蔡金秀，夏姍姍，馬佳雯，王佳圓，曹少謙，戚向陽*

（1 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江寧波 315100 2 上海海洋大學食品學院 上海 201306）

高血壓是一種常見慢性疾病，影響著31%的成人人口，與心血管疾病的發(fā)生密切相關，世衛(wèi)組織（WHO）統(tǒng)計顯示心血管疾病在全球致死率排名第一[1-2]。血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE） 在調節(jié)血壓平衡起重要作用，其作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)?？蓪⒀芫o張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，同時促進醛固酮分泌使血壓升高，并能使具有血管舒張的緩激肽失活，導致血管收縮和血壓升高[3]。ACE 抑制劑廣泛應用于高血壓的治療，然而常用的抑制劑如卡托普利、賴諾普利、依那普利等藥物[4]具有損害腎功能，引發(fā)高血鉀癥，使血管水腫等副作用，亟需尋找更安全、有效、無副作用的ACE 抑制劑。研究者發(fā)現(xiàn)從天然食品中分離出來的生物活性肽類與ACE 抑制劑有相似的作用，是良好的ACE 抑制劑替代品，這些肽通常在母體蛋白中不起作用，但母體蛋白水解后得到的部分肽段則表現(xiàn)出類激素活性[5-6]。目前已從糧油作物[7-8]、乳制品[9]、海洋生物等[10]中獲得了食源性ACE 抑制肽，雖然這些生物活性肽的功效沒有臨床藥物好，但是其安全、副作用小，易吸收，來源廣泛，且成本較低，因而成為一大研究熱點。

馬面魚為雜食性近底層魚類，其肉質細嫩、口感鮮美、營養(yǎng)價值高，深受人們喜愛，常用來加工成生魚片，最高年產量達36.0×104t[11]。在加工過程中產生的副產物通常用來制膠、制革或提取氨基酸等低附加值產品的生產。副產物中馬面魚皮富含膠原蛋白，由膠原蛋白水解而來的多肽具有降血壓、抗氧化、預防骨質疏松等多種效用。據文獻報道膠原蛋白是良好的ACE 抑制肽來源，膠原蛋白含有30%以上的疏水氨基酸及豐富的羥脯氨酸，結構中疏水氨基酸能增強其活性，羥脯氨酸可提高其在腸道消化中的穩(wěn)定性[12-14]。有學者從海洋生物副產物中提取出活性較高的ACE 抑制肽，而未見關于馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的研究。本研究以馬面魚皮膠原蛋白為原料制備較高活性ACE 抑制肽，并研究其結構及ACE 抑制活性的穩(wěn)定性，為馬面魚皮的深度開發(fā)及高值化利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚皮收集于寧波路林市場，清洗后瀝干，剪成2 cm×2 cm 小塊，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?；膠原蛋白，由馬面魚皮酸法提取所得；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶，北京Solarbio 公司；蛋白酶P“天野”6G、蛋白酶N“天野”、蛋白酶A“天野”2G、蛋白酶M“天野”G，日本Amano 公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸 （N-hippury1-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管緊張素轉化酶（ACE），美國Sigma 公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝膠，美國GE 公司；乙腈（HPLC 級），美國Sigma 公司；其它試劑均為國藥分析。

1.2 儀器與設備

1900PC 型紫外－可見分光光度計，上海析譜儀器有限公司；UPLC-MS，沃特世（Waters）科技有限公司；高效液相色譜儀，沃特世（Waters）科技有限公司；HH-4 數顯控溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；ALPHA2-4 冷凍干燥儀，CHRIST；冷凍離心機5804R，德國Eppendorf 公司；Labscale 小型切向流超濾，密理博中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜法測定血管緊張素轉化酶抑制劑的活性 參照朱國萍等[15]的方法略微調整，樣品處理：往樣品管和空白管加入5 μL ACE 溶液，分別往樣品管和空白管加入10 μL 樣品液和緩沖液，37 ℃溫育5 min 后加入50 μL 6 mmol/L HHL 溶液，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，加入85 μL 1 mol/L HCL 中止反應，用0.22 μm 有機濾膜過濾后上樣至高效液相色譜進行分析，測定溶液中馬尿酸峰的面積。色譜條件：色譜柱：SunfireTM C18（150×4.6 I.D，5 μm）色譜柱。流動相A：乙腈，B：含0.05%（體積分數）TFA 和0.1%（體積分數）三乙胺的超純水；等度洗脫（A/B，25/75，V/V）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：228 nm；進樣量：20 μL。

