李廣偉,賈淇舒,令狐克琴,王 琦,于 杰,張卓睿*
(1.山東濰坊科技學(xué)院經(jīng)濟管理學(xué)院,山東濰坊 261000;2.北華大學(xué)林學(xué)院,吉林吉林 132013)
果醋是以水果或果品加工下腳料為主要原料,經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的一類酸性調(diào)味品或飲品。果醋中的有機酸以醋酸為主,此外,還有草酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、蘋果酸等[1]。除了含有豐富的有機酸,果醋中還含有多種礦物元素,如鉀、鈣、鋅、鈉以及花青素、黃酮、酚酸等活性成分[1],具有降血脂[2]、調(diào)節(jié)人體酸堿平衡[1]、抗氧化、防癌變[3]等保健功效,在功能保健品市場擁有較大的開發(fā)潛力,市場前景廣闊。
藍莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(VacciniumLinn.)多年生植物[4],果實中富含維生素A(vitamin A,VA)[5-6]、維生素E(vitamin E,VE)[5-7]、花青素[8]、酚酸[7-9]和超氧化物歧化酶[10-11]等多種活性成分,尤其是花青素含量極其豐富[12]。花青素是一種類黃酮類色素[13],酸性環(huán)境下相對比較穩(wěn)定,具有抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、消炎[16]和保護視力[17]等功效,現(xiàn)已成為藥學(xué)及營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。酸櫻桃(Cerasus valgaris)是薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)植物[18],其果實酸味突出,營養(yǎng)豐富,花青素[19-20]、褪黑激素[21]、槲皮素[18]等活性成分含量較高。
目前已有利用藍莓釀制果醋的相關(guān)報道。榮智興[22]對固定化發(fā)酵條件下的藍莓果醋加工工藝進行了研究,確定了最適工藝條件。陳曦等[23]采用液態(tài)發(fā)酵法,結(jié)合響應(yīng)面分析軟件,優(yōu)化了藍莓果醋的發(fā)酵工藝條件。樸銀子等[24]總結(jié)了藍莓果醋的制備工藝,并綜合分析了其品質(zhì)。已有關(guān)于櫻桃果醋的研究報道,馮志彬等[25]通過對比試驗分析,確定了櫻桃果醋的生產(chǎn)工藝及其飲料的優(yōu)化配比。楊小姣等[26]以櫻桃酒糟為原料,利用多菌種發(fā)酵制得了醋香濃郁的櫻桃果醋。劉寶祥等[27]研究了櫻桃果醋的深層液態(tài)發(fā)酵工藝,并通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測了果醋的有機酸組成。藍莓、酸櫻桃鮮果皆屬于不能耐長時間儲運的小漿果,適于通過食品加工延長貯藏時間,而將二者混合發(fā)酵制成藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋,不僅克服了采用一種原料釀制果醋色、香、味單一的缺陷,還能充分發(fā)揮二者花青素含量均較高的營養(yǎng)特色,起到風(fēng)味互補和營養(yǎng)強化的作用。
因此,本研究以總酸含量為評價指標(biāo),采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗考察了滬釀1.01(巴氏醋桿菌)(Acetobacter pasteurianus)接種量、酒精度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響,確定藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋最佳的醋酸發(fā)酵工藝條件,并對復(fù)合果醋的品質(zhì)指標(biāo)與抗氧化性進行研究。以期豐富果醋的產(chǎn)品種類,增加兩種水果的應(yīng)用途徑,提高食用附加值,為深加工利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
1.1.1 原料與菌株
酸櫻桃:吉林省蛟河試驗林場,預(yù)冷后放入冰箱內(nèi)冷凍貯藏;藍莓:吉林省臨江藍莓基地,預(yù)冷后放入冰箱內(nèi)冷凍貯藏;安琪果酒酵母:湖北安琪酵母股份有限公司;滬釀1.01(巴氏醋桿菌)(Acetobacter pasteurianus):上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。
1.1.2 試劑
果膠酶(100 000 U/g):北京索萊寶科技有限公司;蔗糖(一級):市售;亞硫酸氫鈉(分析純):天津市福晨化學(xué)試劑廠;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(分析純):美國Sigma公司;維生素C(Vitamine C,VC)(分析純):天津市北辰方正試劑廠;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵(均為分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、瓊脂、酵母膏(均為生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限公司;碳酸鈣、氫氧化鈉(分析純):天津市福晨化學(xué)試劑廠。
1.1.3 培養(yǎng)基
