魯雷震，宏 丹，封成玲，賈紫偉，周景波，寧亞維，賈英民，王志新*

（1 河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院 石家莊 050018 2 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048）

有害真菌會(huì)導(dǎo)致食品腐敗，常見的食物腐敗真菌主要包括青霉、曲霉、根霉等絲狀真菌，部分菌株還會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，如黃曲霉毒素、伏馬毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等，對許多食品（乳制品、肉制品、烘焙食品及其衍生產(chǎn)品等）造成污染[1-2]。目前，應(yīng)對有害真菌造成的食物腐敗，使用最多的是添加化學(xué)防腐劑。隨著人們生活水平的提高，對化學(xué)防腐劑的安全性有所擔(dān)憂。開發(fā)安全、高效的生物源抑真菌物質(zhì)成為發(fā)展的迫切需求。

抗真菌肽是一種具有雙親性的小分子多肽，一般由10～50 個(gè)氨基酸組成，是能夠抑制真菌侵害的一種多肽[3]。它可作為一種安全、高效的真菌抑制劑作用于食品防腐，并且獨(dú)特的抑真菌機(jī)理也解決了其它藥物導(dǎo)致的真菌耐藥性的問題[4]。瑞典科學(xué)家Boman[5]首次從惜古天蠶中發(fā)現(xiàn)小分子抗菌肽，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗真菌作用。此后，人們先后從不同的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗真菌肽，包括植物、動(dòng)物和微生物，還有人工合成抗真菌肽[6]。微生物來源抗菌肽具有成本低、無殘留、無毒害等優(yōu)點(diǎn)，并且微生物是一個(gè)巨大的寶庫，抗真菌肽的來源異常豐富，篩選獲得具有高效、廣譜抑真菌特性的微生物一直是研究者關(guān)注點(diǎn)。

目前分泌抗真菌肽的菌株大多數(shù)為芽孢桿菌屬微生物，包括枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。例如：于杰等[7]從海南省香蕉根部土壤中分離得到一株枯草芽孢桿菌B25，能有效抑制香蕉枯萎病鐮刀菌以及其它植物病原真菌。錢英等[8]從土壤中篩選分離得到1 株解淀粉芽孢桿菌BW-13，對釀酒酵母和植物病原真菌灰霉均具顯著的抑菌活性。Ji 等[9]從植物根際土壤樣品中篩選得到1 株芽孢桿菌，所產(chǎn)抗真菌蛋白在植物病原真菌的生物防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。目前這些微生物及其所產(chǎn)抗菌肽主要用于生物防治，而用于食品防腐的較少，此外，所研究的抗真菌肽產(chǎn)量較低，極少人優(yōu)化了發(fā)酵條件。基于此，本研究從江蘇、河北土壤樣品中篩選具有產(chǎn)抗真菌肽的菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高其發(fā)酵產(chǎn)量，為抗真菌肽的資源開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤取自河北、江蘇等地；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（LB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、蛋白酶K、蛋白酶E，北京Solarbio 公司；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（SW-CJ-1FD），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（ZSD-A1160）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY），上海智城分析儀器制造公司；立式蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50SII），上海博迅有限公司；分光光度計(jì)（Evolution 220），美國Thermo 公司；冷凍離心機(jī)（SIGMA3-18K），德國Sigma 公司；全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（Scan1200），法國Interscience公司；牛津杯（10 mm×7.8 mm×6 mm），新鄉(xiāng)市新華檢測儀器廠；發(fā)酵罐（5 L），上海保興生物設(shè)備工程有限公司；發(fā)酵罐（30 L），上海國強(qiáng)生化工程設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選與鑒定 將土壤樣品進(jìn)行研磨，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布到產(chǎn)黃青霉指示菌平板上，28 ℃培養(yǎng)，篩選出透明圈較大的菌株。然后將初篩獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵，分別以總狀毛霉、黃曲霉、白假絲酵母作為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法[10]對發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌活性測定。

