蛋白質(zhì)磷酸化對肌動球蛋白解離及其乙?；降挠绊?/h1>
2022-04-14 01:44:58張業(yè)軍張德權(quán)侯成立擺玉薔任馳王旭李欣
中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年7期
張業(yè)軍，張德權(quán)，侯成立，擺玉薔，任馳，王旭，李欣
蛋白質(zhì)磷酸化對肌動球蛋白解離及其乙?；降挠绊?/p>
張業(yè)軍，張德權(quán)，侯成立，擺玉薔，任馳，王旭，李欣
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193
【】研究肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化對其乙?；?、肌動球蛋白解離及ATP酶活性的影響，為通過調(diào)控磷酸化水平改善肉品嫩度提供理論依據(jù)。以羊背最長肌為材料制備肌肉勻漿液，采用堿性磷酸酶抑制劑（抑制去磷酸化）和蛋白激酶抑制劑（抑制磷酸化）調(diào)控其磷酸化水平，在4℃分別孵育0、0.5、4、12、24、48和72 h，利用SDS-PAGE電泳和熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡、ATP酶活性測定試劑盒分析蛋白質(zhì)磷酸化水平、乙?；?、肌動球蛋白解離程度和ATP酶活性隨孵育時(shí)間的變化；利用分子動力學(xué)模擬分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化對肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的影響。堿性磷酸酶抑制劑處理組中肌球蛋白重鏈磷酸化水平在孵育4、12和72 h時(shí)顯著高于對照組和蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），肌動蛋白磷酸化水平在孵育4、12、24、48和72 h時(shí)顯著高于對照組和蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)被堿性磷酸酶抑制劑所抑制。堿性磷酸酶抑制劑處理組中肌動蛋白乙?；皆诜跤?、12、24、48和72 h時(shí)顯著低于蛋白激酶抑制組（＜0.05），肌球蛋白重鏈乙?；匠薀o規(guī)律變化，表明肌動蛋白磷酸化抑制其乙?；?，肌球蛋白重鏈磷酸化對其乙?；绊憻o明顯規(guī)律。分子動力學(xué)結(jié)果表明，肌球蛋白重鏈第2、3、54位絲氨酸等位點(diǎn)和肌動蛋白第54位絲氨酸、第55位酪氨酸等位點(diǎn)磷酸化增加了肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的總能量、勢能和動能，降低了鍵能，導(dǎo)致肌動球蛋白結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。在0—72 h孵育過程中，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白解離程度始終高于蛋白激酶抑制處理組，ATP酶活性低于蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化促進(jìn)肌動球蛋白解離。肌球蛋白重鏈磷酸化直接促進(jìn)肌動球蛋白解離，肌動蛋白磷酸化通過抑制其自身乙?；龠M(jìn)肌動球蛋白解離。
磷酸化；乙?；?；肌球蛋白重鏈；肌動蛋白；解離
0 引言
【研究意義】肉的嫩度是影響消費(fèi)者滿意度和購買意愿的主要品質(zhì)之一[1-2]。肌動球蛋白解離促進(jìn)宰后肉的嫩化，與肉的嫩度呈正相關(guān)[3-4]。因此，肌動球蛋白解離一直是肉品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】肌球蛋白和肌動蛋白分別是粗肌絲和細(xì)肌絲的主要成分，動物屠宰后，二者結(jié)合形成肌動球蛋白。已有研究表明，肌動球蛋白解離受內(nèi)源酶、鈣離子濃度、ATP及其水解產(chǎn)物等內(nèi)因和溫度、磷酸鹽及壓力等外因影響[5-7]。除細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素外，Perrie等[8]研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合還受蛋白質(zhì)磷酸化影響。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化改變肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)，使肌球蛋白球狀頭部遠(yuǎn)離粗肌絲，調(diào)節(jié)細(xì)肌絲與粗肌絲的相互作用[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉蛋白質(zhì)磷酸化可能參與調(diào)控肉品品質(zhì)，肉品領(lǐng)域?qū)Υ碎_展了大量研究[12-14]。肌鈣蛋白T和肌球蛋白輕鏈磷酸化修飾削弱了細(xì)肌絲與粗肌絲的相互作用，表明蛋白質(zhì)磷酸化可能參與調(diào)控宰后肌肉僵直進(jìn)程[15-16]。蛋白質(zhì)乙?；橇硪环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)乙?；{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、酶活性和蛋白相互作用等。研究發(fā)現(xiàn)與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì)是在肌肉向肉轉(zhuǎn)化過程中鑒定出的最大的乙?；鞍踪|(zhì)簇之一，特別是鑒定到大量肌球蛋白重鏈和肌動蛋白乙?；稽c(diǎn)，表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的乙?；赡苡绊懠忧虻鞍捉怆x[17-18]。生命科學(xué)領(lǐng)域研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化和乙酰化之間存在交互作用，如人體抑癌基因蛋白的磷酸化增強(qiáng)其自身與乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用，促進(jìn)其乙?；痆19]；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a乙?；龠M(jìn)其與激酶的結(jié)合，有利于其被磷酸化等[20]。【本研究切入點(diǎn)】肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是肌動球蛋白的重要組成部分，二者磷酸化如何調(diào)控肌動球蛋白解離，與其乙?；绞欠翊嬖诮换プ饔?，目前尚不清楚。因此，本研究通過體外孵育試驗(yàn)分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平與其乙酰化水平以及肌動球蛋白解離之間的關(guān)系，初步探索肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化修飾對其乙酰化以及肌動球蛋白解離的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平的改變對肌動球蛋白解離、肌動球蛋白ATPase活性及其乙酰化水平的影響，揭示肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化和乙?；餐{(diào)節(jié)肌動球蛋白解離的潛在機(jī)制，為肉品嫩度調(diào)控新技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
試驗(yàn)于2020年10—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。
1.1 樣品采集
選取12只體型相近、飼養(yǎng)管理方式相同的7月齡小尾寒羊和蒙古羊雜交公羊，按照隨機(jī)順序屠宰并依據(jù)屠宰順序平均分為3組，每組4只羊，平均胴體重為（24.15±2.48）kg。宰后30 min內(nèi)取下背最長肌，剔除筋膜及結(jié)締組織后，將背最長肌切碎后裝于凍存管液氮速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2 試劑
免疫沉淀試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Pro-Q和Ruby染色液購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；二硫代蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、過硫酸銨、ATP酶活性測定試劑盒、肌動蛋白抗體購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；堿性磷酸酶抑制劑（貨號：4906837001，主要成分：D-甘露糖醇、二水合鉬酸鈉、聚乙二醇、(T-4)-釩酸鈉、1-乙烯基-2-吡咯烷酮均聚物）和蛋白酶抑制劑（貨號：04693116001，主要成分：二氫乙二胺四乙酸二鈉、4-(2-氨基無乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽）購自瑞士羅氏公司（Roche Group）；肌球蛋白重鏈抗體購自安迪生物科技（上海）有限公司；乙?；嚢彼峥贵w購自杭州景杰生物科技股份有限公司；蛋白激酶抑制劑Go 6983（貨號：HY-13689，主要成分：C26H26N4O3）、H-89（貨號：HY-15979A，主要成分：C20H20BrN3O2S）、Bisindolylmaleimide I（貨號：HY-13867，主要成分：C25H24N4O2）購自美國MedChemExpress（MCE）公司；電泳預(yù)制膠購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；硝酸纖維素膜購自頗爾（中國）有限公司；碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、乙腈、乙酸、乙醇、二甲基亞砜等為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.3 儀器與設(shè)備
