王宏杰， 孫楚韻， 蘇如意， 田傳玉， 徐江玲，張俊楠， 許夢(mèng)潔， 郭 威

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

由大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines，Xag)引起的大豆斑疹病(bacterial pustule，BP)是大豆上重要的檢疫性細(xì)菌病害[1].該病原菌可侵染大豆葉片、葉柄、莖和豆莢，整個(gè)生育期均可引起大豆病害，導(dǎo)致葉片早枯脫落、籽粒皺縮，從而降低大豆經(jīng)濟(jì)效益[2-3].

借助Ⅱ型分泌系統(tǒng)，植物病原黃單胞菌將多種細(xì)胞壁水解酶如內(nèi)切甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶等分泌至胞外，破壞細(xì)胞壁以便于病原菌在植物上寄生和致病[4-6].內(nèi)切甘露聚糖酶負(fù)責(zé)隨機(jī)切割β-1,4-糖苷鍵，在病原菌與寄主植物互作過(guò)程中起重要作用[7].相較于其他細(xì)胞壁水解酶，有關(guān)植物病原黃單胞菌內(nèi)切甘露聚糖酶的研究鮮有報(bào)道.2003年，Dow等[8]研究證實(shí)野油菜黃單胞菌(X.campestrispv.campestris，Xcc)8004菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶編碼基因manA(XC2458)突變，導(dǎo)致菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性喪失，在寄主上的致病性、生物膜形成能力相對(duì)于野生型均顯著減弱.2010年，Hsiao等[9]研究再次證實(shí)，XccXc17菌株的manA基因突變，導(dǎo)致菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性完全喪失.已有研究表明，Xag具有較高的內(nèi)切甘露聚糖酶活性[10-11]，但其編碼基因仍未知.在Xag中，manA是唯一注釋編碼內(nèi)切甘露聚糖酶的基因，但其是否負(fù)責(zé)Xag的內(nèi)切甘露聚糖酶合成及其他生物學(xué)特性，并不知曉.

本研究證實(shí)ManA涉及負(fù)調(diào)控engXCA和egl2基因的表達(dá)，其突變?cè)鰪?qiáng)菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性和胞外纖維素酶活性、促使菌株形成膠狀物；但不影響菌株的其他生物學(xué)特性，如生物膜形成、胞外多糖合成及蛋白酶和淀粉酶活性.

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究所用菌株和質(zhì)粒列于表1.XagZJ15菌株及其衍生菌株在28 ℃NB(3 g/L牛肉膏，10 g/L蔗糖，5 g/L多聚蛋白胨，1 g/L酵母提取物)中培養(yǎng).培養(yǎng)菌株所用抗生素濃度：羧芐青霉素(Cb)100 μg/mL，卡那霉素(Km)50 μg/mL，壯觀霉素(Sp)100 μg/mL[11].

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒

1.2 缺失突變株構(gòu)建及功能互補(bǔ)

本研究所用引物列于表2.基于同源重組原理，借助pKMS1自殺載體[12]，以Xag野生型菌株ZJ15為出發(fā)菌株，構(gòu)建內(nèi)切甘露聚糖酶manA基因的缺失突變株，命名為ΔmanA.同時(shí)，以pHM1為互補(bǔ)載體[13]，構(gòu)建ΔmanA的功能互補(bǔ)菌株，命名為CΔmanA.

1.3 RNA提取及RT-PCR

將新鮮的各供試菌株培養(yǎng)至OD600≈2.0，富集菌體，洗滌2次；使用RNA抽提試劑(TRIzol)制備各菌株的總RNA，去除基因組DNA；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)檢測(cè)各待測(cè)菌株中目標(biāo)基因的mRNA水平(見(jiàn)表2).

表2 本研究所用引物

1.4 胞外酶活性分析

參照文獻(xiàn)[10]方法，檢測(cè)分別以刺槐豆膠、羧甲基纖維素、可溶性淀粉或脫脂牛奶為底物培養(yǎng)基上的各菌株水解能力，分析各菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶及蛋白酶的活性.

1.5 胞外多糖測(cè)定

將新鮮的各供試菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，滅菌水洗滌2次后調(diào)至OD600≈1.0.吸取2 μL各待測(cè)菌液分別接種至含2%葡萄糖或蔗糖的NY固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，觀察結(jié)果并拍照記錄[14].

1.6 生物膜測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]將等量新鮮的各供試菌株接種至生物膜測(cè)定培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d后，觀察結(jié)果并拍照記錄.