醋酸菌斜面培養(yǎng)基:10%葡萄糖、2%碳酸鈣、2%瓊脂、1%酵母膏和100 mL水。0.1 MPa、121 ℃滅菌30 min。滅菌后的試管擺成斜面,待培養(yǎng)基凝固,放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,無雜菌即可。
BS-1E型恒溫振蕩培養(yǎng)箱:金壇市華城開元實驗儀器廠;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市科技儀器有限公司;LDZX-40 Ⅱ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;FA2004A電子天平:上海精天電子儀器有限公司;精密酒精計(精度0.1):河間市振巖儀器儀表廠;雷磁PHSJ-5精密酸度計:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;JYL-C16T榨汁機:九陽股份有限公司;WYT-G型手持糖度計:成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。
1.3.1 藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋加工工藝流程及操作要點
藍莓、酸櫻桃的預(yù)處理:去除藍莓果和酸櫻桃鮮果中的雜質(zhì)及有病蟲害和霉?fàn)€的壞果,將挑選出來的果實沖洗干凈,瀝去水分。
混合、破碎:將藍莓與去核后的酸櫻桃按質(zhì)量比1∶1混合,充分破碎、攪拌,使兩種果漿能均勻的混合在一起。
酶解、榨汁過濾、成分調(diào)整:向經(jīng)過破碎處理的混合果漿中加入0.09 g/L的果膠酶,40~45 ℃酶解3~4 h,然后用榨汁機榨汁,所得混合果汁用200目濾布過濾,再向過濾后的混合汁中添加23%蔗糖,同時加入0.03%的亞硫酸氫鈉,抑制起始發(fā)酵時的有害微生物,保證酵母菌的正常生長繁殖。
殺菌:混合果汁經(jīng)過成分調(diào)整后,于70~75 ℃保溫30 min,進行殺菌處理[28]。
酵母活化:將安琪果酒酵母按1∶10(g∶mL)的料液比加入到2%蔗糖溶液中,在35 ℃條件下活化30 min[29]。
酒精發(fā)酵:將酵母活化液按0.06%接種量接種到殺菌后的藍莓和酸櫻桃復(fù)合汁中,攪拌均勻后,在22 ℃條件下發(fā)酵13 d,每隔24 h檢測一次發(fā)酵液的糖度,當(dāng)糖度降至6%以下時,停止發(fā)酵,此時復(fù)合果酒酒精度達到(13.4±0.11)%vol。
醋酸菌活化:在斜面培養(yǎng)基上接入醋酸菌,于30 ℃培養(yǎng)72 h。利用接種環(huán)從斜面長出的醋酸菌中取1環(huán)接入100 mL、滅菌后的5%vol藍莓-酸櫻桃復(fù)合果酒中,于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)30 h[27],連續(xù)擴培2次,至瓶內(nèi)有菌膜產(chǎn)生,培養(yǎng)基變渾濁,達到醋酸菌對數(shù)生長期即可。
醋酸發(fā)酵:將發(fā)酵好的藍莓-酸櫻桃復(fù)合果酒在68 ℃保持30 min,以除去酒液中的酵母菌。待溫度降至室溫后,將酒精度調(diào)整至9%vol,并按10%的接種量接入活化后的醋酸菌,用醫(yī)用紗布封口并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱發(fā)酵,溫度控制在30 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min[27],待發(fā)酵至第8天總酸不再上升時停止發(fā)酵,此時復(fù)合果醋的總酸含量可達(5.01±0.17)g/100 mL。
過濾、澄清:用2%殼聚糖溶液澄清復(fù)合果醋液。將澄清后的復(fù)合果醋液密封放在避光陰涼的地方陳釀1個月。用200目濾布過濾,得到藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋成品[28]。
1.3.2 藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化
(1)單因素試驗[30-31]
以總酸含量、花青素含量和感官評分為評定指標(biāo),分別考察醋酸菌接種量(4%、6%、8%、10%、12%),酒精度(5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol),發(fā)酵溫度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃)和發(fā)酵時間(3 d、5 d、7 d、9 d、11 d)對藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋品質(zhì)的影響。
(2)響應(yīng)面試驗
在單因素的基礎(chǔ)上,固定醋酸菌接種量為10%,以酒精度(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)為試驗因素,以總酸含量(Y)為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計,優(yōu)化藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋醋酸發(fā)酵工藝條件,Box-Behnken試驗因素與水平見表1。
表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.3 分析檢測