Spectra Max 190全波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；ML204/2電子天平、Mettler-Toledo pH計(jì)，上海梅特勒-托利多有限公司；Ultra Turrax Disperser S25分散器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；高效冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；恒溫震蕩金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Discovery Studio 2019分子模擬軟件，法國達(dá)索公司。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 樣品制備 將3 g肌肉加入75 mL預(yù)冷的Weber-Edsall緩沖液（0.6 mol·L-1KCL、0.01 mol·L-1Na2CO3、0.04 mol·L-1NaHCO3，蛋白酶抑制劑50 mL/片，pH 7.2），用勻漿機(jī)在冰浴下勻漿3次（每次30 s，中間間隔10 s）。利用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，使用Weber-Edsall緩沖液將蛋白濃度調(diào)整至4 mg·mL-1。
將所得蛋白勻漿液平均分為3份，分別添加堿性磷酸酶抑制劑（1片堿性磷酸酶抑制劑/10 mL蛋白勻漿液）、蛋白激酶抑制劑（0.6 μmol·L-1Go 6983、0.48 μmol·L-1H-89、0.2 μmol·L-1Bisindolylmaleimide I）和等量的二甲基亞砜。為與企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)溫度一致，在4℃下振蕩孵育0、0.5、4、12、24、48和72 h，在每個(gè)孵育時(shí)間點(diǎn)留樣，液氮速凍后于-80℃保存，用于蛋白質(zhì)乙?；土姿峄降臏y定；再取0.5 mL蛋白勻漿液加入1 mL超純水（使溶液中KCl的濃度變?yōu)?.2 mol·L-1）后在15 000×、4℃下離心20 min，收集上清液（含游離肌動蛋白），添加等體積上樣緩沖液，混合后煮沸10 min，液氮速凍后于-80℃保存，用于肌動球蛋白解離程度測定；將沉淀溶解于150 μL KCl-Tris緩沖液（0.6 mol·L-1KCl、0.02 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.2）中，液氮速凍后于-80℃保存，用于肌動球蛋白ATPase活性測定。
1.4.2 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白免疫沉淀 免疫沉淀按照試劑盒的說明書進(jìn)行?；静襟E如下：將10 μg抗體添加到250 μL蛋白溶液中，用免疫沉淀裂解緩沖液將抗體/樣品混合物稀釋至500 μL，4℃下孵育過夜。吸取25 μL（0.25 mg）Protein A/G磁珠，用緩沖液洗滌后利用磁力架除去上清液。將抗原樣品/抗體混合物與磁珠混合，在室溫下孵育1 h。用磁力架收集磁珠（含肌球蛋白重鏈或肌動蛋白），然后用緩沖液洗滌3次，超純水洗滌1次。向離心管中加入50 μL上樣緩沖液，并在室溫下混合孵育10 min洗脫目標(biāo)蛋白。最后，使用磁力架除去磁珠，將上樣緩沖液（含目標(biāo)蛋白）煮沸10 min。液氮速凍后于-20℃保存，用于乙?；土姿峄治觥?/p>
1.4.3 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平 濃縮膠濃度為4%，肌球蛋白重鏈?zhǔn)褂?.5%的分離膠，肌動蛋白使用15%的分離膠，上樣量為10 μL。初始電壓為70 V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑出濃縮膠后，將電壓增至100 V直至電泳結(jié)束。磷酸化染色和全蛋白染色流程參考陳立娟等[21]的方法。使用凝膠成像儀拍照，利用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平為Pro-Q染色光密度值（P）和Ruby染色光密度值（T）之比。
1.4.4 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白乙?；?將15 μL樣品上樣至4%—20%的梯度預(yù)制膠上。初始電壓為100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑出濃縮膠后，將電壓增至200 V直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，將硝酸纖維素膜和凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡25 min。在100 V恒壓條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，肌球蛋白重鏈轉(zhuǎn)膜400 min，肌動蛋白轉(zhuǎn)膜200 min。用含有Tween 20的Tris buffered saline（TBST）溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與乙?；嚢彼峥贵w（1﹕1 000稀釋于封閉液）在4℃下孵育20 h。用TBST溶液洗滌膜3次后與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育5 h。用TBST溶液洗滌膜3次后，利用Electrochemiluminescence（ECL）化學(xué)發(fā)光法顯色，通過凝膠成像儀和Quantity One軟件分析灰度值，該灰度值為乙?；∏虻鞍字劓満图拥鞍紫鄬浚ˋ）。
在檢測完乙?；∏虻鞍字劓満图拥鞍缀?，將膜用TBST洗滌以去除ECL底物。然后在室溫下用Western Blot Stripping Buffer洗滌膜20 min，去除結(jié)合在膜上的抗體。用TBST溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與肌球蛋白重鏈抗體（1﹕1 000稀釋于封閉液）/肌動蛋白抗體（1﹕500稀釋于封閉液）在4℃下孵育過夜。用TBST溶液洗滌膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育1 h。顯色流程同前，最終得到本底肌球蛋白重鏈和肌動蛋白相對含量（T）。A/T即為肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的蛋白質(zhì)乙?；?。
1.4.5 肌動球蛋白解離程度 肌動球蛋白解離程度的測定參考高星等[22]的方法。主要步驟包括：將10 μL樣品上樣至12%預(yù)制膠上，在200 V下電泳至溴酚藍(lán)剛好跑出凝膠底部。電泳結(jié)束后，將硝酸纖維素膜和凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡25 min。在100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)膜80 min，用TBST溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與肌動蛋白抗體（1﹕500稀釋于封閉液）在4℃下孵育過夜。用TBST溶液洗滌膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育1 h。顯色流程同前。
1.4.6 肌動球蛋白ATPase活性 按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。主要步驟包括：通過制備不同濃度（0—50 μmol·L-1）的磷酸鹽溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于樣品磷酸鹽含量的計(jì)算。在每個(gè)反應(yīng)孔中加入20 μL分析緩沖液和10 μL ATP溶液（4 mmol·L-1），然后在試驗(yàn)孔中加入10 μL稀釋10倍的樣品，對照孔中加入10 μL分析緩沖液。將混合物在25℃下孵育30 min，加入200 μL終止液后在25℃下再孵育30 min，以終止酶促反應(yīng)并生成比色產(chǎn)物。在620 nm下讀取吸光度后根據(jù)說明書計(jì)算ATPase活性。
1.4.7 分子動力學(xué)分析 根據(jù)Chen等[23]的方法利用分子動力學(xué)模擬軟件（Discovery Studio 2019）研究磷酸化對肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的影響。首先，從UniProt（https://www.uniprot.org/）獲得羊（ID：W5PPG6）和（ID：W5NYJ1）的氨基酸序列。通過BLAST搜索相似序列，通過同源建模篩選、構(gòu)建、評估和優(yōu)化模型，確定用于綿羊MYH-1/ACTA-1蛋白結(jié)構(gòu)模擬的模型。使用Z-Dock對接構(gòu)建的綿羊MYH-1和ACTA-1，結(jié)合已有磷酸化位點(diǎn)的相關(guān)研究[24]（表1），利用氨基酸突變功能將蛋白模型上的磷酸化絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榱姿峄癄顟B(tài)，構(gòu)建磷酸化肌動球蛋白。最后分別對原始狀態(tài)和模擬磷酸化狀態(tài)的肌動球蛋白進(jìn)行分子動力學(xué)計(jì)算。
表1 本研究所用肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化位點(diǎn)
S：絲氨酸，Y：酪氨酸，T：蘇氨酸
S: Serine, Y: Tyrosine, T: Threonine
1.5 統(tǒng)計(jì)分析
使用SPSS Statistic 21.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（＜0.05），采用Microsoft Excel 2016軟件繪圖。