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]及《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[12]中的方法，對菌株進(jìn)行生理生化鑒定。由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 序列同源性鑒定，將獲得的測序結(jié)果利用NCBI 進(jìn)行BLAST 分析，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬關(guān)系。

1.3.2 抑菌物質(zhì)的確定

1.3.2.1 過氧化氫的排除 參考張艾青等[13]的方法進(jìn)行并加以改進(jìn)，以未處理的發(fā)酵液作為對照，瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌活性的變化。

1.3.2.2 蛋白酶處理 分別將胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶E、蛋白酶K、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶等用各自最適pH 值緩沖液配制成10 mg/mL 的酶液，與發(fā)酵液等量混合，在各種酶最適溫度下溫浴2 h，滅酶5 min，pH 值調(diào)至初始值。以未處理的發(fā)酵液作為對照，瓊脂擴(kuò)散法測定蛋白酶處理后的抑菌活性。

1.3.2.3 硫酸銨沉淀 根據(jù)硫酸銨飽和度常用表[14]稱取對應(yīng)的克數(shù)，使硫酸銨飽和度分別為35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，4 ℃下靜置12 h，然后4 ℃、8 000 r/min 離心20 min，獲得沉淀，用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液定容至原體積，測定其抑菌活性，以未處理的上清液和相同鹽離子濃度的磷酸鹽緩沖液作為對照。

1.3.2.4 膜透析分離處理 將1.3.2.3 節(jié)鹽析得到的粗提液分別裝入截留分子質(zhì)量為0.5，1，2 和3.5 ku 的透析袋中，用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0，0.05 mol/L）進(jìn)行透析，以透析前的粗提液作為對照，測定透析處理后樣品的抑菌活性。

1.3.2.5 熱穩(wěn)定性分析 將發(fā)酵液分別置于4，20，30，37，50，60，80，100 ℃處理2 h，然后放置至室溫。以未處理的發(fā)酵液作為對照，測定不同溫度處理發(fā)酵液的抑菌活性。

1.3.3 抑菌譜的測定 采用瓊脂擴(kuò)散法測定愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵上清液對真菌[10]和細(xì)菌[15]的抑制作用。

1.3.4 菌株生長曲線的測定 采用比濁法測定愛媛類芽孢桿菌HD 生長曲線。每隔2 h 進(jìn)行取樣，在OD600處測定吸光度值，繪制生長曲線。

1.3.5 發(fā)酵液效價(jià)的測定 參考王廣賢[16]的方法進(jìn)行發(fā)酵液效價(jià)的測定。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.6.1 碳源優(yōu)化 碳源選擇液糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、殼聚糖、乳糖、環(huán)糊精、蔗糖、甘露醇和可溶性淀粉，添加量為1 g/100 mL，以不添加上述碳源的LB 培養(yǎng)基作為對照。確定最佳碳源后，對其最適添加量進(jìn)行探究。添加量設(shè)置為0.5，1，

1.5，2 ，2.5，3，4，5 g/100 mL。采用瓊脂擴(kuò)散法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，按照1.3.5 節(jié)的方法計(jì)算發(fā)酵液的效價(jià)。

1.3.6.2 氮源優(yōu)化 氮源選擇胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、酵母膏、酵母粉、魚蛋白胨、白色玉米漿、尿素、硫酸銨和發(fā)酵玉米漿。對照選擇為以添加0.5 g/100 mL 甘露醇和1 g/100 mL NaCl的培養(yǎng)基。氮源添加量設(shè)置為0.5，1，1.5，2 g/100 mL。

1.3.6.3 無機(jī)鹽的優(yōu)化 無機(jī)鹽選擇MgSO4、Fe-Cl3、Fe2（SO4）3、CaCl2、NaCl、KCl 和KH2PO4，添加量為0.1 g/100 mL，對照選擇為不添加金屬離子的培養(yǎng)基 （0.5 g/100 mL 甘露醇、1.0 g/100 mL 魚蛋白胨）。無機(jī)鹽添加量設(shè)置為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g/100 mL。

