即食食品中阪崎克羅諾桿菌的分離鑒定及分子分型

馬炳存，陳學(xué)強(qiáng)，王 燦，劉 陽，李增婷，李琰歆，崔學(xué)文

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 成都 611731）

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）是腸桿菌科內(nèi)一類兼性厭氧、周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢、短桿狀革蘭氏陰性菌，2008年被定義為新屬，并被分為16 個(gè)生物群（biogroups）[1]。1980年以前，因該菌產(chǎn)黃色素的特性，故一直被稱為“產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌（yellow-pigmented Enterobacter cloacae）”。1980年Farmer 等[2]通過核酸雜交、生化試驗(yàn)、色素產(chǎn)生、藥敏特性分析，將該菌從陰溝腸桿菌中分離開來，更名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）。2008年，Iversen 等[3-5]通過熒光標(biāo)記-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性指紋圖譜（f-AFLP）、DNA 雜交、16s rDNA 全序列分析方法重新對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)分類研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一菌種的許多菌株的鑒定結(jié)果差異較大，建議將阪崎腸桿菌定義為一個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），該屬包括7 個(gè)種，3 個(gè)亞種。

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是克羅諾桿菌屬中重要的條件致病菌，主要感染早產(chǎn)兒、出生體重偏低等身體狀況較差的新生兒及嬰幼兒，引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎、菌血癥等疾病，并可能引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[6-7]。有研究表明，該菌可感染老人及免疫力低下人群[8]。嬰兒配方奶粉被認(rèn)為是阪崎克羅諾桿菌的主要傳播媒介。許多文獻(xiàn)[9-12]報(bào)道在奶酪、肉制品、谷物制品、香腸、冰激凌、蔬菜等即食食品中均可分離到阪崎克羅諾桿菌。目前，食品中克羅諾桿菌的最初來源還未確定，推測(cè)植物性材料是重要來源。

關(guān)于阪崎克羅諾桿菌的致病機(jī)制目前了解較少，不同菌株的毒力差異明顯，采用合適的分型方法對(duì)食品中污染的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行溯源分析，闡明其在食品中流行規(guī)律，對(duì)控制食品中阪崎克羅諾桿菌污染意義重大。多位點(diǎn)序列分型（Multi Locus Sequence Typing，MLST）技術(shù)簡(jiǎn)單快速，分辨率高，數(shù)據(jù)結(jié)果易于實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比對(duì)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分子分型研究[13-14]。截至2018年5月，克羅諾桿菌MLST 數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/cronobacter/）已收錄來源為食品樣品、臨床樣品、環(huán)境樣品等分離菌株1 875 株，包括602 種ST 型，為克羅諾桿菌MLST 序列比對(duì)、進(jìn)化分析提供充足的數(shù)據(jù)支撐。

本文對(duì)即食食品中阪崎克羅諾桿菌分離菌株進(jìn)行鑒定及分子分型，研究不同樣品中阪崎克羅諾桿菌的親緣關(guān)系，為尋找食品中阪崎克羅諾桿菌可能的污染來源、流行規(guī)律及其防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品為市售預(yù)包裝即食食品，所有樣品按照《食品安全抽樣檢驗(yàn)管理辦法》的要求進(jìn)行抽樣和保存。

α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)，德國Bruker 公司；Bacteria Test Standard（BTS）校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，德國Bruker 公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（貨號(hào)：21341），法國梅里埃公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（貨號(hào)：9164），日本Takara 公司；阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，美國典型培養(yǎng)物保存中心（ATCC）；陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）。