總酸的測定:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的電位滴定法[32];酒精度的測定:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法[32];花青素含量的測定:采用pH示差法[33]。
1.3.4 感官評價
參照GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中感官評分要求[34],結(jié)合藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的特點設(shè)定感官評分標(biāo)準(zhǔn),見表2。
表2 藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of blueberry and sour cherry compound fruit vinegar
依據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn),請8位專業(yè)人員從色澤、氣味、口感和狀態(tài)四個方面對復(fù)合果醋進行感官評價,滿分為100分,取平均值作為最終結(jié)果。
1.3.5 抗氧化性試驗
(1)DPPH自由基清除率的測定[35]
將藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋分別稀釋0、1、3、5、7倍,各取1 mL,加入2 mL的0.2 mol/L DPPH,混勻后于20 ℃條件下反應(yīng)30 min,然后在波長517 nm處測其吸光度值,以稀釋相同倍數(shù)的市售蘋果醋和VC溶液(100 mg/L)為陽性對照,計算DPPH自由基清除率,其計算公式如下:
(2)還原力的測定[36]
將藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋分別稀釋0(原液)、1、3、5、7倍,各取1 mL于比色管中,依次加入0.2 mol/L磷酸緩沖溶液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,于50 ℃水浴中保溫20 min后迅速冷卻,然后加入10%三氯乙酸溶液2.5mL,以4000r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入蒸餾水2.5 mL、0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,振蕩搖勻,靜置10 min后在波長700 nm處測其吸光度值(OD700nm值)。以稀釋相同倍數(shù)的市售蘋果醋和VC溶液(100 mg/L)為陽性對照。采用普魯士藍法測定還原性時,吸光度值越大,表示待測物的還原力越強。
2.1.1 醋酸菌接種量的確定
接種量對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響見表3。由表3可知,隨著醋酸菌接種量在4~12%范圍內(nèi)的增加,復(fù)合果醋的總酸含量逐漸增大。當(dāng)接種量在4~10%范圍內(nèi)的增加,花青素含量逐漸增加,并當(dāng)接種量為10%時,達到最高值,為(97.83±0.49)mg/100 mL,繼續(xù)增加接種量,花青素含量下降。其原因可能是隨著復(fù)合果醋酸度的增加,其所含花青素的含量逐漸增大,但由于醋酸菌的過度繁殖消耗了體系中的花青素,導(dǎo)致含量下降。當(dāng)接種量在4~10%范圍內(nèi)的增加,感官評分逐漸增加;當(dāng)接種量為10%時,感官評分值最高,為(71.00±0.42)分;繼續(xù)增加接種量,感官評分下降。因此,確定適宜的醋酸菌接種量為10%。
表3 醋酸菌接種量對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響Table 3 Effect of acetic acid bacteria inoculum on the quality of compound fruit vinegar
2.1.2 酒精度的確定
酒精度對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響見表4。由表4可知,當(dāng)酒精度在5%vol~9%vol范圍內(nèi)時,總酸含量逐漸增加;當(dāng)酒精度為9%vol時,總酸達到最大值,為(4.35±0.19)g/100 mL;隨著酒精度繼續(xù)增加,總酸含量下降。當(dāng)酒精度在5~13%vol范圍內(nèi)時,花青素含量逐漸增加。酒精度在5~9%vol范圍內(nèi)時,感官評分逐漸增加;當(dāng)酒精度為9%vol時,感官評分達到最大值,為(76.00±0.39)分;當(dāng)酒精度>9%vol,感官評分有所下降。因此,確定適宜的酒精度為9%vol。
表4 酒精度對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響Table 4 Effect of alcohol content on the quality of compound fruit vinegar
2.1.3 發(fā)酵溫度的確定