2 結(jié)果
2.1 體外孵育過程中肌球蛋白重鏈磷酸化水平變化
孵育不同時(shí)間點(diǎn)的肌球蛋白重鏈磷酸化水平如圖1所示，3個(gè)處理組的磷酸化水平均呈先上升后下降的趨勢，說明宰后早期肌肉中還存在少量的ATP，可支持短時(shí)間內(nèi)磷酸化反應(yīng)。隨孵育時(shí)間延長，ATP被消耗，肌球蛋白重鏈磷酸化水平下降。磷酸酶抑制組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平在孵育4、12和72 h時(shí)分別比對照組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平高66%、62%和21%（＜0.05），比激酶抑制組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平分別高65%、63%和42%（＜0.05）。說明堿性磷酸酶抑制劑可以有效地抑制肌球蛋白重鏈去磷酸化反應(yīng)，而對照組和蛋白激酶抑制組去磷酸化反應(yīng)未被抑制，因此，其肌球蛋白重鏈磷酸化水平低于磷酸酶抑制組。
H、M、L分別為磷酸酶抑制組、對照組、激酶抑制組，S為標(biāo)樣。MHC和P-MHC分別為肌球蛋白重鏈和磷酸化肌球蛋白重鏈。不同小寫字母表示同一處理組在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著（P＜0.05）。不同大寫字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組間差異顯著（P＜0.05）。下同
2.2 體外孵育過程中肌動蛋白磷酸化水平變化
孵育不同時(shí)間點(diǎn)的肌動蛋白磷酸化水平如圖2所示，由于宰后早期肌肉中還存在少量的ATP，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動蛋白磷酸化水平在孵育0.5—4 h時(shí)顯著增加（＜0.05），在孵育4—72 h間肌動蛋白磷酸化水平無顯著差異（＞0.05）。對照組和蛋白激酶抑制劑處理組的肌動蛋白磷酸化水平在孵育期間無顯著變化（＞0.05）。在孵育4—72 h，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌動蛋白磷酸化水平顯著高于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05），說明堿性磷酸酶抑制劑可以有效地抑制肌動蛋白去磷酸化反應(yīng)。
2.3 體外孵育過程中肌球蛋白重鏈乙?；阶兓?/h3>
3個(gè)處理組的乙?；秸w上呈先上升后下降的趨勢，說明宰后早期肌肉中還存在少量的乙酰輔酶A，可支持短時(shí)間內(nèi)乙?；磻?yīng)，隨孵育時(shí)間延長，乙酰輔酶A被消耗，肌球蛋白重鏈乙?；较陆怠Ｔ诜跤? h時(shí)，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌球蛋白重鏈乙?；斤@著高于對照組（39%）和蛋白激酶抑制劑處理組（180%）（＜0.05）；在孵育24 h時(shí)，對照組肌球蛋白重鏈乙?；奖鹊鞍准っ敢种苿┨幚斫M高23%，蛋白激酶抑制劑處理組比堿性磷酸酶抑制劑處理組高85%（＜0.05）。在其他孵育時(shí)間點(diǎn)，不同處理組肌球蛋白重鏈乙?；綗o顯著差異（＞0.05）。在不同的孵育時(shí)間點(diǎn)之間，不同處理對肌球蛋白重鏈乙酰化水平的影響無明顯規(guī)律（圖3）。
P-Actin為磷酸化肌動蛋白P-Actin is phosphorylated actin
Ac-MHC為乙?；∏虻鞍字劓淎c-MHC is acetylated myosin heavy chain
2.4 體外孵育過程中肌動蛋白乙酰化水平變化
由于宰后早期肌肉中還存在少量的乙酰輔酶A，可支持短時(shí)間內(nèi)乙酰化反應(yīng)，3個(gè)處理組的乙?；骄氏壬仙笙陆档内厔荩S孵育時(shí)間延長，乙酰輔酶A被消耗，肌動蛋白乙?；较陆?。在孵育4—72 h時(shí)，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌動蛋白乙?；斤@著低于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05），表明堿性磷酸酶抑制劑可能促進(jìn)肌動蛋白乙酰化或抑制去乙?；▓D4）。
Ac-Actin為乙酰化肌動蛋白Ac-Actin is acetylated actin。下同 The same as below
2.5 體外孵育過程中肌動球蛋白解離程度變化
3個(gè)處理組的肌動球蛋白解離程度在孵育0—0.5 h均顯著升高（＜0.05），隨孵育時(shí)間延長而逐漸下降。除0 h外，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白解離程度均顯著高于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05）（圖5），說明抑制去磷酸化作用可以減緩肌球蛋白與肌動蛋白之間橫橋的形成。
2.6 體外孵育過程中肌動球蛋白ATPase活性變化
孵育0—24 h，3個(gè)處理組的肌動球蛋白ATPase活性均持續(xù)增加，孵育24—72 h時(shí)持續(xù)下降。除0 h外，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白ATPase活性均顯著低于蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05）（圖6）。
2.7 肌動球蛋白的分子動力學(xué)分析
羊背最長肌肉中的肌球蛋白主要為2b型，編碼基因?yàn)?；肌動蛋白主要?肌動蛋白編碼基因-1[25-26]。因此，本研究選擇這兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。磷酸化后肌動球蛋白整體結(jié)構(gòu)變得更加松散，肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合緊密程度降低（圖7）。磷酸化肌動球蛋白的總能、勢能和動能均高于未磷酸化肌動球蛋白，磷酸化肌動球蛋白的鍵能低于未磷酸化肌動球蛋白的鍵能（表2）。
3 討論
3.1 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化影響肌動球蛋白解離
肌球蛋白重鏈具有ATP水解酶活性，可水解ATP并產(chǎn)生肌肉收縮力，對穩(wěn)定肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。宰后肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合形成大量肌動球蛋白使動物屠宰后出現(xiàn)尸僵，肌肉嫩度大大下降[27]。因此，宰后肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合狀態(tài)是影響肉嫩度的重要因素[28]。有研究表明肌球蛋白重鏈的磷酸化在調(diào)節(jié)肌球蛋白功能中起重要作用[29]，肌球蛋白重鏈的蘇氨酸磷酸化可能調(diào)節(jié)肌球蛋白組裝。肌球蛋白重鏈磷酸化水平降低限制肌球蛋白依賴性收縮，表明肌球蛋白重鏈磷酸化促進(jìn)肌動球蛋白解離[30]。Gao等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑制肌球蛋白重鏈去磷酸化作用增加了肌動球蛋白解離程度，這與本研究中的肌球蛋白重鏈磷酸化水平降低，肌動球蛋白ATPase活性顯著升高，肌動球蛋白解離程度顯著降低的結(jié)果一致。肌動蛋白作為細(xì)肌絲直接與肌球蛋白頭部結(jié)合的蛋白，其磷酸化同樣對肌動球蛋白解離起調(diào)控作用。Chen[31]和Liu[32]等發(fā)現(xiàn)高嫩度羊肉中肌動蛋白磷酸化水平高于低嫩度羊肉，肌動蛋白53位酪氨酸磷酸化破壞了細(xì)肌絲的穩(wěn)定性。肌動蛋白磷酸化影響其聚合和解聚過程，兔肌肉中肌動蛋白磷酸化水平隨年齡增加而升高，這表明衰老引起的肌動蛋白磷酸化變化可能影響肌肉收縮[33-36]。因此，堿性磷酸酶抑制劑抑制肌球蛋白重鏈和肌動蛋白去磷酸化作用，破壞粗肌絲和細(xì)肌絲的穩(wěn)定性，抑制肌球蛋白和肌動蛋白互作，導(dǎo)致肌動球蛋白解離程度增加，進(jìn)而降低肌動球蛋白ATPase活性。
圖5 不同處理組孵育過程中肌動球蛋白解離程度
圖6 不同處理組孵育過程中肌動球蛋白ATPase活性
表2 不同磷酸化狀態(tài)下肌動球蛋白分子動力學(xué)分析
紅圈部分為肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合界面 Red circle part means binding interface of myosin and actin
3.2 蛋白質(zhì)磷酸化影響肌動球蛋白結(jié)構(gòu)
分子動力學(xué)是一種廣泛用于蛋白質(zhì)功能研究的計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)，本研究通過分子動力學(xué)模擬對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，模擬磷酸化肌動球蛋白的總能量高于未磷酸化肌動球蛋白的總能量，鍵能低于未磷酸化肌動球蛋白的鍵能?？偰芰渴莿菽芎蛣幽苤停偰芰吭浇咏?，物質(zhì)越穩(wěn)定。鍵能是打破化學(xué)鍵所需的能量，鍵能越大，物質(zhì)越穩(wěn)定[37]。說明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的磷酸化降低了肌動球蛋白的穩(wěn)定性，使其更易發(fā)生解離。這可能是由于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸本身呈電中性，當(dāng)它們磷酸化之后，由于磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷而使它們呈負(fù)電性，從而削弱了肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化通過降低肌動球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性促進(jìn)肌動球蛋白解離。