1.3.6.4 正交試驗(yàn) 選擇甘露醇、魚蛋白胨、Mg-SO4進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成。

1.3.7 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.7.1 單因素優(yōu)化 采用控制變量法，其它條件不變，選擇不同的菌齡（12，18，24，36 h）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值（5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9）、裝液量（30，40，50，60，70，80，90，100 mL/250 mL）、接種量 （0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5×108CFU/mL）、發(fā)酵溫度（28，30，32，34，37 ℃）、轉(zhuǎn)速（180，200，220，240 r/min）、發(fā)酵時(shí)間（6，12，18，24，36，48，60，72 h），利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測定發(fā)酵液活性并計(jì)算效價(jià)。

1.3.7.2 正交試驗(yàn) 選擇對發(fā)酵時(shí)間、接種量、裝液量、初始pH 值進(jìn)行四因素四水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.8 發(fā)酵放大驗(yàn)證 以搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，選用工業(yè)級碳氮源，甘露醇2.5 g/L，魚蛋白胨10 g/L，MgSO43 g/L。發(fā)酵條件為：300 r/min，裝液量50%，接種量2.5×108CFU/mL，通氣量9 L/min，發(fā)酵溫度32 ℃。在5，30 L 發(fā)酵罐中分別進(jìn)行愛媛類芽孢桿菌HD 抗真菌肽發(fā)酵生產(chǎn)的放大驗(yàn)證。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析 上述試驗(yàn)每組進(jìn)行3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)取其平均值，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用Origin8.0 軟件進(jìn)行圖形繪制，SPSS statistics 20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

從河北、江蘇等地采集到26 個(gè)土壤樣品，經(jīng)過初篩，獲得5 株具有抑菌效果的菌株，結(jié)果如表1所示。菌株HD 和GL 對產(chǎn)黃青霉的抑菌活性最好，其次為菌株MH、XM 和YM。

表1 不同菌株對產(chǎn)黃青霉抑菌圈大小比較Table 1 Comparison of inhibition zone of different strains against Penicillium chrysogenum

進(jìn)一步對菌株HD、GL 進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。菌株HD 的抑菌活性稍高于菌株GL。因此，本研究選擇菌株HD 作為后續(xù)研究的菌株。

表2 菌株對不同真菌抑菌圈大小比較Table 2 Comparison of inhibition zone of strains against different fungi

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果 37 ℃條件下，菌株HD 在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后菌落形態(tài)如圖1a 所示，菌株HD 的菌落形態(tài)較大，呈圓形，表面濕潤，菌落隆起，顏色為乳白色。經(jīng)革蘭氏染色觀察，結(jié)果如圖1b 所示，菌體呈短桿狀，有芽孢，顏色為紫色，為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株HD 形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain HD

菌株HD 經(jīng)過核糖、葡萄糖、糖原、麥芽糖、N-乙酰-葡萄糖胺等生理生化試驗(yàn)為陽性，經(jīng)過鼠李糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖等生理生化試驗(yàn)為陰性。與王曦[17]報(bào)道的愛媛類芽孢桿菌的理化鑒定結(jié)果一致。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 由上海生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA 測序，序列長度為1 374 bp，將其提交GenBank，登錄號為MT186159。

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果所示，菌株HD 與愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）HNSQJYH 130 和愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis）KCTC3747 同源性為99%（圖2）。進(jìn)一步與愛媛類芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株HD 與愛媛類芽孢桿菌KCTC3748T（AY116665）的同源性為98.76%。

圖2 愛媛類芽孢桿菌HD 菌株16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of P.ehimensis HD

綜合16S rDNA 序列比對結(jié)果、生理生化特性以及形態(tài)特征，鑒定該菌株為愛媛類芽孢桿菌，命名為愛媛類芽孢桿菌HD。

2.3 抑菌物質(zhì)分析結(jié)果

2.3.1 過氧化氫的排除 細(xì)菌在發(fā)酵代謝過程中，可能產(chǎn)生過氧化氫。為了排除過氧化氫的抑菌作用，對發(fā)酵上清液進(jìn)行熱處理和與過氧化氫酶反應(yīng)后測定其抑菌活性，結(jié)果如圖3a 所示。圖3a顯示，發(fā)酵上清液經(jīng)過處理后，抑菌物質(zhì)的活性有少量損失，說明發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)中可能存在極少量的過氧化氫。