1.2 儀器與設(shè)備

Autoflex speed 基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 （配有BioTyperTM2.0 比對(duì)軟件及flexAnalysis 3.4 質(zhì)譜分析軟件），德國Bruker 公司；VITEK 2 Compact System 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃公司；梯度PCR 儀，美國Eppendorf 公司；Universal Hood II 型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；5804R 型Eppendorf 冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)菌株分離 所有樣品均在無菌條件下進(jìn)行處理，按照GB 4789.40-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》[15]標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，對(duì)即食食品樣品中克羅諾桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，分離的菌株用胰酪大豆胨瓊脂（TSA）純化2次后，保存菌種備用，試驗(yàn)菌株編號(hào)及樣品來源見表1。

1.3.2 基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）數(shù)據(jù)采集及分析 將試驗(yàn)菌株劃線接種于TSA 平板，36 ℃，培養(yǎng)16～18 h，挑取單菌落涂布在MALDI-TOF-MS 靶板上，滴加1 μL 70%（V/V）的甲酸，室溫自然干燥后，加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)溶液，自然晾干備用。同樣方法在靶板上制備Bacteria Test Standard （BTS） 標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)靶位。采用FlexControlTM3.0 軟件中細(xì)菌鑒定標(biāo)配方法MBT_FC 參數(shù)獲取BTS 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖，對(duì)機(jī)器進(jìn)行校準(zhǔn)。使用校準(zhǔn)后的方法參數(shù)獲取樣品質(zhì)譜圖，每個(gè)樣品疊加測(cè)定5 次。將獲取的樣品質(zhì)譜導(dǎo)入BioTyperTM2.0菌種鑒定軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)分析，獲得鑒定結(jié)果。利用flexAnalysis 3.4 軟件分析試驗(yàn)菌株質(zhì)譜圖，分析各試驗(yàn)菌株質(zhì)譜離子峰差異。

1.3.3 試驗(yàn)菌株生化鑒定 采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 Compact System）配套的革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡，按照說明書操作，對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.3.4 16 s rDNA 序列分析 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，按照說明書操作提取試驗(yàn)菌株的基因組DNA。16s rDNA 序列擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[16]報(bào)道方法進(jìn)行。通過NCBI 網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）BLAST 程序獲取試驗(yàn)菌株16s rDNA的同源序列。利用MEGA4.0 軟件采用鄰接法算法（Neighbor-Joining），以1 000 循環(huán)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)，構(gòu)建進(jìn)化樹。同時(shí)，采用最大簡(jiǎn)約算法（maximum-parsimony）和最大似然算法（maximum-likelihood）構(gòu)建進(jìn)化樹，驗(yàn)證鄰接法進(jìn)化樹的準(zhǔn)確性。

1.3.5 多位點(diǎn)序列分型分析 采用PubMLST 數(shù)據(jù) 庫（https：//pubmlst.org/cronobacter/info/protocol.shtml） 提供的克羅諾桿菌屬多位點(diǎn)序列分型引物和擴(kuò)增程序，對(duì)分離菌株的7 個(gè)等位基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps） 進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。將獲得的等位基因序列輸入PubMLST 數(shù)據(jù)庫分析待測(cè)菌株序列型（Sequence type，ST）。將分離菌株的7 個(gè)等位基因序列串聯(lián)后利用MEGA4.0軟件構(gòu)建分離菌株進(jìn)化樹，同時(shí)將分離菌株串聯(lián)序列與PubMLST 數(shù)據(jù)庫中322 株（截至2018年5月）中國分離的阪崎克羅諾桿菌構(gòu)建進(jìn)化樹，分析本研究分離的10 株阪崎克羅諾桿菌與中國分離菌株之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株分離鑒定結(jié)果

從即食食品樣品中共分離164 株細(xì)菌，經(jīng)MALDI-TOF-MS 快速篩選鑒定，其中10 株為阪崎克羅諾桿菌。阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29544）和陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC（B）45301）分別作為標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性參考菌株，試驗(yàn)菌株鑒定結(jié)果及分離來源見表1。

表1 試驗(yàn)菌株鑒定結(jié)果及分離來源Table 1 The resource and identification results of the isolates