3.3 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化影響其乙?；?/h3>
近年來的研究表明，蛋白質(zhì)乙酰化也參與調(diào)控宰后肉品品質(zhì)形成過程，宰后早期肌漿蛋白乙?；c持水性負(fù)相關(guān)，與紅度值正相關(guān)；肌原纖維蛋白乙?；脚c剪切力正相關(guān)[38]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)乙?；c磷酸化發(fā)生在同一蛋白質(zhì)上時(shí)可能存在交互作用以影響蛋白功能，兩種修飾的交互作用方式主要包括位點(diǎn)競爭、修飾對修飾酶本身活性的調(diào)控、底物蛋白修飾后影響其與修飾酶的結(jié)合等[39]。由于磷酸化和乙?；l(fā)生在不同類型的氨基酸上，因此二者之間不存在位點(diǎn)競爭。因此，磷酸化對乙?；恼{(diào)控方式主要包括：乙酰轉(zhuǎn)移酶或去乙?；副旧戆l(fā)生磷酸化修飾而影響其活性；底物蛋白發(fā)生磷酸化而影響其與乙酰轉(zhuǎn)移酶或去乙酰化酶的結(jié)合。Samant等[40]研究發(fā)現(xiàn)，心肌中肌球蛋白重鏈的乙?；鰪?qiáng)肌球蛋白與肌動蛋白之間的相互作用，調(diào)節(jié)ATPase的活性以及粗細(xì)肌絲的相對滑動，但本研究中，不同磷酸化水平處理組的肌球蛋白重鏈乙酰化水平呈現(xiàn)無規(guī)律變化，因此，肌球蛋白重鏈磷酸化可能對其乙?；綗o明顯影響，肌球蛋白重鏈磷酸化直接促進(jìn)肌動球蛋白解離。Liu等[24]研究結(jié)果表明肌動蛋白在第325位絲氨酸發(fā)生磷酸化，而肌動蛋白第326和328位賴氨酸的乙?；瘯淖兣c原肌球蛋白和肌球蛋白的靜電結(jié)合，導(dǎo)致原肌球蛋白介導(dǎo)的肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合的抑制作用削弱[41-44]。有研究表明，體外模型中肌動蛋白乙?；种萍忧虻鞍捉怆x，而本研究中堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動蛋白乙酰化水平顯著低于對照組和激酶抑制組[45]。因此，在本研究中，肌動蛋白磷酸化可能通過抑制乙酰轉(zhuǎn)移酶與肌動蛋白的結(jié)合，下調(diào)肌動蛋白乙?；剑龠M(jìn)肌動球蛋白解離，從而改善肉品嫩度。
4 結(jié)論
堿性磷酸酶抑制劑抑制肌球蛋白重鏈和肌動蛋白去磷酸化，肌球蛋白重鏈磷酸化與其乙酰化變化無明顯關(guān)聯(lián)，肌動蛋白乙酰化受其磷酸化抑制。肌球蛋白重鏈磷酸化降低ATP酶活性，直接促進(jìn)肌動球蛋白解離；肌動蛋白磷酸化通過抑制其自身乙?；龠M(jìn)肌動球蛋白解離。
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Effects of Protein Phosphorylation on the Dissociation and Acetylation Level of Actomyosin
ZHANG YeJun, ZHANG DeQuan, HOU ChengLi, BAI YuQiang, REN Chi, WANG Xu, LI Xin
Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-products Quality & Safety in Harvest, Storage, Transportation, Management and Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193
【】The objective of this study was to investigate the effects of myosin heavy chain and actin phosphorylation on their acetylation levels, actomyosin dissociation, and ATPase activity, so as to provide a theoretical basis for improving meat tenderness by regulating protein phosphorylation level.【】The homogenate of sheep longissimus dorsi muscle was incubated with alkaline phosphatase inhibitor (inhibiting dephosphorylation) and protein kinase inhibitor (inhibiting phosphorylation) at 4℃ for 0, 0.5, 4, 12, 24, 48, and 72 h to regulate the phosphorylation levels of myosin heavy chain and actin. The protein phosphorylation level was measured by SDS-PAGE and fluorescent staining, and the acetylation level and actomyosin dissociation degree were measured by Western blotting. The ATPase activity was measured using an assay kit. The influence of myosin heavy chain and actin phosphorylation on the structure of actomyosin was analyzed by molecular dynamics simulation.【】The phosphorylation level of myosin heavy chain in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was significantly higher than that in the control and protein kinase inhibitor treatment groups at 4, 12, and 72 h of incubation (＜0.05). The phosphorylation level of actin was significantly higher than that in the control and protein kinase inhibition treatment groups at 4, 12, 24, 48, and 72 h of incubation (＜0.05), which indicated that alkaline phosphatase inhibitors could inhibit the dephosphorylation of myosin heavy chain and actin during incubation in vitro. The acetylation level of actin in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was significantly lower than that in the protein kinase inhibitor treatment group after incubation for 4, 12, 24, 48, and 72 h (＜0.05), while the acetylation level of myosin heavy chain changed irregularly. The results indicated that the phosphorylation of actin inhibited its acetylation, while the phosphorylation of myosin heavy chain had no obvious regularity on its acetylation. The results of molecular dynamics showed that the phosphorylation of the 2nd, 3rd and 54th serine positions of the myosin heavy chain and the 54th and 55th tyrosine positions of actin increased the total energy, potential energy, and kinetic energy of actomyosin. However, the bond energy of actomyosin was reduced, which caused the unstable structure of actomyosin. The dissociation degree of actomyosin in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was always higher than that of the protein kinase inhibitor treatment group during 0-72 h incubation (＜0.05). The ATPase activity was always lower than that in the protein kinase inhibitor treatment group during 0-72 h incubation (＜0.05). The myosin heavy chain and actin phosphorylation promoted actomyosin dissociation.【】The phosphorylation of myosin heavy chain directly promoted the dissociation of actomyosin, while the phosphorylation of actin promoted the dissociation of actomyosin by inhibiting its acetylation.