式中：A——空白對照組中馬尿酸的峰面積，mAU·min；B——添加馬面魚皮膠原活性肽組中馬尿酸的峰面積，mAU·min。

1.3.2 水解度的測定 水解度的測定參考趙新淮等[16]的方法。標準曲線制作方法如下：將Gly 干燥，配制成20 mg/mL 溶液，再稀釋成含量為2～20 μg/mL 的溶液。各取2 mL 稀釋液（空白管加蒸餾水），加入1 mL 茚三酮顯色劑，混勻，15 min 沸水浴后，冷水中冷卻。每管分別加入5 mL 40%乙醇混勻，放置15 min，以空白管調零并于570 nm 測吸光值A。

按標準曲線的測定步驟測定酶解液中-NH2含量（mmol/L），用蒸餾水代替酶解液做空白試驗，用標準曲線計算酶解蛋白液中-NH2含量（mmol/L）。

計算公式：

式中：h——水解后每克蛋白質被裂解的肽鍵的物質的量，mmol；htot——每克原料蛋白質的肽鍵的物質的量，mmol。

1.3.3 不同酶對膠原蛋白水解的影響 在各酶最適溫度和pH 值下，用木瓜蛋白酶（55 ℃，pH 7）、胰蛋白酶（40 ℃，pH 8）、堿性蛋白酶（40 ℃，pH 10）、菠蘿蛋白酶（55 ℃，pH 7）、中性蛋白酶（40℃，pH 7）、酸性蛋白酶（50 ℃，pH 2.2）、胃蛋白酶（50 ℃，pH 2.2）、蛋白酶P “天野”6G （50 ℃，pH 7）、蛋白酶N“天野”（40 ℃，pH 8）、蛋白酶A“天野”2G（50 ℃，pH 8）、蛋白酶M“天野”G（50 ℃，pH 4.5），在底物質量分數為1%，加酶量為2 000 U/g條件下，酶解4 h，以ACE 抑制率為主要指標，水解度（DH）為參考篩選出最佳用酶。

1.3.4 單因素試驗 以ACE 酶活性抑制率和水解度為指標，考察水解時間（1，2，3，4，5 h），底物質量分數（1%，2%，3%，4%，5%），酶用量（1 200，2 400，3 600 U/g），對馬面魚皮膠原蛋白酶解的影響。

1.3.5 復合酶解 根據單因素結果選取最佳條件進行組合酶解試驗，酶解條件如表1。

表1 復合酶酶解條件Table 1 The hydrolysis conditions of composite enzyme

1.3.6 超濾分離 將酶解液過0.45 μm 濾膜后，依次通過截留分子質量為10，8，5 ku 的超濾膜，得到分子質量分別為＜5 ku，5～8 ku，8～10 ku，＞10 ku 4 個級分，將各級分冷凍干燥，測定其ACE 抑制率。

1.3.7 凝膠柱層析分離 用Sephadex G-15（2 cm×50 cm I.D.） 凝膠柱對超濾所得的抗氧化活性較好的級分進一步分離純化。洗脫為超純水，流速0.3 mL/min，上樣質量濃度20 mg/mL，上樣量5 mL，檢測波長220 nm，收集各洗脫峰，凍干后測定各組分ACE 抑制率。

1.3.8 高活性馬面魚皮膠原蛋白肽的HPLC 分析 色譜柱：Symmetry C18 柱 （4.6 mm×150 mm I.D.，5 μm）；流動相：超純水（A），乙腈（B）；洗脫條件：0～15 min，0%～5%，15～30 min，5%～20%，30～40 min 20%～40%，40～41 min，40%～0%；流 速0.5 mL/min。檢測波長220 nm；進樣量10 μL。

1.3.9 高活性馬面魚皮膠原蛋白肽的UPLC-MS分析 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 colum （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。洗脫條件：0.1%（體積分數）甲酸水溶液（A）；乙腈（B）；0～40 min，0～40%，40～42 min，40%～0；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。質譜條件：電噴霧電離源，正離子模式，掃描分子質量100～2 000 u，毛細管電壓3 000 V，錐孔電壓40 V，噴霧35 psi，脫氣溫度350 ℃，離子源溫度120 ℃，N2流速900 L/h。

1.3.10 溫度對馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 取一定量的樣品用去離子水配制成2 mg/mL 的溶液，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下保溫2 h，快速冷卻至室溫，測定ACE 抑制率并計算ACE 抑制活性保持率。

