陸巍 廉吉虎 王瀟然 高慶圓 劉炳辰 杜杉杉

前列腺癌是泌尿外科常見(jiàn)腫瘤之一,也是影響男性健康與生活質(zhì)量的惡性腫瘤。針對(duì)早期前列腺癌目前臨床的首選治療方案主要為手術(shù)病灶切除治療,而化療則為晚期前列腺癌的主要治療方式。統(tǒng)計(jì)大量臨床腫瘤病例隨訪資料可知：長(zhǎng)期化療給晚期癌癥患者帶來(lái)大量的毒副反應(yīng)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此找尋更安全與更經(jīng)濟(jì)的抗癌藥物是目前腫瘤領(lǐng)域所面臨的重要問(wèn)題及重要挑戰(zhàn)。黃連素,又名小檗堿,是中藥黃連的主要活性成分。近來(lái)研究［1］發(fā)現(xiàn)黃連素在多種心內(nèi)血管疾病、糖尿病及抗腫瘤治療中均有著較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。黃連素作為一種傳統(tǒng)的抗炎藥,能否通過(guò)抑制惡性腫瘤誘導(dǎo)的宿主炎癥反應(yīng)進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展是目前臨床研究的一大熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的一些化療藥物進(jìn)行比較,天然化合物黃連素具有安全性更高、更經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),其在前列腺癌治療方面的應(yīng)用亟待探索。目前,國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［2,3］對(duì)黃連素的認(rèn)知僅停留在細(xì)胞水平和分子水平上,本文以前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3 為研究對(duì)象,分析黃連素的抗腫瘤作用及機(jī)制,為臨床抗腫瘤輔助藥物的研發(fā)提供新的思路、方法及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人前列腺癌PC-3 細(xì)胞株從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所獲得(馬納薩斯,維吉尼亞州,美國(guó)),并在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(Hyclone 公司,洛根,猶他州,美國(guó))。

1.1.2 藥物 黃連素購(gòu)自西馬-奧爾德里奇(路易斯,密蘇里州,美國(guó))。黃連素的純度≥98%,溶解于二甲亞砜中(σ-奧爾德里奇),稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTT 法：選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC-3 細(xì)胞株,將所有細(xì)胞株放置于DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)基環(huán)境為在5%的CO2中添加10%的胎牛血清。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí),添加不同濃度的黃連素來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。在黃連素組中,前列腺癌PC-3 細(xì)胞株在5、10、20、50 μM的黃連素中培養(yǎng)24 h,在未加入黃連素組中,列腺癌PC-3 細(xì)胞株在不加黃連素中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞的存活率通過(guò)MTT 試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量。細(xì)胞96 孔板在酶標(biāo)儀上讀取(賽默科技,羅克福德,伊利諾伊州,美國(guó)),測(cè)試波長(zhǎng)為490 nm,參考波長(zhǎng)為570 nm,在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)吸光度(A),光密度(OD),以上各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值)×100%。

1.2.2 前列腺癌PC-3 細(xì)胞株凋亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行檢測(cè)：根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)以碘化酸/丙酸碘化(PI)雙染色法進(jìn)行檢測(cè)(Santa Cruz 生物技術(shù)公司,Santa Cruz,加利福尼亞州,美國(guó))。用磷酸-緩沖鹽水沖洗細(xì)胞,用不同濃度的黃連素(5、10、20、50 μM)處理細(xì)胞24 或48 h,隨后在結(jié)合緩沖液(10 mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸-氫氧化鈉,pH 值7.4；25 mM氯化鈣和144 mM 氯化鈉)中進(jìn)行再懸浮。隨后,加入膜聯(lián)蛋白V(0.1 μg/μl)和PI(0.05 μg/μl)染料,并將細(xì)胞在冰中、黑暗下培養(yǎng)30 min。然后將細(xì)胞進(jìn)行熒光活化細(xì)胞分類(lèi)(FASS)分析；樣品由流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選系統(tǒng)(BD 生物科技,圣何塞,加利福尼亞州,美國(guó))進(jìn)行檢測(cè),最后進(jìn)行凋亡率的計(jì)算分析。

1.2.3 前列腺癌PC-3 細(xì)胞株周期檢測(cè) 前列腺癌PC-3 細(xì)胞株處理好以后所有黃連素加入濃度均為20 μM,實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組(藥物孵育0 h)；藥物孵育24 h、藥物孵育48 h；藥物孵育72 h。每組3個(gè)復(fù)孔。然后進(jìn)行收集細(xì)胞、洗滌并固定細(xì)胞、染色孵育,最后進(jìn)行流式檢測(cè)和結(jié)果分析。結(jié)果數(shù)據(jù)采用Flowjo 軟件進(jìn)行。

1.2.4 前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的表達(dá)測(cè)定測(cè)定步驟為首先進(jìn)行蛋白印記(所有前列腺癌PC-3細(xì)胞株處理好以后在不同時(shí)間點(diǎn)加入黃連素,探究黃連素不同濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響,則在相同時(shí)間內(nèi)加入不同濃度的黃連素,各實(shí)驗(yàn)組黃連素的終濃度為 5、10、20、50 μM,另外設(shè)對(duì)照組,加入相同體積的藥物溶解介質(zhì),所有標(biāo)本均放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)26 h。)、其次所有培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取、蛋白定量的測(cè)定、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜,進(jìn)行免疫反應(yīng),然后進(jìn)行顯影和定影,采用蛋白免疫印跡(WB)方法檢測(cè)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的表達(dá),最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片分析,掃描下保存的圖片采用Image J分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率、凋亡率的影響 黃連素組前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黃連素組,且隨著黃連素濃度的上升,前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率及凋亡率均逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率、凋亡率的影響(,%)