2.2 MALDI-TOF-MS 分析結(jié)果

所有試驗(yàn)菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS 鑒定分值均大于2.0（可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種水平），且鑒定結(jié)果與VITEK 2 生化鑒定及16s rDNA 鑒定結(jié)果一致（表1）。利用flexAnalysis 3.4軟件分析試驗(yàn)菌株質(zhì)譜圖（圖1），所有阪崎克羅諾桿菌在5 740 m/z 附近均檢測(cè)到離子峰，陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC（B） 45301）在5 740 m/z 附近未檢測(cè)到離子峰，表明5 740 m/z 附近的蛋白離子峰為阪崎克羅諾桿菌鑒定的特征蛋白。分析即食食品樣品來源的阪崎克羅諾桿菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29544）的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)所有野生菌株在7 159 m/z 附近均檢測(cè)到離子峰，但ATCC 29544在7 159 m/z 附近未檢測(cè)到離子峰，表明食品樣品中的阪崎克羅諾桿菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544 菌型差異較大。比較B16、B27、B74、X23 野生菌株質(zhì)譜圖，在5 380，6 255 和7 159 m/z 附近的離子峰形差異較大，這些蛋白峰信息可作為進(jìn)一步菌株分型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 阪崎克羅諾桿菌分離菌株MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOF-MS mass spectrum of the C.sakazakii isolates

2.3 多位點(diǎn)序列分型分析結(jié)果

分離菌株的7 個(gè)等位基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps）序列經(jīng)PubMLST 數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)10 株阪崎克羅諾桿菌分離菌株分為4個(gè)ST 型，分別為ST21、ST73、ST60、ST7（表2）。AD鈣營養(yǎng)米粉中分離的阪崎克羅諾桿菌菌株型復(fù)雜，3 株分離菌株X67、X68、B74 分別為3 種不同的ST 型ST7、ST60、ST21。ST73 型阪崎克羅諾桿菌僅在蠔風(fēng)味調(diào)味料中檢出，在所有食品樣品中分離率最高的為ST21 型阪崎克羅諾桿菌（n=6）。將7 個(gè)等位基因序列串聯(lián)后利用MEGA4.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，可見分離菌株分為4 個(gè)獨(dú)立分支，分析結(jié)果與MLST 分型結(jié)果一致 （圖2）。PubMLST數(shù)據(jù)庫中國分離阪崎克羅諾桿菌聚類分析結(jié)果表明，國內(nèi)阪崎克羅諾桿菌型式復(fù)雜，多種型式阪崎克羅諾桿菌流行，以ST21 型為主，臨床樣品、食品、嬰幼兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌分離較多。本研究分離的10 株阪崎克羅諾桿菌中，有5 株（X21、B14、B15、B16、X68） 與PubMLST 數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的臨床及食品分離株親緣關(guān)系較近，有3 株（B74、X67、X23）與香料及植物性食物中分離株親緣關(guān)系較近，有1 株（X81）與嬰兒配方奶粉中分離株親緣關(guān)系較近（圖3）。

圖2 阪崎克羅諾桿菌分離菌株MLST 序列進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of the MLST sequences for the isolates

圖3 PubMLST 數(shù)據(jù)庫中國阪崎克羅諾桿菌分離菌株來源及分布Fig.3 The resources and genotyping of the C.sakazakii of China in PubMLST database

表2 阪崎克羅諾桿菌分離菌株MLST 分型結(jié)果Table 2 MLST analysis results of C.sakazakii isolates