1.3.11 pH 值對馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 取一定量的樣品分別用pH 值為2，4，6，8，10 的緩沖液配制成2 mg/mL 的溶液，在40℃條件下保溫2 h，用冷水浸泡使快速恢復至室溫，測定其ACE 抑制率并計算ACE 抑制活性保持率。

1.3.12 體外模擬胃腸道消化對馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 參考Zhu 等[17]的方法，體外模擬胃液消化：樣品用pH 2.0 的0.1 mol/L KCl-HCl 緩沖液配制成5 mg/mL 的溶液，按酶與底物質量比為1∶100 加入胃蛋白酶，振蕩混勻后在37 ℃下恒溫水浴3 h，沸水浴滅酶5 min，用NaOH 溶液調節(jié)pH 值到8.0，取一半消化液離心（10 000 r/min，25 min），取上清，測定ACE 抑制率并計算ACE 抑制活性保持率。

體外模擬腸液消化：剩余一半消化液按酶與底物質量比為1∶100 加入胰蛋白酶，振蕩混勻后在37 ℃下恒溫水浴4 h，滅酶，離心，取上清，測定ACE 抑制率并計算ACE 抑制活性保持率。

1.4 數據處理與分析

使用GraphPad Prism 軟件繪圖，SPSS Statistics 軟件進行Duncan（D）方差分析，顯著性水平為P<0.05，數據以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 不同酶對馬面魚皮膠原蛋白的酶解效果

由圖1可知，馬面魚皮膠原蛋白經不同酶水解后，蛋白酶N“天野”2G 酶解產物對ACE 的抑制率最高胰蛋白酶次之，但由蛋白酶N“天野”2G所制備的酶解產物水解度顯著性低于胰蛋白酶。酶解產物水解度差異較大但ACE 抑制能力相近，可能是由于其氨基酸組成和序列不同，蛋白酶具有專一性其只能作用于特定的位點。研究發(fā)現(xiàn)復合酶解可得到結構組成更豐富的肽鏈，可能能夠提高生物活性肽活性，本研究選擇胰蛋白酶和蛋白酶N“天野”2G 進行復合酶解試驗，優(yōu)化制備工藝。

圖1 不同酶對水解度和ACE 抑制率的影響Fig.1 Effect of different enzyme on the degree of hydrolysis and angiotensin-converting enzyme inhibitory activity

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 底物質量分數、加酶量、酶解時間對蛋白酶N“Amano”2G 酶解的影響 由圖2可知，用蛋白酶N“天野”2G 水解馬面魚皮膠原蛋白所得產物水解度隨底物質量分數增大和時間的延長而增大后趨于平緩，在加酶量1 200～2 400 U/g 無顯著性差異，3 600 U/g 時顯著性增大；其對ACE 抑制率隨底物質量分數的變化趨勢與水解度相近，在4%達最大值；隨加酶量的增加顯著性下降；由圖2b 可知在水解初期ACE 抑制率無顯著性變化，3 h 時顯著性增大，4 h 后呈下降趨勢。綜合水解度和ACE 抑制率考慮，蛋白酶N“天野”2G最佳水解條件為：底物質量分數4%，加酶量1 200 U/g，酶解時間4 h。

圖2 底物質量分數、加酶量、酶解時間對蛋白酶N“天野”2G 酶解的影響Fig.2 Effect of substrate concentration，amount and time on Protease N “Amano” 2G enzymatic hydrolysis

2.2.1.2 底物質量分數、加酶量、酶解時間對胰蛋白酶酶解的影響 由圖3可知，用胰蛋白酶水解馬面魚皮膠原蛋白所得產物水解度和ACE 抑制率受底物質量分數影響變化趨勢一致，在4%時ACE 抑制活性最強；加酶量增大水解度和ACE 抑制率增大，但當大于2 400 U/g 后ACE 抑制率顯著性下降；在水解初期1～3 h 內水解度無顯著性差異，后有上升趨勢，其對ACE 抑制率隨時間延長其變化趨勢較水解度明顯，先上升后下降，在4 h 時達最大值。綜上，胰蛋白酶的最佳水解條件為：加酶量2 400 U/g，底物質量分數4%，酶解時間4 h。

圖3 底物質量分數、加酶量、酶解時間對typsin 酶解的影響Fig.3 Effect of substrate concentration，amount and time on typsin enzymatic hydrolysis