2.3.2 蛋白酶處理 愛媛類芽孢桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要有水解酶、多肽、多糖，其中酶蛋白和多肽往往能被蛋白酶分解。蛋白酶處理的結(jié)果如圖3b所示，愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對蛋白酶E 敏感，處理后完全失活；對堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和過氧化氫酶較敏感，抑菌效價(jià)回收率分別為73.15%，71.78%，92.70%和90.96%；對蛋白酶K 和木瓜蛋白酶具有較好的耐受性，活性基本沒有損失。陳文俊[18]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌蛋白對蛋白酶K 也具有很強(qiáng)的耐受性；短芽孢桿菌YNP-1[19]產(chǎn)生的抗菌蛋白對蛋白酶K 和木瓜蛋白酶也不敏感。蛋白酶處理結(jié)果初步表明，愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)或多肽。

2.3.3 硫酸銨沉淀處理 收集蛋白和多肽時(shí)一般采用硫酸銨沉淀法。愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵上清液采用不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行沉淀，對沉淀物的抑菌活性進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3c 所示。當(dāng)硫酸銨飽和度為35%時(shí)有抑菌物質(zhì)析出，當(dāng)飽和度為70%時(shí)抑菌物質(zhì)基本上全部析出，上清液對指示菌沒有抑菌性，此時(shí)沉淀物的抑菌活性達(dá)到最大；進(jìn)一步加大硫酸銨濃度，只是雜蛋白析出，對抑菌活性沒有明顯的增強(qiáng)，最終選擇70%飽和度的硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀。通過硫酸銨沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要為蛋白或多肽類物質(zhì)。

2.3.4 膜透析分離處理 膜透析處理用于脫鹽和不同分子質(zhì)量物質(zhì)的初步分離。選用不同截留分子質(zhì)量的透析袋對70%飽和度的硫酸銨沉淀物進(jìn)行透析處理，結(jié)果如表3所示。透析袋截留分子質(zhì)量為3.5 ku 時(shí)，透析后的液體沒有抑菌活性。截留分子質(zhì)量為0.5 ku 時(shí)，抑菌效價(jià)回收率為83.57%。原因可能是為了維持溶液的滲透壓平衡，緩沖液中的小分子物質(zhì)進(jìn)入透析袋內(nèi)造成抑菌物質(zhì)的稀釋，或者是部分具有抗菌活性的小分子透過了濾膜，降低了抗菌物質(zhì)的整體活性。

表3 透析前、后抑菌活性回收率Table 3 Recovery of antifungal activity before and after dialysis

2.3.5 熱穩(wěn)定性 經(jīng)過不同的溫度處理，愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵上清液的抑菌結(jié)果如圖3d 所示。在4～37 ℃條件下處理，抑菌活性無損失；在50～100 ℃處理，抑菌活性分別損失了27.54%，36.54%，46.49%和45.47%，說明抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步證明主要為小分子物質(zhì)。

圖3 愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定Fig.3 Determination of antifungal substances produced by P.ehimensis HD

由上述結(jié)果推斷，愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要為小分子多肽，分子質(zhì)量在1 ku 左右。