發(fā)酵溫度對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響見表5。由表5可知,隨著發(fā)酵溫度在26~30 ℃范圍內(nèi)的增加,總酸含量逐漸升高;當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時,總酸含量達到最大值(4.51±0.21)g/100 mL;繼續(xù)增加發(fā)酵溫度,總酸含量下降,其原因是由于醋酸菌提前進入老化階段,產(chǎn)酸能力下降。當(dāng)發(fā)酵溫度在26~34 ℃范圍內(nèi)的增加,花青素含量逐漸下降。隨著發(fā)酵溫度在26~30 ℃范圍內(nèi)的增加,感官評分逐漸增加;當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃、30 ℃時,感官評分值最高,為(78.00±0.46)分、(78.00±0.47)分,之后再繼續(xù)升高發(fā)酵溫度,感官評分下降,其原因是由于高溫發(fā)酵的藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋顏色偏暗,口感較差,感官品質(zhì)下降。因此,確定適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃。
表5 發(fā)酵溫度對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of compound fruit vinegar
2.1.4 發(fā)酵時間的確定
發(fā)酵時間對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響見表6。由表6可知,隨著發(fā)酵時間在3~9 d范圍內(nèi)的增加,總酸含量逐漸增加;當(dāng)發(fā)酵時間為9 d時,總酸含量達到最高值,為(4.84±0.21)g/100 mL;繼續(xù)增加發(fā)酵時間,總酸含量逐漸下降。當(dāng)發(fā)酵時間為3~11 d時,花青素含量逐漸下降,其原因是由于花青素不穩(wěn)定易分解,發(fā)酵時間越長,其分解越多,所得藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋中的花青素含量就越少。當(dāng)發(fā)酵時間為3~7 d時,感官評分逐漸增加;當(dāng)發(fā)酵時間為7 d時,感官評分最高,為(79.00±0.41)分;繼續(xù)增加發(fā)酵時間,感官評分逐漸下降,其原因主要是由于發(fā)酵時間越長,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的果香味越淡,發(fā)酵11 d的藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋甚至還有些微苦味,風(fēng)味變差。因此,確定適宜的發(fā)酵時間為7 d。
表6 發(fā)酵時間對復(fù)合果醋品質(zhì)的影響Table 6 Effect of fermentation time on the quality of compound fruit vinegar
2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以總酸含量為響應(yīng)值(Y),以酒精度(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)為自變量,進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化,Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表7,方差分析見表8。
表7 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments
表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model
利用Design-Expert 8.0.6軟件對表7的試驗結(jié)果進行回歸擬合,得到藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的總酸含量(Y)對應(yīng)酒精度(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)的二次多項回歸方程為:
由表8可知,回歸模型極顯著(P<0.000 1),失擬項不顯著(P=0.755 0>0.05),說明所建立的二次回歸方程可以代替真實點對試驗結(jié)果進行分析,誤差較小[37];回歸模型的決定系數(shù)R2=0.993 4,調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.984 9,表明回歸方程可信度高,擬合度好[38]。綜上所述,響應(yīng)面試驗分析所得回歸方程可用于優(yōu)化藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的發(fā)酵工藝條件。由F值可知,影響藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋總酸含量的主次因素順序為酒精度(A)>發(fā)酵溫度(B)>發(fā)酵時間(C)。由P值可知,一次項A、B,交互項AC、二次項A2、B2、C2對總酸含量影響極顯著(P<0.01),一次項C、交互項AB、BC對總酸含量對總酸含量影響顯著(P<0.05)。
2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析
酒精度(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)因素交互作用對總酸含量影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖1。