通過以上試驗發(fā)現(xiàn)，當加酶量固定時，底物質量分數增加水解度及ACE 抑制率都顯著性上升，但達到一定濃度后無顯著性變化，可能是由于底物過多，與酶接觸的幾率大大減小，使酶解效果降低[18]。加酶量持續(xù)增大時水解度顯著提高，但當水解度過大時，ACE 抑制率反而下降，酶解過程是一個復雜的動態(tài)過程，酶在不斷的尋找底物中特異的酶切位點，可能是由于前期產生的ACE 抑制肽被水解成低活性的肽段或者氨基酸失去了對ACE抑制活性[19]。在水解初期底物質量分數較高，酶的作用有限水解度與ACE 抑制率無明顯變化，中期底物與酶充分接觸，更多的肽被釋放出來，水解度與ACE 抑制率顯著性上升，當水解進行到后期，水解度持續(xù)升高但ACE 抑制率明顯下降，可能是由于此時原料已被完全反應，酶繼續(xù)水解小肽[20]。

2.2.2 復合酶水解工藝的確定 為了得到高活性ACE 抑制肽，基于單因素的基礎上進行了雙酶混合酶解及二步酶解試驗。由圖4可知，試驗組3 的ACE 抑制率最高，即在蛋白酶N“天野”用量1 200 U/g，胰蛋白酶用量為2 400 U/g，底物質量分數4%，溫度40 ℃，pH 8 的條件下，蛋白酶N“天野”和胰蛋白酶混合酶解4 h。

圖4 復合酶酶解對酶解度和ACE 抑制率的影響Fig.4 Effect of using mixed enzymes hydrolysis on degree of hydrolysis and angiotensin-converting enzyme inhibitory activity

2.3 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的分離純化

2.3.1 超濾分離 由表2可知低分子質量肽段ACE 抑制率高于大分子質量肽段，a 級分得率最高，ACE 抑制率也最高，說明有效的ACE 活性成分集中在小于5 ku 分子質量物質中。Natesh 等[21]的研究表明由2～12 個氨基酸組成的小分子質量肽段比大分子質量肽段更容易與ACE 活性位點結合，表現(xiàn)出更強的ACE 抑制活性。

表2 超濾分離組分及其抗氧化活性Table 2 Ultrafiltration separation components and their antioxidant activity

2.3.2 凝膠柱層析分離 用Sephadex G-15 葡聚糖凝膠柱將超濾所得級分中抗氧化活性較強的a級分進一步分離，其洗脫曲線如圖5a 所示。經凝膠過濾分離后，得到a1、a2、a33 個級分，a1出峰最早說明其分子質量較大，a3出峰最晚說明分子質量較小。由圖5b 可知，分離所得各組分表現(xiàn)出不同的ACE 抑制活性，a1、a2、a3對ACE 的抑制率均顯著高于分離前，分別為46.52%，43.9%，43.33%，3 個級分ACE 抑制率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 凝膠過濾分離色譜及各組分抗氧化活性Fig.5 Chromatogram of gel filtration column and the antioxidant activity of each component

2.4 馬面魚皮ACE 抑制肽活性穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH 值對馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，a1、a2、a3在不同pH 值下的ACE 抑制活性保持率趨勢基本一致，在pH 2～8 時ACE 抑制活性略有下降，但保留了90%左右的活性。pH 值增大至10 時，其ACE 抑制活性保持率顯著性降低為原來的80%左右，可能是強堿條件下，肽易發(fā)生消旋反應，使肽鏈結構改變從而活性降低[20]。總體來看a1、a2比a3較為穩(wěn)定，在酸性和堿性條件下能保持較高活性。

圖6 pH 值對ACE 抑制肽a1、a2、a3 活性穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of pH on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

2.4.2 溫度對馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 如圖7所示，溫度的升高對馬面魚皮膠原ACE 抑制肽活性有一定程度的影響，膠原蛋白活性肽a1、a2、a3的ACE 抑制活性隨溫度升高逐漸降低，但其活性均保留有90%以上，a1活性保持率始終較a2、a2高。楊鋒等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)醋蛋多肽ACE 抑制活性對熱不穩(wěn)定，在100 ℃時活性僅保持了60%左右。也有研究表明ACE 抑制肽在高溫下活性升高，可能是高溫使肽鏈分解生成新的肽段與之產生協(xié)同效應，從而提高ACE 抑制活性[23]；而陳秋鑾等[18]制備的牡丹籽ACE 抑制肽活性幾乎不受溫度的影響，有較強的熱穩(wěn)定性。多肽活性的改變可能與高溫改變肽鏈C 端序列有關，C 端序列是影響ACE 結合的重要因素[24]。相對而言，馬面魚皮膠原ACE 抑制肽熱穩(wěn)定性較高，能夠在加工熱處理中保持較高的活性，是一種良好的ACE 抑制劑。