2.4 抑菌譜

愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵液的抑菌譜測定結(jié)果如表4所示。從表4中可以看出，發(fā)酵上清液對所測定的菌株均具有抑制作用，且對真菌的抑菌效果大于細(xì)菌。研究報(bào)道顯示，目前分離出的菌株單獨(dú)抑制細(xì)菌或真菌的較多，對兩類菌均存在抑制作用的較少。白杰等[20]分離得到的株枯草芽孢桿菌B3只能抑制大腸桿菌和沙門氏菌。王曦[17]分離得到的愛媛類芽孢桿菌NJ2008 也只能夠抑制大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等多種細(xì)菌。Zhao等[21]分離得到的芽孢桿菌BH072，能夠抑制黑曲霉、腐霉菌、灰霉菌等真菌，對細(xì)菌無抑制作用。因此，本研究篩選獲得的愛媛類芽孢桿菌HD，其所產(chǎn)抗真菌肽的抑菌譜相對較廣，具有一定的研究與應(yīng)用價(jià)值。

表4 愛媛類芽孢桿菌HD 抗菌肽的抑菌譜Table 4 Antimicrobial spectrum of antimicrobial peptides produced by P.enimensis HD

2.5 菌株生長曲線

菌株生長曲線的測定對于分析目標(biāo)菌株繁殖代謝具有重要的意義。如圖4所示，愛媛類芽孢桿菌HD 在培養(yǎng)4 h 后，吸光度值明顯上升。在4～16 h 時(shí)間段內(nèi)，增長較快，為對數(shù)生長期。在16～30 h時(shí)間段內(nèi)，變化趨勢不大，進(jìn)入穩(wěn)定期。30 h 后菌體進(jìn)入生長衰亡期。

圖4 愛媛類芽孢桿菌HD 的生長曲線Fig.4 The growth curve of P.ehimensis HD

2.6 優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基

2.6.1 碳源 培養(yǎng)基中的碳源是提供菌體生長的主要養(yǎng)料，為細(xì)胞碳骨架和代謝產(chǎn)物的形成提供原料及能量。圖5a 顯示，當(dāng)可溶性淀粉作為碳源時(shí)，發(fā)酵液抗真菌肽產(chǎn)量最高。但在培養(yǎng)基高溫滅菌的過程中，可溶性淀粉容易老化。以甘露醇、環(huán)糊精和蔗糖作為碳源時(shí)，抗真菌肽產(chǎn)量也明細(xì)高于對照組，因此，在實(shí)際應(yīng)用中可以選擇這3 個(gè)物質(zhì)作為碳源。

本研究進(jìn)一步優(yōu)化了甘露醇、環(huán)糊精和蔗糖的添加量，結(jié)果如圖5b 所示。甘露醇對抗真菌肽的合成優(yōu)于環(huán)糊精和蔗糖，當(dāng)甘露醇添加量為0.5 g/100 mL 時(shí)，抗真菌肽的抑菌活性最好，產(chǎn)量最高。隨著甘露醇添加量的提高，抑菌效價(jià)反而降低，可能是隨著甘露醇添加量的增大，逐漸形成了底物反饋抑制，從而影響抗真菌肽的代謝分泌。

2.6.2 氮源 氮源主要用于構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)以及代謝物氮素的來源。圖5c 的氮源優(yōu)化結(jié)果顯示，無機(jī)氮源尿素和硫酸銨不利于抗真菌肽的產(chǎn)生。當(dāng)玉米漿粉作為氮源時(shí)，抗真菌肽的效價(jià)最高，其次是蛋白胨、胰蛋白胨和魚蛋白胨。

進(jìn)一步優(yōu)化了上述4 種氮源的添加量，結(jié)果如圖5d 所示。當(dāng)魚蛋白胨的添加量為1 g/100 mL時(shí)，抗真菌肽的活性最高，且魚蛋白胨也是工業(yè)級的氮源，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。

圖5 愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化Fig.5 Optimization of fermentation medium of P.ehimensis HD

2.6.3 無機(jī)鹽 無機(jī)鹽是微生物生長代謝過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，無機(jī)鹽優(yōu)化的結(jié)果如圖5e所示。圖5e 結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入MgSO4對抗真菌肽合成的促進(jìn)作用最為明顯。進(jìn)一步優(yōu)化MgSO4的添加量，結(jié)果如圖5f 所示。當(dāng)MgSO4的添加量為0.3 g/100 mL 時(shí)，愛媛類芽孢桿菌HD 所產(chǎn)抗真菌肽的活性最高。

