 舒張壓/mmHg第1 周 第2 周 第3 周 第4 周空白對照組 102.10±6.84 103.40±9.32 95.30±12.38 102.10±11.78陰性對照組 113.50±10.16△ 112.10±13.25 118.70±12.29△△ 118.80±10.34△△陽性對照組 94.10±16.09** 99.10±11.24** 106.15±10.15* 108.10±10.76*X-NE 高劑量 102.00±16.17 115.70±7.21 109.90±19.76 101.20±20.54*X-NE 中劑量 96.10±24.52 112.40±14.21 102.80±16.46* 97.60±11.02**X-NE 低劑量 110.80±14.57 117.00±23.03 107.10±30.59 105.10±14.51*

心率被視為評價交感神經(jīng)活性的有效指標，交感神經(jīng)過度激活在高血壓的病程中發(fā)揮了重要作用[22]，因此心率加快可能會加速高血壓的發(fā)生。

由表4可知，以X-NE 灌胃大鼠4 周，與陰性對照組及空白對照組相比，陽性對照組及X-NE各劑量組的心率在試驗4 周內(nèi)均無顯著性差異（P＞0.05），這表明X-NE 對大鼠心率并無顯著影響。

表4 給藥4 周對SHR 大鼠心率的影響Table 4 Effect of X-NE on heart rate of SHR rats after 4 weeks of feeding

2.4 灌胃4 周對大鼠血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇含量的影響

高血壓時血管剪應力的增加會使內(nèi)皮細胞內(nèi)Ca2+水平降低，導致NO 合酶活性降低，NO 的舒張血管效應減弱[23]。通過檢測血清中ET-1 和NO 的表達量可以簡單而有效的評估SHR 大鼠的血壓變化情況[24]。王禹程等[25]研究表明，通過升高NO含量或降低ET-1 含量可以起到降血壓作用。同時血脂增高時可以影響血管的外周阻力，使其增高，從而減弱血管壁的彈性，使血液的黏度增加，可形成或進一步加重高血壓疾病[26]。由表5可知，XNE 所有劑量組血脂TG 與陰性對照組比較均極顯著性降低（P<0.01），中劑量組最低，為（0.27±0.04）mmHg，同時中劑量組能夠顯著降低血清ET-1 水平和極顯著升高血清NO 水平，與陰性對照組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 給藥4 周后對大鼠TG、CHO、ET-1 和NO 的影響Table 5 Effect of X-NE on TG，CHO，ET-1 and NO of SHR rats after 4 weeks of feeding

3 結(jié)論

文冠果葉中黃酮含量為3.84%，酚酸含量為3.35%，皂苷含量為5.3%。本研究通過正丁醇萃取得到文冠果葉提取物X-NE，并選取此提取物進行體內(nèi)實驗，灌胃4 周后，與陰性對照組相比，SHR 大鼠血壓顯著降低，低、中、高劑量組（0.5，1，2 g/kg）大鼠收縮壓、平均壓、舒張壓和血脂均顯著降低 （P＜0.05）；大鼠心率及CHO 無顯著性變化（P＞0.05）；中劑量組大鼠血清ET-1 顯著降低，NO含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，文冠果葉提取物可以降低SHR 大鼠血壓，并且中劑量組還能顯著降低大鼠血脂與血清ET-1，升高血清NO 水平（P＜0.05），明顯改善SHR 大鼠自身反應因子紊亂的狀況，因此中劑量組具有降血壓活性，推斷其降血壓活性物質(zhì)為皂苷，下一步將對文冠果葉提取物進行分離并闡明皂苷結(jié)構(gòu)與降血壓之間的關系。