phosphorylation; acetylation; myosin heavy chain; actin; dissociation
10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.014
2021-07-09；
2021-10-09
國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（32030086）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2021-IFST-03）
張業(yè)軍， E-mail：zhangyejun1126@163.com。通信作者李欣，Tel：010-62819392；E-mail：xinli.caas@gmail.com
（責(zé)任編輯 趙伶俐）
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蛋白質(zhì)磷酸化對肌動球蛋白解離及其乙?；降挠绊?/p>
張業(yè)軍，張德權(quán)，侯成立，擺玉薔，任馳，王旭，李欣
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193
【】研究肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化對其乙?；?、肌動球蛋白解離及ATP酶活性的影響，為通過調(diào)控磷酸化水平改善肉品嫩度提供理論依據(jù)。以羊背最長肌為材料制備肌肉勻漿液，采用堿性磷酸酶抑制劑（抑制去磷酸化）和蛋白激酶抑制劑（抑制磷酸化）調(diào)控其磷酸化水平，在4℃分別孵育0、0.5、4、12、24、48和72 h，利用SDS-PAGE電泳和熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡、ATP酶活性測定試劑盒分析蛋白質(zhì)磷酸化水平、乙?；?、肌動球蛋白解離程度和ATP酶活性隨孵育時(shí)間的變化；利用分子動力學(xué)模擬分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化對肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的影響。堿性磷酸酶抑制劑處理組中肌球蛋白重鏈磷酸化水平在孵育4、12和72 h時(shí)顯著高于對照組和蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），肌動蛋白磷酸化水平在孵育4、12、24、48和72 h時(shí)顯著高于對照組和蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)被堿性磷酸酶抑制劑所抑制。堿性磷酸酶抑制劑處理組中肌動蛋白乙?；皆诜跤?、12、24、48和72 h時(shí)顯著低于蛋白激酶抑制組（＜0.05），肌球蛋白重鏈乙?；匠薀o規(guī)律變化，表明肌動蛋白磷酸化抑制其乙?；?，肌球蛋白重鏈磷酸化對其乙?；绊憻o明顯規(guī)律。分子動力學(xué)結(jié)果表明，肌球蛋白重鏈第2、3、54位絲氨酸等位點(diǎn)和肌動蛋白第54位絲氨酸、第55位酪氨酸等位點(diǎn)磷酸化增加了肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的總能量、勢能和動能，降低了鍵能，導(dǎo)致肌動球蛋白結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。在0—72 h孵育過程中，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白解離程度始終高于蛋白激酶抑制處理組，ATP酶活性低于蛋白激酶抑制處理組（＜0.05），表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化促進(jìn)肌動球蛋白解離。肌球蛋白重鏈磷酸化直接促進(jìn)肌動球蛋白解離，肌動蛋白磷酸化通過抑制其自身乙?；龠M(jìn)肌動球蛋白解離。
磷酸化；乙?；?；肌球蛋白重鏈；肌動蛋白；解離
0 引言
【研究意義】肉的嫩度是影響消費(fèi)者滿意度和購買意愿的主要品質(zhì)之一[1-2]。肌動球蛋白解離促進(jìn)宰后肉的嫩化，與肉的嫩度呈正相關(guān)[3-4]。因此，肌動球蛋白解離一直是肉品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】肌球蛋白和肌動蛋白分別是粗肌絲和細(xì)肌絲的主要成分，動物屠宰后，二者結(jié)合形成肌動球蛋白。已有研究表明，肌動球蛋白解離受內(nèi)源酶、鈣離子濃度、ATP及其水解產(chǎn)物等內(nèi)因和溫度、磷酸鹽及壓力等外因影響[5-7]。除細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素外，Perrie等[8]研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合還受蛋白質(zhì)磷酸化影響。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化改變肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)，使肌球蛋白球狀頭部遠(yuǎn)離粗肌絲，調(diào)節(jié)細(xì)肌絲與粗肌絲的相互作用[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉蛋白質(zhì)磷酸化可能參與調(diào)控肉品品質(zhì)，肉品領(lǐng)域?qū)Υ碎_展了大量研究[12-14]。肌鈣蛋白T和肌球蛋白輕鏈磷酸化修飾削弱了細(xì)肌絲與粗肌絲的相互作用，表明蛋白質(zhì)磷酸化可能參與調(diào)控宰后肌肉僵直進(jìn)程[15-16]。蛋白質(zhì)乙?；橇硪环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)乙?；{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、酶活性和蛋白相互作用等。研究發(fā)現(xiàn)與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì)是在肌肉向肉轉(zhuǎn)化過程中鑒定出的最大的乙?；鞍踪|(zhì)簇之一，特別是鑒定到大量肌球蛋白重鏈和肌動蛋白乙?；稽c(diǎn)，表明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的乙?；赡苡绊懠忧虻鞍捉怆x[17-18]。生命科學(xué)領(lǐng)域研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化和乙酰化之間存在交互作用，如人體抑癌基因蛋白的磷酸化增強(qiáng)其自身與乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用，促進(jìn)其乙?；痆19]；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a乙?；龠M(jìn)其與激酶的結(jié)合，有利于其被磷酸化等[20]。【本研究切入點(diǎn)】肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是肌動球蛋白的重要組成部分，二者磷酸化如何調(diào)控肌動球蛋白解離，與其乙?；绞欠翊嬖诮换プ饔?，目前尚不清楚。因此，本研究通過體外孵育試驗(yàn)分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平與其乙酰化水平以及肌動球蛋白解離之間的關(guān)系，初步探索肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化修飾對其乙酰化以及肌動球蛋白解離的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過分析肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平的改變對肌動球蛋白解離、肌動球蛋白ATPase活性及其乙酰化水平的影響，揭示肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化和乙?；餐{(diào)節(jié)肌動球蛋白解離的潛在機(jī)制，為肉品嫩度調(diào)控新技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
試驗(yàn)于2020年10—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。
1.1 樣品采集
選取12只體型相近、飼養(yǎng)管理方式相同的7月齡小尾寒羊和蒙古羊雜交公羊，按照隨機(jī)順序屠宰并依據(jù)屠宰順序平均分為3組，每組4只羊，平均胴體重為（24.15±2.48）kg。宰后30 min內(nèi)取下背最長肌，剔除筋膜及結(jié)締組織后，將背最長肌切碎后裝于凍存管液氮速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2 試劑
免疫沉淀試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Pro-Q和Ruby染色液購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；二硫代蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、過硫酸銨、ATP酶活性測定試劑盒、肌動蛋白抗體購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；堿性磷酸酶抑制劑（貨號：4906837001，主要成分：D-甘露糖醇、二水合鉬酸鈉、聚乙二醇、(T-4)-釩酸鈉、1-乙烯基-2-吡咯烷酮均聚物）和蛋白酶抑制劑（貨號：04693116001，主要成分：二氫乙二胺四乙酸二鈉、4-(2-氨基無乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽）購自瑞士羅氏公司（Roche Group）；肌球蛋白重鏈抗體購自安迪生物科技（上海）有限公司；乙?；嚢彼峥贵w購自杭州景杰生物科技股份有限公司；蛋白激酶抑制劑Go 6983（貨號：HY-13689，主要成分：C26H26N4O3）、H-89（貨號：HY-15979A，主要成分：C20H20BrN3O2S）、Bisindolylmaleimide I（貨號：HY-13867，主要成分：C25H24N4O2）購自美國MedChemExpress（MCE）公司；電泳預(yù)制膠購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；硝酸纖維素膜購自頗爾（中國）有限公司；碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、乙腈、乙酸、乙醇、二甲基亞砜等為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.3 儀器與設(shè)備