圖7 溫度對ACE 抑制肽a1、a2、a3 活性穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

2.4.3 體外模擬胃腸消化對馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 由圖10可知，馬面魚皮膠原ACE 抑制肽經胃消化道模擬消化后活性均有下降，a1、a2較a3穩(wěn)定活性均保留為原來的90%左右，而a3經胃模擬消化后僅保留有82.26%的活性。經腸模擬消化后a1、a2、a3ACE 抑制活性保留率分別為79.76%，73.32%，71.43%，由此可見a1較為穩(wěn)定。消化后ACE 抑制活性降低，可能是由于消化過程中胰蛋白酶和胃蛋白酶繼續(xù)對肽鏈水解，生成低活性或無活性的肽段或氨基酸。a1較a2、a3穩(wěn)定可能是因為其胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切位點少，或者是因其分子質量較大經水解后生成了具有ACE 抑制活性的短肽。

圖8 體外模擬胃腸消化對ACE 抑制肽a1、a2、a3活性穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of gastrointestinal digestion on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

圖10 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽主成分質譜圖Fig.10 MS spectra of major ingredient of ACE inhibitory peptides

2.5 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的分析

綜合pH 值、溫度、體外模擬胃腸道消化試驗發(fā)現(xiàn)，a1穩(wěn)定性及活性均較好，其HPLC 及UPLCMS 分析表明（見圖9），級分a1純度較高，分析其不同的碎片離子片段，發(fā)現(xiàn)m/z 為329.2 的離子信號最強，其中m/z 為272.2 的碎片離子由m/z 為329.2 的碎片離子裂解形成，而m/z 為173.1 的碎片離子是由m/z 為272.2 的碎片裂解產生的。329.2的離子碎片與272.2 的離子碎片的m/z 差值為57，由此可推斷多肽末端有一個甘氨酸，而272.2的離子碎片與173.1 的碎片的m/z 差值為99.1，可推斷出為一個纈氨酸，而m/z 為173.1 正好是一個丙氨酸分子質量，因此可推斷出此物質可能為一個三肽，其結構可能為Gly-Val-Ala 或Ala-Val-Gly。大量研究表明活性肽的C 末端為疏水性氨基酸可增強ACE 抑制活性，Yu 等[25]對21 中大西洋鮭魚活性肽進行構效學研究發(fā)現(xiàn)，肽鏈中疏水氨基酸與芳香族氨基酸的含量與ACE 抑制活性呈正相關。Jocksan 等[26-27]認為當C 端倒數第2 個氨基酸為脂肪族氨基酸（Val、Ala、Pro 等）時ACE 活性較強。所制備的ACE 抑制肽中Ala 和Val 為疏水氨基酸，Val 位于C 末端倒數第2 位，綜上所述馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽結構基本符合目前研究報道的構效學特征，從而呈現(xiàn)出較高的ACE 抑制活性。

圖9 高效液相分離色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram

3 結論

以馬面魚皮為原料，在制備膠原蛋白的基礎上，通過酶解法制備有ACE 抑制活性的生物活性多肽。結果表明，利用雙酶混合法可制備出活性較高的ACE 抑制肽，當蛋白酶N“天野”2G 用量1 200 U/g，胰蛋白酶用量2 400 U/g，底物質量分數為4%在溫度40 ℃，pH 8 的條件下混合酶解4 h時所制備的酶解產物ACE 抑制率最高。酶解產物經超濾分離后，得到的4 個級分中，分子質量小于5 ku 的級分得率最高，其ACE 抑制率也最高，說明ACE 抑制活性物質分子質量分布主要在5 ku以下。對a 級分進行凝膠過濾分離得到3 個級分（a1、a2、a3），它們對ACE 抑制率比分離前提高了兩倍左右，其中a1級分的ACE 抑制率最高，為46.52%?？疾觳煌琾H 值、溫度及體外模擬胃腸消化對a1、a2、a3活性的影響，發(fā)現(xiàn)所制備的ACE 抑制肽在酸性和弱堿性條件下較為穩(wěn)定，隨溫度的升高活性略有下降，但仍能保留90%左右的活性，說明溫度對其活性影響不大；經體外模擬胃液消化后，其活性降低了10%左右，模擬腸液消化后活性繼續(xù)下降，其中a3下降最為明顯，僅保持了71.4%的活性，而級分a1最為穩(wěn)定，HPLC 及UPLC-MS 分析表明，所制備的a1純度較高，其氨基酸序列可能為Gly-Val-Gla 或Gla-Val-Gly。