2.6.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 將上述優(yōu)化獲得的培養(yǎng)基成分進(jìn)行三因素三水平L9（33）的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，影響抗真菌肽合成的因素依次是甘露醇＞MgSO4＞魚蛋白胨，其最優(yōu)組合為A1B2C2，即甘露醇2.5 g/L，MgSO43 g/L，魚蛋白胨10 g/L。

表5 正交表試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment

2.7 優(yōu)化的發(fā)酵條件

2.7.1 菌齡 選擇合適菌齡的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基可以縮短菌體發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽的延遲期，減短發(fā)酵時(shí)間[22]。菌齡優(yōu)化的結(jié)果如圖6a 所示，當(dāng)菌齡為12，18，24 h 時(shí)，菌株生長代謝穩(wěn)定，抗真菌肽產(chǎn)量高，發(fā)酵36 h 時(shí)抗真菌肽產(chǎn)量達(dá)到峰值；當(dāng)菌齡為36 h 時(shí)，發(fā)酵代謝產(chǎn)物明顯降低。因此，愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌肽時(shí)，種子液的菌齡選擇12～24 h。

2.7.2 發(fā)酵初始pH 值 發(fā)酵液pH 值影響微生物的生長繁殖及代謝產(chǎn)物的合成，影響微生物酶的活性，也影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[23]。圖6b 為發(fā)酵初始pH 值對抗真菌肽產(chǎn)量的影響，由結(jié)果可知，在pH 5～6.5 范圍內(nèi)，抗真菌肽的活性隨著pH 值的升高而增大，當(dāng)pH 值為6.5 時(shí)，抗真菌肽活性達(dá)到最高；然而，pH 值大于6.5 時(shí)，抗真菌肽的活性開始下降。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值為6.5。

2.7.3 裝液量 研究了不同裝液量對發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽的影響，結(jié)果如圖6c 所示。在250 mL 錐形瓶中裝液量為50 mL 時(shí)，抗真菌肽的產(chǎn)量也最高。

2.7.4 接種量 菌體的接種量對菌體的生長繁殖及代謝產(chǎn)物的分泌具有重要意義。接種量對抗真菌合成的影響結(jié)果如圖6d 所示，當(dāng)接種量為2.5×108CFU/mL 時(shí)，抗真菌肽的產(chǎn)量最高。

2.7.5 發(fā)酵溫度 溫度會(huì)影響發(fā)酵過程中酶的速率和代謝產(chǎn)物的合成。溫度的影響結(jié)果見圖6e，結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，抗真菌肽的活性最高。

2.7.6 轉(zhuǎn)速 搖床轉(zhuǎn)速也是影響發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的一個(gè)因素，過高過低都會(huì)影響菌株的發(fā)酵情況。轉(zhuǎn)速的優(yōu)化結(jié)果見圖6f 所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min 時(shí)，抗真菌肽產(chǎn)量達(dá)到最高。

圖6 愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of fermentation conditions of P.ehimensis HD

2.7.7 發(fā)酵時(shí)間 研究了不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽的影響，結(jié)果如圖6g 所示。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h 時(shí)，抗真菌肽的活性最高。

2.7.8 正交試驗(yàn)結(jié)果 對愛媛類芽孢桿菌HD 合成抗真菌肽的發(fā)酵條件進(jìn)行四因素四水平L16（44）的正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，影響抗真菌肽合成的因素是接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞pH 值＞裝液量，其最優(yōu)組合為A4B1C1D4，即發(fā)酵初始pH 7.5，裝液量40 mL/250 mL，接種量1×108CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間32 h，此時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)的抗真菌肽產(chǎn)量高。

表6 正交表試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment

測定優(yōu)化前后愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵液中抗真菌肽的產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。由結(jié)果可知，優(yōu)化后抗真菌肽的產(chǎn)量具有顯著提高，發(fā)酵32 h，抗真菌肽產(chǎn)量達(dá)到最高值（效價(jià)為324.92 AU/mL），與未優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比（48 h 抗真菌肽效價(jià)最高為89.51 AU/mL），抗真菌肽效價(jià)提高了3.63 倍，發(fā)酵時(shí)間縮短了16 h。