Spectra Max 190全波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；ML204/2電子天平、Mettler-Toledo pH計(jì)，上海梅特勒-托利多有限公司；Ultra Turrax Disperser S25分散器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；高效冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；恒溫震蕩金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Discovery Studio 2019分子模擬軟件，法國達(dá)索公司。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 樣品制備 將3 g肌肉加入75 mL預(yù)冷的Weber-Edsall緩沖液（0.6 mol·L-1KCL、0.01 mol·L-1Na2CO3、0.04 mol·L-1NaHCO3，蛋白酶抑制劑50 mL/片，pH 7.2），用勻漿機(jī)在冰浴下勻漿3次（每次30 s，中間間隔10 s）。利用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，使用Weber-Edsall緩沖液將蛋白濃度調(diào)整至4 mg·mL-1。
將所得蛋白勻漿液平均分為3份，分別添加堿性磷酸酶抑制劑（1片堿性磷酸酶抑制劑/10 mL蛋白勻漿液）、蛋白激酶抑制劑（0.6 μmol·L-1Go 6983、0.48 μmol·L-1H-89、0.2 μmol·L-1Bisindolylmaleimide I）和等量的二甲基亞砜。為與企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)溫度一致，在4℃下振蕩孵育0、0.5、4、12、24、48和72 h，在每個(gè)孵育時(shí)間點(diǎn)留樣，液氮速凍后于-80℃保存，用于蛋白質(zhì)乙?；土姿峄降臏y定；再取0.5 mL蛋白勻漿液加入1 mL超純水（使溶液中KCl的濃度變?yōu)?.2 mol·L-1）后在15 000×、4℃下離心20 min，收集上清液（含游離肌動蛋白），添加等體積上樣緩沖液，混合后煮沸10 min，液氮速凍后于-80℃保存，用于肌動球蛋白解離程度測定；將沉淀溶解于150 μL KCl-Tris緩沖液（0.6 mol·L-1KCl、0.02 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.2）中，液氮速凍后于-80℃保存，用于肌動球蛋白ATPase活性測定。
1.4.2 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白免疫沉淀 免疫沉淀按照試劑盒的說明書進(jìn)行?；静襟E如下：將10 μg抗體添加到250 μL蛋白溶液中，用免疫沉淀裂解緩沖液將抗體/樣品混合物稀釋至500 μL，4℃下孵育過夜。吸取25 μL（0.25 mg）Protein A/G磁珠，用緩沖液洗滌后利用磁力架除去上清液。將抗原樣品/抗體混合物與磁珠混合，在室溫下孵育1 h。用磁力架收集磁珠（含肌球蛋白重鏈或肌動蛋白），然后用緩沖液洗滌3次，超純水洗滌1次。向離心管中加入50 μL上樣緩沖液，并在室溫下混合孵育10 min洗脫目標(biāo)蛋白。最后，使用磁力架除去磁珠，將上樣緩沖液（含目標(biāo)蛋白）煮沸10 min。液氮速凍后于-20℃保存，用于乙?；土姿峄治觥?/p>
1.4.3 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平 濃縮膠濃度為4%，肌球蛋白重鏈?zhǔn)褂?.5%的分離膠，肌動蛋白使用15%的分離膠，上樣量為10 μL。初始電壓為70 V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑出濃縮膠后，將電壓增至100 V直至電泳結(jié)束。磷酸化染色和全蛋白染色流程參考陳立娟等[21]的方法。使用凝膠成像儀拍照，利用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化水平為Pro-Q染色光密度值（P）和Ruby染色光密度值（T）之比。
1.4.4 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白乙?；?將15 μL樣品上樣至4%—20%的梯度預(yù)制膠上。初始電壓為100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑出濃縮膠后，將電壓增至200 V直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，將硝酸纖維素膜和凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡25 min。在100 V恒壓條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，肌球蛋白重鏈轉(zhuǎn)膜400 min，肌動蛋白轉(zhuǎn)膜200 min。用含有Tween 20的Tris buffered saline（TBST）溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與乙?；嚢彼峥贵w（1﹕1 000稀釋于封閉液）在4℃下孵育20 h。用TBST溶液洗滌膜3次后與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育5 h。用TBST溶液洗滌膜3次后，利用Electrochemiluminescence（ECL）化學(xué)發(fā)光法顯色，通過凝膠成像儀和Quantity One軟件分析灰度值，該灰度值為乙?；∏虻鞍字劓満图拥鞍紫鄬浚ˋ）。
在檢測完乙?；∏虻鞍字劓満图拥鞍缀?，將膜用TBST洗滌以去除ECL底物。然后在室溫下用Western Blot Stripping Buffer洗滌膜20 min，去除結(jié)合在膜上的抗體。用TBST溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與肌球蛋白重鏈抗體（1﹕1 000稀釋于封閉液）/肌動蛋白抗體（1﹕500稀釋于封閉液）在4℃下孵育過夜。用TBST溶液洗滌膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育1 h。顯色流程同前，最終得到本底肌球蛋白重鏈和肌動蛋白相對含量（T）。A/T即為肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的蛋白質(zhì)乙?；?。
1.4.5 肌動球蛋白解離程度 肌動球蛋白解離程度的測定參考高星等[22]的方法。主要步驟包括：將10 μL樣品上樣至12%預(yù)制膠上，在200 V下電泳至溴酚藍(lán)剛好跑出凝膠底部。電泳結(jié)束后，將硝酸纖維素膜和凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡25 min。在100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)膜80 min，用TBST溶液洗滌膜3次后在室溫下封閉1 h，然后與肌動蛋白抗體（1﹕500稀釋于封閉液）在4℃下孵育過夜。用TBST溶液洗滌膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗（1﹕1 000稀釋于封閉液）在室溫下孵育1 h。顯色流程同前。
1.4.6 肌動球蛋白ATPase活性 按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。主要步驟包括：通過制備不同濃度（0—50 μmol·L-1）的磷酸鹽溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于樣品磷酸鹽含量的計(jì)算。在每個(gè)反應(yīng)孔中加入20 μL分析緩沖液和10 μL ATP溶液（4 mmol·L-1），然后在試驗(yàn)孔中加入10 μL稀釋10倍的樣品，對照孔中加入10 μL分析緩沖液。將混合物在25℃下孵育30 min，加入200 μL終止液后在25℃下再孵育30 min，以終止酶促反應(yīng)并生成比色產(chǎn)物。在620 nm下讀取吸光度后根據(jù)說明書計(jì)算ATPase活性。
1.4.7 分子動力學(xué)分析 根據(jù)Chen等[23]的方法利用分子動力學(xué)模擬軟件（Discovery Studio 2019）研究磷酸化對肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的影響。首先，從UniProt（https://www.uniprot.org/）獲得羊（ID：W5PPG6）和（ID：W5NYJ1）的氨基酸序列。通過BLAST搜索相似序列，通過同源建模篩選、構(gòu)建、評估和優(yōu)化模型，確定用于綿羊MYH-1/ACTA-1蛋白結(jié)構(gòu)模擬的模型。使用Z-Dock對接構(gòu)建的綿羊MYH-1和ACTA-1，結(jié)合已有磷酸化位點(diǎn)的相關(guān)研究[24]（表1），利用氨基酸突變功能將蛋白模型上的磷酸化絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榱姿峄癄顟B(tài)，構(gòu)建磷酸化肌動球蛋白。最后分別對原始狀態(tài)和模擬磷酸化狀態(tài)的肌動球蛋白進(jìn)行分子動力學(xué)計(jì)算。
表1 本研究所用肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化位點(diǎn)
S：絲氨酸，Y：酪氨酸，T：蘇氨酸
S: Serine, Y: Tyrosine, T: Threonine
1.5 統(tǒng)計(jì)分析
使用SPSS Statistic 21.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（＜0.05），采用Microsoft Excel 2016軟件繪圖。