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)切甘露聚糖酶ManA在植物病原黃單胞菌中高度保守

內(nèi)切甘露聚糖酶(mannanendo-1,4-β-mannosidase，ManA)屬于第5家族糖基化水解酶，在植物病原細(xì)菌中分布較廣.根據(jù)生物信息學(xué)分析顯示，XagZJ15，12-2和8ra等菌株中的manA基因序列完全一致，具有100%同源性.此外，XagZJ15菌株的manA基因與柑橘潰瘍病菌(X.axonopodispv.citri，Xac)306菌株的manA基因(XAC1796)、辣椒斑點(diǎn)病菌(X.campestrispv.vesicatoria，Xcv)85-10菌株的manA基因(XCV1826)、水稻條斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola，Xoc)BLS256菌株的manA基因(XOC2180)和野油菜黃單胞菌(X.campestrispv.campestris，Xcc)8004菌株的manA基因(XC2458)分別具有99.9%，96.3%，89.2%和81.4%的同源性.這些結(jié)果說(shuō)明，內(nèi)切甘露聚糖酶ManA在植物病原黃單胞菌中高度保守.

圖1 大豆斑疹病菌內(nèi)切甘露聚糖酶基因manA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 大豆斑疹病菌內(nèi)切甘露聚糖酶基因manA的缺失突變

為了便于Xag內(nèi)切甘露聚糖酶編碼基因manA的功能研究，以ZJ15菌株為模板，分別擴(kuò)增毗鄰manA基因的上游片段(644 bp)和下游片段(317 bp)，將其順式融合并構(gòu)入敲除載體pKMS1中，經(jīng)2次同源片段重組交換獲得雙交換子(見(jiàn)圖2a).然后，采用2輪巢式PCR對(duì)所獲取的雙交換子進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，2輪PCR擴(kuò)增所獲取的DNA片段相對(duì)于野生型均缺失987 bp(見(jiàn)圖2b).結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)獲得了正確的manA基因缺失突變體，命名為ΔmanA，可用于后續(xù)功能研究.

a:manA基因缺失突變的構(gòu)建示意圖；b:manA基因缺失突變株的PCR驗(yàn)證

2.3 ManA負(fù)調(diào)控大豆斑疹病菌的胞外纖維素酶活性和內(nèi)切甘露聚糖酶活性

為了探究ManA是否參與Xag的胞外纖維素酶活性和內(nèi)切甘露聚糖酶活性，采用平板法定性檢測(cè)ΔmanA、CΔmanA和野生型菌株的纖維素酶活性和內(nèi)切甘露聚糖酶活性.結(jié)果顯示：在含0.5%羧甲基纖維素或含0.2%刺槐豆膠的NA平板上，ΔmanA菌株相較于野生型均形成明顯較大的水解圈；功能互補(bǔ)使ΔmanA菌株的上述2種胞外酶活性均恢復(fù)至野生型水平(見(jiàn)圖3a～3b).這些結(jié)果表明，ManA負(fù)調(diào)控Xag的胞外纖維素酶活性和內(nèi)切甘露聚糖酶活性.

先前研究證明，engXCA和egl2基因共同控制Xag的胞外纖維素酶合成[16]，本研究證實(shí),engXCA和egl2基因也共同決定Xag的內(nèi)切甘露聚糖酶活性(見(jiàn)圖3d～3f).為了探究ManA調(diào)控Xag內(nèi)切甘露聚糖酶活性和胞外纖維素酶活性的方式，借助熒光定量PCR手段分析同時(shí)編碼內(nèi)切甘露聚糖酶和胞外纖維素酶的engXCA和egl2基因的表達(dá)模式.結(jié)果顯示，engXCA和egl2基因在ΔmanA菌株中的表達(dá)水平相對(duì)于在野生型中均顯著增加(P<0.01)(見(jiàn)圖3c).這些結(jié)果表明，ManA負(fù)調(diào)控Xag的engXCA和egl2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá).

a:ΔmanA菌株的胞外纖維素酶活性測(cè)定；b:ΔmanA菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性測(cè)定；c:egl2和engXCA基因表達(dá)分析；d:Δegl2菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性測(cè)定；e:ΔengXCA菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性測(cè)定；f:ΔengXCAΔegl2菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性測(cè)定

2.4 ManA不參與大豆斑疹病菌的蛋白酶活性和淀粉酶活性

為了探究ManA是否參與Xag的蛋白酶活性和淀粉酶活性，采用平板法定性檢測(cè)ΔmanA，CΔmanA和野生型菌株的蛋白酶活性和淀粉酶活性.結(jié)果顯示：在含1%脫脂牛奶或含0.2%可溶性淀粉的NA平板上，3個(gè)菌株均產(chǎn)生大小相近的水解圈，說(shuō)明3個(gè)菌株水解牛奶或可溶性淀粉的能力基本一致(見(jiàn)圖4).這些結(jié)果表明，ManA不參與Xag的蛋白酶活性和淀粉酶活性.