圖7 優(yōu)化前后效價(jià)對比Fig.7 Comparison of titers of antifungal peptides before and after optimization

2.8 放大發(fā)酵驗(yàn)證

采用工業(yè)級原料，在5 L 和30 L 發(fā)酵罐上分別進(jìn)行愛媛類芽孢桿菌HD 抗真菌肽的發(fā)酵放大，結(jié)果如圖8a 和圖8b 所示。結(jié)果顯示，發(fā)酵過程中罐內(nèi)pH 值變化不大，一直維持在中性左右。發(fā)酵8 h 發(fā)酵液開始出現(xiàn)抑菌活性，此時(shí)溶氧值開始下降。8～16 h 溶氧值下降速度較快，菌體生長旺盛，此階段抗真菌肽產(chǎn)量呈現(xiàn)快速上升趨勢。20 h 后抗真菌肽產(chǎn)量達(dá)到最高值，5 和30 L 罐中的效價(jià)分別為371.10 AU/mL 和364.05 AU/mL，比搖瓶發(fā)酵分別提高了1.14 和1.12 倍。值得注意的是，在發(fā)酵罐中抗真菌肽達(dá)到最高值比搖瓶發(fā)酵時(shí)間縮短了12 h，可能是由于通氣量和轉(zhuǎn)速同時(shí)影響發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧狀態(tài)，使菌體生長較快，抗真菌肽產(chǎn)量在較短的時(shí)間內(nèi)易達(dá)到最高值。經(jīng)過發(fā)酵罐的放大驗(yàn)證，為實(shí)現(xiàn)抗真菌肽的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

圖8 發(fā)酵罐放大驗(yàn)證Fig.8 The amplification verification in fermentation tank

3 結(jié)論

抗真菌肽由于其獨(dú)特的抑菌機(jī)理進(jìn)入了人們的視線，成為了研究趨勢。本研究從河北、江蘇等地的土壤樣品中篩選獲得1 株產(chǎn)抗真菌肽菌株，經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA 分析，鑒定為愛媛類芽孢桿菌，命名為愛媛類芽孢桿菌HD。菌株發(fā)酵上清液經(jīng)過過氧化氫排除、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀、膜透析分離、熱穩(wěn)定性研究等操作，確定其抑真菌物質(zhì)為小分子多肽，分子質(zhì)量在1 ku 左右。經(jīng)過抑菌譜研究，愛媛類芽孢桿菌HD 抗真菌肽具有廣譜的抑菌特性，對多株腐敗真菌和條件致病細(xì)菌均具有良好的抑制。

本研究在LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上優(yōu)化了愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵產(chǎn)抗真菌肽的培養(yǎng)基，并對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為甘露醇2.5 g/L，魚蛋白胨10 g/L，MgSO43.0 g/L，初始pH 7.5，裝液量40 mL/250 mL，接種量1×108CFU/mL，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時(shí)間32 h。在最優(yōu)條件下，抗真菌肽產(chǎn)量最高，效價(jià)為324.92 AU/mL，比優(yōu)化前提高了3.63 倍。進(jìn)一步在5，30 L 發(fā)酵罐上進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證，其抗真菌肽效價(jià)分別為371.10 AU/mL 和364.05 AU/mL，發(fā)酵時(shí)間提前到了20 h。由此可知，愛媛類芽孢桿菌HD 發(fā)酵產(chǎn)抗真菌肽性能穩(wěn)定，發(fā)酵周期短。國內(nèi)外其它愛媛類芽孢桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化的研究還未見報(bào)道，本次菌株優(yōu)化所得發(fā)酵培養(yǎng)基為工業(yè)級原料，并且發(fā)酵周期短，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益，這為抗真菌肽的工業(yè)化應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。