2 結(jié)果
2.1 體外孵育過程中肌球蛋白重鏈磷酸化水平變化
孵育不同時(shí)間點(diǎn)的肌球蛋白重鏈磷酸化水平如圖1所示，3個(gè)處理組的磷酸化水平均呈先上升后下降的趨勢，說明宰后早期肌肉中還存在少量的ATP，可支持短時(shí)間內(nèi)磷酸化反應(yīng)。隨孵育時(shí)間延長，ATP被消耗，肌球蛋白重鏈磷酸化水平下降。磷酸酶抑制組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平在孵育4、12和72 h時(shí)分別比對照組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平高66%、62%和21%（＜0.05），比激酶抑制組的肌球蛋白重鏈磷酸化水平分別高65%、63%和42%（＜0.05）。說明堿性磷酸酶抑制劑可以有效地抑制肌球蛋白重鏈去磷酸化反應(yīng)，而對照組和蛋白激酶抑制組去磷酸化反應(yīng)未被抑制，因此，其肌球蛋白重鏈磷酸化水平低于磷酸酶抑制組。
H、M、L分別為磷酸酶抑制組、對照組、激酶抑制組，S為標(biāo)樣。MHC和P-MHC分別為肌球蛋白重鏈和磷酸化肌球蛋白重鏈。不同小寫字母表示同一處理組在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著（P＜0.05）。不同大寫字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組間差異顯著（P＜0.05）。下同
2.2 體外孵育過程中肌動蛋白磷酸化水平變化
孵育不同時(shí)間點(diǎn)的肌動蛋白磷酸化水平如圖2所示，由于宰后早期肌肉中還存在少量的ATP，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動蛋白磷酸化水平在孵育0.5—4 h時(shí)顯著增加（＜0.05），在孵育4—72 h間肌動蛋白磷酸化水平無顯著差異（＞0.05）。對照組和蛋白激酶抑制劑處理組的肌動蛋白磷酸化水平在孵育期間無顯著變化（＞0.05）。在孵育4—72 h，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌動蛋白磷酸化水平顯著高于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05），說明堿性磷酸酶抑制劑可以有效地抑制肌動蛋白去磷酸化反應(yīng)。
2.3 體外孵育過程中肌球蛋白重鏈乙?；阶兓?/h3>
3個(gè)處理組的乙?；秸w上呈先上升后下降的趨勢，說明宰后早期肌肉中還存在少量的乙酰輔酶A，可支持短時(shí)間內(nèi)乙?；磻?yīng)，隨孵育時(shí)間延長，乙酰輔酶A被消耗，肌球蛋白重鏈乙?；较陆怠Ｔ诜跤? h時(shí)，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌球蛋白重鏈乙?；斤@著高于對照組（39%）和蛋白激酶抑制劑處理組（180%）（＜0.05）；在孵育24 h時(shí)，對照組肌球蛋白重鏈乙?；奖鹊鞍准っ敢种苿┨幚斫M高23%，蛋白激酶抑制劑處理組比堿性磷酸酶抑制劑處理組高85%（＜0.05）。在其他孵育時(shí)間點(diǎn)，不同處理組肌球蛋白重鏈乙?；綗o顯著差異（＞0.05）。在不同的孵育時(shí)間點(diǎn)之間，不同處理對肌球蛋白重鏈乙酰化水平的影響無明顯規(guī)律（圖3）。
P-Actin為磷酸化肌動蛋白P-Actin is phosphorylated actin
Ac-MHC為乙?；∏虻鞍字劓淎c-MHC is acetylated myosin heavy chain
2.4 體外孵育過程中肌動蛋白乙酰化水平變化
由于宰后早期肌肉中還存在少量的乙酰輔酶A，可支持短時(shí)間內(nèi)乙酰化反應(yīng)，3個(gè)處理組的乙?；骄氏壬仙笙陆档内厔荩S孵育時(shí)間延長，乙酰輔酶A被消耗，肌動蛋白乙?；较陆?。在孵育4—72 h時(shí)，堿性磷酸酶抑制劑處理組肌動蛋白乙?；斤@著低于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05），表明堿性磷酸酶抑制劑可能促進(jìn)肌動蛋白乙酰化或抑制去乙?；▓D4）。
Ac-Actin為乙酰化肌動蛋白Ac-Actin is acetylated actin。下同 The same as below
2.5 體外孵育過程中肌動球蛋白解離程度變化
3個(gè)處理組的肌動球蛋白解離程度在孵育0—0.5 h均顯著升高（＜0.05），隨孵育時(shí)間延長而逐漸下降。除0 h外，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白解離程度均顯著高于對照組和蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05）（圖5），說明抑制去磷酸化作用可以減緩肌球蛋白與肌動蛋白之間橫橋的形成。
2.6 體外孵育過程中肌動球蛋白ATPase活性變化
孵育0—24 h，3個(gè)處理組的肌動球蛋白ATPase活性均持續(xù)增加，孵育24—72 h時(shí)持續(xù)下降。除0 h外，堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動球蛋白ATPase活性均顯著低于蛋白激酶抑制劑處理組（＜0.05）（圖6）。
2.7 肌動球蛋白的分子動力學(xué)分析
羊背最長肌肉中的肌球蛋白主要為2b型，編碼基因?yàn)?；肌動蛋白主要?肌動蛋白編碼基因-1[25-26]。因此，本研究選擇這兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。磷酸化后肌動球蛋白整體結(jié)構(gòu)變得更加松散，肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合緊密程度降低（圖7）。磷酸化肌動球蛋白的總能、勢能和動能均高于未磷酸化肌動球蛋白，磷酸化肌動球蛋白的鍵能低于未磷酸化肌動球蛋白的鍵能（表2）。
3 討論
3.1 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化影響肌動球蛋白解離
肌球蛋白重鏈具有ATP水解酶活性，可水解ATP并產(chǎn)生肌肉收縮力，對穩(wěn)定肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。宰后肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合形成大量肌動球蛋白使動物屠宰后出現(xiàn)尸僵，肌肉嫩度大大下降[27]。因此，宰后肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合狀態(tài)是影響肉嫩度的重要因素[28]。有研究表明肌球蛋白重鏈的磷酸化在調(diào)節(jié)肌球蛋白功能中起重要作用[29]，肌球蛋白重鏈的蘇氨酸磷酸化可能調(diào)節(jié)肌球蛋白組裝。肌球蛋白重鏈磷酸化水平降低限制肌球蛋白依賴性收縮，表明肌球蛋白重鏈磷酸化促進(jìn)肌動球蛋白解離[30]。Gao等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑制肌球蛋白重鏈去磷酸化作用增加了肌動球蛋白解離程度，這與本研究中的肌球蛋白重鏈磷酸化水平降低，肌動球蛋白ATPase活性顯著升高，肌動球蛋白解離程度顯著降低的結(jié)果一致。肌動蛋白作為細(xì)肌絲直接與肌球蛋白頭部結(jié)合的蛋白，其磷酸化同樣對肌動球蛋白解離起調(diào)控作用。Chen[31]和Liu[32]等發(fā)現(xiàn)高嫩度羊肉中肌動蛋白磷酸化水平高于低嫩度羊肉，肌動蛋白53位酪氨酸磷酸化破壞了細(xì)肌絲的穩(wěn)定性。肌動蛋白磷酸化影響其聚合和解聚過程，兔肌肉中肌動蛋白磷酸化水平隨年齡增加而升高，這表明衰老引起的肌動蛋白磷酸化變化可能影響肌肉收縮[33-36]。因此，堿性磷酸酶抑制劑抑制肌球蛋白重鏈和肌動蛋白去磷酸化作用，破壞粗肌絲和細(xì)肌絲的穩(wěn)定性，抑制肌球蛋白和肌動蛋白互作，導(dǎo)致肌動球蛋白解離程度增加，進(jìn)而降低肌動球蛋白ATPase活性。
圖5 不同處理組孵育過程中肌動球蛋白解離程度
圖6 不同處理組孵育過程中肌動球蛋白ATPase活性
表2 不同磷酸化狀態(tài)下肌動球蛋白分子動力學(xué)分析
紅圈部分為肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合界面 Red circle part means binding interface of myosin and actin
3.2 蛋白質(zhì)磷酸化影響肌動球蛋白結(jié)構(gòu)
分子動力學(xué)是一種廣泛用于蛋白質(zhì)功能研究的計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)，本研究通過分子動力學(xué)模擬對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，模擬磷酸化肌動球蛋白的總能量高于未磷酸化肌動球蛋白的總能量，鍵能低于未磷酸化肌動球蛋白的鍵能?？偰芰渴莿菽芎蛣幽苤停偰芰吭浇咏?，物質(zhì)越穩(wěn)定。鍵能是打破化學(xué)鍵所需的能量，鍵能越大，物質(zhì)越穩(wěn)定[37]。說明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的磷酸化降低了肌動球蛋白的穩(wěn)定性，使其更易發(fā)生解離。這可能是由于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸本身呈電中性，當(dāng)它們磷酸化之后，由于磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷而使它們呈負(fù)電性，從而削弱了肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化通過降低肌動球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性促進(jìn)肌動球蛋白解離。
3.3 肌球蛋白重鏈和肌動蛋白磷酸化影響其乙?；?/h3>
