尚進(jìn)，孫書雅，彭紅梅，王輝，馬慜悅，程延飛，孔娜娜，姚元慶，6*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；2.香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科系，香港；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100853；4.深圳市生育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗室，香港大學(xué)-深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518053；5.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100048；6.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100010)

人類白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen G，HLA-G)屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)分子，選擇性高表達(dá)于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中。HLA-G基因位于人染色體6號短臂遠(yuǎn)側(cè)6p21.3，全長6.0 kb，基因編碼8個外顯子和7個內(nèi)含子。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪切產(chǎn)生7種mRNA異構(gòu)體，分別編碼4種膜結(jié)合型HLA-G(membrane-bound HLA-G，mHLA-G)，即HLA-G1～HLA-G4，以及3種可溶型HLA-G(soluble HLA-G，sHLA-G)，即HLA-G5～HLA-G7。

卵母細(xì)胞的成熟過程離不開它和卵丘細(xì)胞(cumulus cells，CCs)之間的雙向作用[1-2]。在卵泡內(nèi)，卵母細(xì)胞被顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GCs)群體包圍，在卵泡形成過程中，GCs群體分化為壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。壁層顆粒細(xì)胞排列在卵泡壁上，CCs更接近卵母細(xì)胞。成熟的卵冠丘復(fù)合物(cumulus-oocyte complex，COCs)由次級卵母細(xì)胞和周圍的CCs組成，CCs具有高度特異性的跨帶胞質(zhì)突觸，穿透透明帶并在其頂端與卵母細(xì)胞形成縫隙連接，這種密切的聯(lián)系使CCs能夠發(fā)揮重要作用，支持卵母細(xì)胞的成熟，并向卵母細(xì)胞傳遞內(nèi)分泌和其他環(huán)境信號[3]。

以往研究提示，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中患者的卵泡液內(nèi)檢測到可溶型HLA-G(sHLA-G)[4]。Dumesic等[5]也證明成熟的COCs培養(yǎng)上清內(nèi)可檢測到sHLA-G，可能是優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志，有助于選擇最佳受精卵以減少培養(yǎng)和移植的胚胎數(shù)量。卵泡液以及COCs上清液中的HLA-G很可能來源于最接近卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞，通過其特異的免疫作用調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，并可能影響胚胎的發(fā)育著床。本研究旨在檢測人卵丘細(xì)胞HLA-G分子及其各亞型的表達(dá)，探究HLA-G分子在卵泡發(fā)育和卵子成熟中的可能作用。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年12月至2020年3月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心行輔助生殖技術(shù)助孕治療的不孕癥患者的卵丘細(xì)胞。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)獲取的卵細(xì)胞全部行卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)；(2)女性患者卵巢功能正常(因輸卵管因素或男方因素行輔助生殖治療)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性患者卵巢功能異常：卵巢功能低下或多囊卵巢綜合征；(2)已知的子宮縱膈、宮腔粘連或?qū)m腔畸形患者；(3)直徑在4 cm以上的子宮肌瘤，或粘膜下肌瘤，或嚴(yán)重突向?qū)m腔的肌壁間肌瘤等可能影響著床和胚胎發(fā)育者；(4)染色體異常、免疫性不孕、子宮內(nèi)膜炎、遺傳疾病、其他系統(tǒng)慢性疾病、其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病等。

共收集10例符合標(biāo)準(zhǔn)的不孕癥患者的卵丘細(xì)胞。所有樣本均在征得患者知情同意下進(jìn)行采集，其使用和處理均按中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會相關(guān)管理監(jiān)督條例及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，取得倫理委員會決議(第S2019-296-01號)同意。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：人卵丘細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)；免疫熒光染色用Triton X-100、BSA(北京碧云天)、DAPI(Sigma，美國)；微滴式數(shù)字PCR中AMPure XP Beads(Beckman，美國)、KAPA library amplification kit(Thermo，美國)、QubitTMdsDNA HS Assay Kit(Invitrogen，美國)。

2.儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)；微滴式數(shù)字PCR儀(Bio-Rad，美國)；Qubit(Thermo，美國)。

三、研究方法

1.樣本收集：收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者的卵丘細(xì)胞。取卵完成后，將收集到的COCs加入透明質(zhì)酸酶，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，將卵母細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，收集剩余的卵丘細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液混勻。將混勻后的細(xì)胞懸液離心，棄除上清液，加入適量PBS，再次離心后，棄上清。收集沉淀的卵丘細(xì)胞，一部分保存于PCR管中，加入PBS保存于-80℃，留待微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)檢測；另一部分加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至激光共聚焦培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，留作免疫熒光共聚焦染色。

2.卵丘細(xì)胞內(nèi)HLA-G的免疫熒光染色：顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞生長情況，若細(xì)胞呈梭形貼壁生長，密度均勻，則可開始進(jìn)行免疫熒光染色。(1)細(xì)胞固定透化：PBS洗滌卵丘細(xì)胞后，室溫下4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再次PBS洗滌。含有0.2%Triton X-100的PBS孵育樣品，棄Triton，PBS洗滌細(xì)胞。(2)封閉和免疫染色：1%BSA-PBS孵育細(xì)胞后吸去液體風(fēng)干。1%BSA-PBS稀釋一抗(1∶100)。共聚焦皿中滴加一抗(陰性對照為不含一抗的稀釋液)，4℃冰箱孵育過夜。室溫靜置30 min復(fù)溫，倒出溶液，將細(xì)胞在PBS中清洗3次。加入1%BSA-PBS 稀釋的二抗(1∶500)，黑暗中PBS清洗細(xì)胞3次，滴加DNA染色劑(DAPI)上避光孵育細(xì)胞，再次用PBS清洗細(xì)胞2次。于激光共聚焦顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞內(nèi)HLA-G分子的表達(dá)及其所在位置分布，并進(jìn)行圖像采集。