3 結(jié)論與討論

阪崎克羅諾桿菌污染配方乳粉引起新生兒及嬰幼兒感染事件時(shí)有發(fā)生[17-20]，我國GB 10765-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》[21]中規(guī)定嬰兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌限量標(biāo)準(zhǔn)為“不得檢出/100 g”。除感染新生兒及嬰幼兒外，阪崎克羅諾桿菌對(duì)免疫低下人群依然存在較高的感染風(fēng)險(xiǎn)[8]。該菌被國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)列入“對(duì)特定人群產(chǎn)生嚴(yán)重的生命危害、或產(chǎn)生慢性后遺癥”的微生物，與肉毒梭菌的A、B 型毒素、單核細(xì)胞增生李斯特菌等具有同等的危害[22]。即食食品受眾人群廣泛，涵蓋從幼兒到老人各個(gè)年齡段人群，且食用方式簡(jiǎn)單，一般沒有再加工過程，微生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)較高，因此其安全性備受關(guān)注[23-26]。李遠(yuǎn)宏等[27]在2016年對(duì)100 份谷類食品進(jìn)行克羅諾桿菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)谷類食品中克羅諾桿菌的分離率為21%，分離菌株中阪崎克羅諾桿菌占81%。本研究從即食食品樣品中分離到164 株疑似克羅諾桿菌，通過MALDI-TOF-MS 快速篩選，VITEK 2和16s rDNA 序列分析進(jìn)一步鑒定，其中10 株為阪崎克羅諾桿菌，主要分離來源為芝麻醬、米粉等谷物類食品。

MALDI-TOF-MS 技術(shù)通過獲取核糖體蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖后與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜圖比對(duì)，完成待測(cè)菌的鑒定。與其它鑒定技術(shù)相比，MALDITOF-MS 具有簡(jiǎn)單、快速、低成本、高通量的優(yōu)勢(shì)，分析待測(cè)菌質(zhì)譜圖，可獲得菌株特異性標(biāo)志蛋白，有利于深入挖掘菌株特征信息。本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為5 740 m/z 的蛋白質(zhì)為阪崎克羅諾桿菌的特征蛋白，質(zhì)荷比為5 380，6 255 和7 159 m/z 的蛋白質(zhì)僅在野生分離株中存在，可作為阪崎克羅諾桿菌分型、致病性、耐受性等特征分析的靶蛋白，該結(jié)果與趙紅陽等[28]的研究結(jié)果吻合。

PubMLST 數(shù)據(jù)庫中豐富的數(shù)據(jù)信息為克羅諾桿菌分型分析提供了基礎(chǔ)，本研究采用MLST技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行分型，同時(shí)與PubMLST 數(shù)據(jù)庫中322 株阪崎克羅諾桿菌中國分離株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。發(fā)現(xiàn)分離的5 株阪崎克羅諾桿菌與PubMLST 數(shù)據(jù)庫中臨床分離株緊密相關(guān)，提示即食食品樣品中阪崎克羅諾桿菌有潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)。已有研究結(jié)果表明[14，29]，ST4、ST12、ST13、ST14型阪崎克羅諾桿菌能夠?qū)е聣乃佬孕∧c結(jié)腸炎、敗血癥、腦膜炎，本研究分離菌株主要為ST21 型，未分離到以上4 種ST 型的阪崎克羅諾桿菌。阪崎克羅諾桿菌中國分離株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示我國阪崎克羅諾桿菌主要分離來源是臨床和食品樣品、嬰兒配方食品，且與本研究ST21 型分離菌株親緣關(guān)系較近，說明ST21 型阪崎克羅諾桿菌是我國的主要流行菌株。

本研究通過對(duì)即食食品樣品中阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分離、鑒定、分型，評(píng)估阪崎克羅諾桿菌在即食食品中潛在的傳播和致病風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合PubMLST 數(shù)據(jù)庫中中國分離株進(jìn)化分析結(jié)果，分析了阪崎克羅諾桿菌在我國的主要流行菌株。本研究為分析食品中阪崎克羅諾桿菌可能的污染來源、流行規(guī)律及防控措施提供依據(jù)。通過了解食品及加工環(huán)境中克羅諾桿菌的污染來源，建立有效的預(yù)防控制措施，有助于降低克羅諾桿菌在即食食品中的傳播風(fēng)險(xiǎn)。