近年來的研究表明，蛋白質(zhì)乙酰化也參與調(diào)控宰后肉品品質(zhì)形成過程，宰后早期肌漿蛋白乙?；c持水性負(fù)相關(guān)，與紅度值正相關(guān)；肌原纖維蛋白乙?；脚c剪切力正相關(guān)[38]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)乙?；c磷酸化發(fā)生在同一蛋白質(zhì)上時(shí)可能存在交互作用以影響蛋白功能，兩種修飾的交互作用方式主要包括位點(diǎn)競爭、修飾對修飾酶本身活性的調(diào)控、底物蛋白修飾后影響其與修飾酶的結(jié)合等[39]。由于磷酸化和乙?；l(fā)生在不同類型的氨基酸上，因此二者之間不存在位點(diǎn)競爭。因此，磷酸化對乙?；恼{(diào)控方式主要包括：乙酰轉(zhuǎn)移酶或去乙?；副旧戆l(fā)生磷酸化修飾而影響其活性；底物蛋白發(fā)生磷酸化而影響其與乙酰轉(zhuǎn)移酶或去乙酰化酶的結(jié)合。Samant等[40]研究發(fā)現(xiàn)，心肌中肌球蛋白重鏈的乙?；鰪?qiáng)肌球蛋白與肌動蛋白之間的相互作用，調(diào)節(jié)ATPase的活性以及粗細(xì)肌絲的相對滑動，但本研究中，不同磷酸化水平處理組的肌球蛋白重鏈乙酰化水平呈現(xiàn)無規(guī)律變化，因此，肌球蛋白重鏈磷酸化可能對其乙?；綗o明顯影響，肌球蛋白重鏈磷酸化直接促進(jìn)肌動球蛋白解離。Liu等[24]研究結(jié)果表明肌動蛋白在第325位絲氨酸發(fā)生磷酸化，而肌動蛋白第326和328位賴氨酸的乙?；瘯淖兣c原肌球蛋白和肌球蛋白的靜電結(jié)合，導(dǎo)致原肌球蛋白介導(dǎo)的肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合的抑制作用削弱[41-44]。有研究表明，體外模型中肌動蛋白乙?；种萍忧虻鞍捉怆x，而本研究中堿性磷酸酶抑制劑處理組的肌動蛋白乙酰化水平顯著低于對照組和激酶抑制組[45]。因此，在本研究中，肌動蛋白磷酸化可能通過抑制乙酰轉(zhuǎn)移酶與肌動蛋白的結(jié)合，下調(diào)肌動蛋白乙?；剑龠M(jìn)肌動球蛋白解離，從而改善肉品嫩度。
4 結(jié)論
堿性磷酸酶抑制劑抑制肌球蛋白重鏈和肌動蛋白去磷酸化，肌球蛋白重鏈磷酸化與其乙酰化變化無明顯關(guān)聯(lián)，肌動蛋白乙酰化受其磷酸化抑制。肌球蛋白重鏈磷酸化降低ATP酶活性，直接促進(jìn)肌動球蛋白解離；肌動蛋白磷酸化通過抑制其自身乙?；龠M(jìn)肌動球蛋白解離。
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Effects of Protein Phosphorylation on the Dissociation and Acetylation Level of Actomyosin
ZHANG YeJun, ZHANG DeQuan, HOU ChengLi, BAI YuQiang, REN Chi, WANG Xu, LI Xin
Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-products Quality & Safety in Harvest, Storage, Transportation, Management and Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193
【】The objective of this study was to investigate the effects of myosin heavy chain and actin phosphorylation on their acetylation levels, actomyosin dissociation, and ATPase activity, so as to provide a theoretical basis for improving meat tenderness by regulating protein phosphorylation level.【】The homogenate of sheep longissimus dorsi muscle was incubated with alkaline phosphatase inhibitor (inhibiting dephosphorylation) and protein kinase inhibitor (inhibiting phosphorylation) at 4℃ for 0, 0.5, 4, 12, 24, 48, and 72 h to regulate the phosphorylation levels of myosin heavy chain and actin. The protein phosphorylation level was measured by SDS-PAGE and fluorescent staining, and the acetylation level and actomyosin dissociation degree were measured by Western blotting. The ATPase activity was measured using an assay kit. The influence of myosin heavy chain and actin phosphorylation on the structure of actomyosin was analyzed by molecular dynamics simulation.【】The phosphorylation level of myosin heavy chain in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was significantly higher than that in the control and protein kinase inhibitor treatment groups at 4, 12, and 72 h of incubation (＜0.05). The phosphorylation level of actin was significantly higher than that in the control and protein kinase inhibition treatment groups at 4, 12, 24, 48, and 72 h of incubation (＜0.05), which indicated that alkaline phosphatase inhibitors could inhibit the dephosphorylation of myosin heavy chain and actin during incubation in vitro. The acetylation level of actin in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was significantly lower than that in the protein kinase inhibitor treatment group after incubation for 4, 12, 24, 48, and 72 h (＜0.05), while the acetylation level of myosin heavy chain changed irregularly. The results indicated that the phosphorylation of actin inhibited its acetylation, while the phosphorylation of myosin heavy chain had no obvious regularity on its acetylation. The results of molecular dynamics showed that the phosphorylation of the 2nd, 3rd and 54th serine positions of the myosin heavy chain and the 54th and 55th tyrosine positions of actin increased the total energy, potential energy, and kinetic energy of actomyosin. However, the bond energy of actomyosin was reduced, which caused the unstable structure of actomyosin. The dissociation degree of actomyosin in the alkaline phosphatase inhibitor treatment group was always higher than that of the protein kinase inhibitor treatment group during 0-72 h incubation (＜0.05). The ATPase activity was always lower than that in the protein kinase inhibitor treatment group during 0-72 h incubation (＜0.05). The myosin heavy chain and actin phosphorylation promoted actomyosin dissociation.【】The phosphorylation of myosin heavy chain directly promoted the dissociation of actomyosin, while the phosphorylation of actin promoted the dissociation of actomyosin by inhibiting its acetylation.
phosphorylation; acetylation; myosin heavy chain; actin; dissociation
10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.014
2021-07-09；
2021-10-09
國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（32030086）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2021-IFST-03）
張業(yè)軍， E-mail：zhangyejun1126@163.com。通信作者李欣，Tel：010-62819392；E-mail：xinli.caas@gmail.com
（責(zé)任編輯 趙伶俐）
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