由圖1可知,各交互作用的試驗點范圍內(nèi)都出現(xiàn)了極大值,說明三個工藝參數(shù)所選水平范圍合理,能反映出對復(fù)合果酒總酸含量的影響趨勢。酒精度(A)與發(fā)酵時間(C)交互作用的響應(yīng)曲面陡峭,對復(fù)合果醋的總酸含量具有極顯著的影響(P<0.01);發(fā)酵溫度(B)與酒精度(A)交互作用的響應(yīng)曲面較陡峭,對復(fù)合果醋的總酸含量具有顯著的影響(P<0.05);發(fā)酵溫度(B)與發(fā)酵時間(C)交互作用響應(yīng)曲面較陡峭,對復(fù)合果醋的總酸含量具有顯著的影響(P<0.05),說明這兩種交互作用對總酸的影響程度要小于前者。這與方差分析的結(jié)果一致。
圖1 各因素交互作用對總酸含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on total acid contents
通過響應(yīng)面試驗得出藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為酒精度8.64%vol,發(fā)酵溫度29.73 ℃,發(fā)酵時間7.24d,該條件下,總酸含量理論值為(4.99±0.00)g/100 mL。為方便實際操作,將優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝條件修正為酒精度9%vol,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間8 d。按照修正后的醋酸發(fā)酵工藝條件進行3次平行驗證試驗,測得藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的總酸含量平均實際值為(5.01±0.17)g/100 mL,與理論值相差不大,說明響應(yīng)面所確定條件可作為優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件。
藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋感官評分為(87.00±0.42)分,成品為深紅色,具有明顯的果香和醋香,酸味柔和,口感清爽,澄清透明,無懸浮物和渾濁現(xiàn)象。產(chǎn)品總酸含量為(5.01±0.17)g/100 mL,花青素含量為(102.26±0.89)mg/100 mL。
2.4.1 清除DPPH自由基能力
復(fù)合果醋對DPPH自由基清除率的影響見表9。由表9可知,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋原液的DPPH·清除率可達到(94.1±0.22)%,高于質(zhì)量濃度為100 mg/L VC溶液(81.2±0.35)%,遠高于市售蘋果醋(30.1±0.17)%。隨著稀釋倍數(shù)的增加,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋對DPPH·的清除率迅速降低,當(dāng)稀釋7倍時,對DPPH清除率降至(25.3±0.15)%,略低于VC溶液,但仍高于市售蘋果醋。
表9 復(fù)合果醋對DPPH自由基清除率的影響Table 9 Effect of compound fruit vinegar on scavenging rate of DPPH radical
2.4.2 還原力
復(fù)合果醋對還原力的影響見表10。由表10可知,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋原液的OD700nm值為(2.21±0.27),略高于質(zhì)量濃度為100 mg/L的VC溶液(OD700nm值為(2.13±0.24)),說明藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋原液的還原能力要強于VC溶液。隨著復(fù)合果醋稀釋倍數(shù)的增加,吸光度值迅速降低,當(dāng)稀釋7倍時,其OD700nm值降至(0.47±0.13)。同一稀釋倍數(shù)下,VC溶液的OD700nm值為(0.87±0.29),說明此時VC溶液的還原力要強于藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋,而市售蘋果醋的OD700nm值遠低于復(fù)合果醋和VC溶液,說明其還原性能是三者中最低的。
表10 復(fù)合果醋對還原力的影響Table 10 Effect of compound fruit vinegar on reducing power
本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗,確定藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為:醋酸菌接種量10%,發(fā)酵前的酒精度9%vol,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間8 d。此優(yōu)化條件下,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋的總酸為(5.01±0.17)g/100 mL,花青素含量為(102.26±0.89)mg/100 mL,感官評分為(87±0.42),成品呈深紅色,具有明顯的果香和醋香,無懸浮物和渾濁現(xiàn)象。抗氧化實驗結(jié)果表明,藍莓-酸櫻桃復(fù)合果醋具有較強的清除DPPH·能力(94.1±0.22)%和還原能力(2.21±0.27)(OD700nm值),具有一定的抗氧化性。