a:ΔmanA菌株的蛋白酶活性測(cè)定；b:ΔmanA菌株的淀粉酶活性測(cè)定

2.5 內(nèi)切甘露聚糖酶基因manA突變促使菌株形成膠狀物

為了探究ManA是否參與Xag的生物膜形成，分別檢測(cè)ΔmanA，CΔmanA和野生型菌株的生物膜形成能力.結(jié)果顯示：在試管側(cè)壁上，ΔmanA菌株能形成明顯的細(xì)菌細(xì)胞聚集圈，其形成能力與野生型基本一致(見(jiàn)圖5a).然而，實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)了一種新的表型，即離心后在ΔmanA菌株細(xì)胞沉淀的頂部積累了一層透明可見(jiàn)的膠狀物質(zhì)，這種現(xiàn)象在CΔmanA和野生型菌株中并未觀察到(見(jiàn)圖5b).這些結(jié)果表明，manA突變不影響菌株的生物膜形成能力，但能促使菌株形成膠狀物質(zhì).為了探究ManA是否參與Xag的胞外多糖合成，分別檢測(cè)ΔmanA，CΔmanA和野生型菌株的胞外多糖合成能力.結(jié)果顯示：3個(gè)菌株產(chǎn)生胞外多糖的能力基本一致(見(jiàn)圖5c)，表明ManA不參與Xag的胞外多糖合成.

a:ΔmanA菌株的生物膜測(cè)定；b:ΔmanA菌株的膠狀物形成；c:ΔmanA菌株的胞外多糖合成分析

3 討 論

在分類(lèi)上，ManA屬于第5家族糖基化水解酶，它在植物病原細(xì)菌中分布較廣[9].在已完成基因組測(cè)序的植物病原黃單胞菌中，manA是全基因組中唯一注釋編碼內(nèi)切甘露聚糖酶的基因，在不同菌株間約有81%～100%的堿基同源性(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明manA基因在植物病原黃單胞菌中具有高度保守性.然而由目前研究可知，ManA在不同植物病原黃單胞菌中的生物學(xué)功能差異顯著，揭示其具有菌株特異性.

有趣的是，與Xcc菌株的ManA功能相悖[8-9]，Xag的內(nèi)切甘露聚糖酶基因manA缺失突變，顯著增強(qiáng)菌株的內(nèi)切甘露聚糖酶活性和胞外纖維素酶活性(見(jiàn)圖3a～3b).先前研究報(bào)道，EngXCA和Egl2是Xag的2個(gè)胞外纖維素酶[16]；此外，engXCA和egl2基因在Xoo，Xag基因組中注釋編碼內(nèi)切葡聚糖苷酶(endoglucanase)或內(nèi)切葡聚糖苷酶前體(endoglucanase precursor)[17].基于此，本研究進(jìn)一步證實(shí)：Egl2和EngXCA也共同控制Xag的內(nèi)切甘露聚糖酶活性(見(jiàn)圖3d～3f)；ManA涉及負(fù)調(diào)控egl2和engXCA基因的表達(dá)(見(jiàn)圖3c).由此推斷，manA基因突變導(dǎo)致egl2和engXCA基因的表達(dá)水平上調(diào)，從而增強(qiáng)菌株的胞外纖維素酶和內(nèi)切甘露聚糖酶活性.這些研究表明，植物病原黃單胞菌內(nèi)切甘露聚糖酶的編碼基因不盡相同，因菌株而異.

ManAXcc能驅(qū)散Xcc菌株的生物膜形成[8]；然而manAXag基因突變并不影響Xag的生物膜形成和胞外多糖合成(見(jiàn)圖5a和圖5c)，但卻能在離心管底部產(chǎn)生一種由于較少或輕量細(xì)胞聚集所形成的膠狀物現(xiàn)象(見(jiàn)圖5b)，這種現(xiàn)象屬于一種較弱的生物膜形成[18].這表明，ManAXag驅(qū)散菌株生物膜形成能力相較于ManAXcc較弱.此外研究發(fā)現(xiàn)，manA基因突變顯著削弱病原菌在寄主大豆上的致病性(數(shù)據(jù)未顯示)，ManA是如何在Xag與寄主植物親和互作中發(fā)揮毒性作用、是否還參與Xag的其他生物學(xué)特性，有待進(jìn)一步研究.