表1 不同濃度黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率、凋亡率的影響(,%)

注：與未加入黃連素組比較,aP＜0.05；與5 μM 比較,bP＜0.05；與10 μM 比較,cP＜0.05；與20 μM 比較,dP＜0.05

2.2 黃連素孵育時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響 黃連素孵育24 h組、黃連素孵育48 h組、黃連素孵育72 h組的前列腺癌PC-3 細(xì)胞株在G0/G1期比例高于對(duì)照組,在S 期與G2/M 期比例低于對(duì)照組,且隨黃連素孵育時(shí)間增加,前列腺癌PC-3 細(xì)胞株在G0/G1期比例明顯增加,在S 期與G2/M 期比例逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 黃連素孵育時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(,%)

表2 黃連素孵育時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(,%)

注：各組比較,P＜0.05

2.3 同濃度黃連素不同孵育時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的影響 在加入固定濃度20 μM 黃連素進(jìn)行藥物孵育中,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白濃度逐漸降低。見(jiàn)圖1。

圖1 不同孵育時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的影響

2.4 不同濃度黃連素孵育相同時(shí)間對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的影響 在孵育相同時(shí)間前提下,加入黃連素前后列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白顯著降低,且隨著濃度的增高,FAS 蛋白呈逐漸降低。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白的影響

3 討論

黃連素是一種穩(wěn)定存在的季銨型異喹啉類(lèi)生物堿,目前臨床上主要用于治療腸道感染［4］。多項(xiàng)研究表明［5-7］,在腫瘤細(xì)胞周期停滯與細(xì)胞的凋亡過(guò)程中,黃連素可能通過(guò)上調(diào)周期蛋白激酶抑制因子與下調(diào)一系列周期蛋白依賴的激酶以及周期蛋白起著一定的誘導(dǎo)作用。2010年,有相關(guān)文獻(xiàn)［8］指出：低濃度黃連素能夠通過(guò)誘導(dǎo)DNA 損傷(DNA 雙鏈斷裂即DSB),激活p53-p21 通路導(dǎo)致人成骨肉瘤U2OS 細(xì)胞發(fā)生G1期停滯,而較高濃度的黃連素(50 μg/ml)則能誘導(dǎo)G2/M 期停滯,但黃連素誘導(dǎo)的G2/M 期停滯并不依賴p53-p21通路。此前,研究證實(shí)［9］黃連素可通過(guò)下調(diào)FAS、CDK1、細(xì)胞周期蛋白B1、CDC25C 以及上調(diào)Weel、14-3-3σ 的表達(dá),誘導(dǎo)其他幾種腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M 期停滯,但具體的上游信號(hào)通路還不清楚。

本研究以人前列腺癌PC-3 細(xì)胞株為細(xì)胞模型,結(jié)果顯示：黃連素組前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率及凋亡率均高于對(duì)照組,且隨著黃連素濃度的上升,前列腺癌PC-3 細(xì)胞株增殖抑制率及凋亡率均逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示,黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株具有顯著的抑制增殖作用,另一方面,加入20 μM 黃連素處理后,黃連素孵育24 h組、黃連素孵育48 h組、黃連素孵育72 h組的前列腺癌PC-3細(xì)胞株在G0/G1期比例高于對(duì)照組,在S 期與G2/M 期比例低于對(duì)照組,且隨黃連素孵育時(shí)間增加,前列腺癌PC-3 細(xì)胞株在G0/G1期比例明顯增加,在S 期與G2/M 期比例逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此提示：黃連素對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株細(xì)胞周期的分布具有顯著的影響,尤其是高濃度時(shí)可明顯阻滯G2/M 期。脂肪酸合FAS 屬于大分子蛋白復(fù)合物的一種,主要存在于機(jī)體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),在生物體內(nèi)源性脂肪酸的合成中有著至為關(guān)鍵的作用［10］。而有相關(guān)文獻(xiàn)提出［11,12］：FAS 在肥胖者的肝臟、脂肪細(xì)胞及各腫瘤細(xì)胞中都呈現(xiàn)出異常高表達(dá),且FAS 的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)存在,表達(dá)越高提示預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)越高。而本研究進(jìn)一步行WB 檢測(cè)分析得,黃連素不同孵育時(shí)間及不同濃度均對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白存在影響,且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)與濃度的增加,FAS 蛋白含量均逐漸減少,考慮原因可能為：黃連素通過(guò)抑制FAS 中β 原酮脂酰合成酶從而對(duì)DNA 的復(fù)制起到了抑制作用,阻斷了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能量來(lái)源,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。

綜上所述,黃連素可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3 的細(xì)胞凋亡,通過(guò)改變細(xì)胞周期抑制其增殖生長(zhǎng),具有抗腫瘤活性,而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制增長(zhǎng)生長(zhǎng)可能與引起細(xì)胞G2/M 期阻滯和抑制前列腺癌PC-3 細(xì)胞株中FAS 蛋白表達(dá)有關(guān)。但關(guān)于FAS 蛋白或其蛋白通路與細(xì)胞G2/M 期阻滯之間的聯(lián)系還有待進(jìn)一步深入研究。