3.微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)測定卵丘細(xì)胞內(nèi)HLA-G mRNA水平：(1)逆轉(zhuǎn)錄：參照kit說明程序配置逆轉(zhuǎn)錄體系，直接裂解細(xì)胞、進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄，所得的cDNA溶液置于-20℃保存。利用AMPure XP beads和磁力架重復(fù)純化2次，室溫風(fēng)干去掉殘留乙醇。加入Low-TE Buffer留取上清液純化后cDNA待用。(2)第一步PCR：進(jìn)行第1輪 PCR反應(yīng)，向PCR反應(yīng)溶液中加入DNase/RNase-free water和AMPure XP beads，再次行DNA純化，吸取上清液待用。(3)Qubit定量：取Qubit assay tubes分別標(biāo)記#1、#2以及待檢測的樣本編號，同時將Qubit dsDNA HS Standard #1及Qubit dsDNA HS Standard #2渦旋混勻離心。將Qubit dsDNA HS Reagent以Qubit dsDNA HS Buffer按1∶200稀釋，配成Qubit檢測工作液。向Qubit assay tubes#1和#2中分別加入Qubit檢測工作液，向其余標(biāo)記樣本編號的離心管中分別加入Qubit檢測工作液。再向標(biāo)記#1、#2的離心管中加入對應(yīng)的Qubit dsDNA HS Standard #1及Qubit dsDNA HS Standard #2；向標(biāo)記各樣本編號的離心管中加入對應(yīng)DNA樣本，混勻后離心，將各樣本離心管分別置于Qubit 2.0 Fluorometer中讀數(shù)，計算樣本濃度。(4)EvaGreen-ddPCR定量：按照Qubit定量結(jié)果將樣品梯度稀釋至2 pg/μl，在伯樂液滴生成儀中生成液滴，轉(zhuǎn)移至96孔板，置于封膜儀封膜。再次運(yùn)行PCR程序，將完成擴(kuò)增的PCR板置于QX200閱讀儀中，進(jìn)行液滴信號閱讀。

基因引物序列：在第1輪PCR中，正向引物位于外顯子1，反向引物跨越外顯子5和6，從而可以擴(kuò)增出所有的HLA-G mRNA亞型。在第2輪ddPCR中，設(shè)計了跨越相鄰兩個外顯子之間的引物，以分別區(qū)分每個HLA-G mRNA亞型，即G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7。另外設(shè)計了一套引物，用于同時擴(kuò)增HLA-G的所有亞型(Pan HLA-G)。引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增HLA-G mRNA亞型的PCR引物

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、HLA-G在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)分布

利用免疫熒光染色技術(shù)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示：HLA-G蛋白于人卵丘細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)均有分布(圖1)。

藍(lán)色為卵丘細(xì)胞核DAPI染色；綠色為HLA-G染色；Merge為兩種波長熒光疊加結(jié)果。圖1 激光共聚焦顯微鏡下人卵丘細(xì)胞內(nèi)HLA-G的表達(dá)

二、ddPCR檢測卵丘細(xì)胞中HLA-G 各亞型mRNA表達(dá)差異

ddPCR檢測人卵丘細(xì)胞內(nèi)HLA-G各亞型絕對定量表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HLA-G3表達(dá)量最多，HLA-G4次之，HLA-G6表達(dá)量最少。其中HLA-G3和HLA-G4與其他各亞型相比均有顯著差異(P<0.05)；膜結(jié)合型HLA-G總體表達(dá)量顯著高于可溶型HLA-G(P<0.001)(表2，圖2)。

表2 ddPCR檢測人卵丘細(xì)胞中HLA-G亞型絕對定量表達(dá)水平(-±s)

A：HLA-G各亞型表達(dá)水平。與其他亞型比較，*P<0.05；B：膜結(jié)合型HLA-G與可溶型HLA-G表達(dá)水平。與可溶型比較，#P<0.001。圖2 ddPCR檢測卵丘細(xì)胞中HLA-G亞型表達(dá)

討 論

成功妊娠有兩個關(guān)鍵因素：一是母體對胎兒的免疫耐受，二是早期胚胎的發(fā)育和著床。盡管近年來輔助生殖技術(shù)的發(fā)展迅速，但臨床妊娠率卻難以達(dá)到顯著提高。對于卵母細(xì)胞的優(yōu)選目前存在諸多方法：(1)評估卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的類固醇激素[6]；(2)形態(tài)良好和不良的卵母細(xì)胞之間的線粒體分布和ATP水平[7]；(3)卵泡的血管形成[8]；(4)測量膜完整性[9]；(5)營養(yǎng)物質(zhì)攝取[10]。這些技術(shù)中大部分具有侵入性，需要特定儀器和豐富經(jīng)驗的操作者，并且與卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量相關(guān)性較低，存在許多局限性。尋找合適的生物標(biāo)志物來評估高質(zhì)量的卵母細(xì)胞以及胚胎具有很高的必要性。

卵丘細(xì)胞及其分泌物的檢測作為間接評估卵母細(xì)胞質(zhì)量的手段具有可行性。卵母細(xì)胞與相鄰的卵丘細(xì)胞之間的雙向信號交換對卵母細(xì)胞的能力獲得、早期胚胎發(fā)育和卵丘的擴(kuò)張具有重要意義，卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的代謝合作已經(jīng)被確定為卵母細(xì)胞成熟的決定因素[11-12]。卵丘細(xì)胞在排卵后仍與卵母細(xì)胞保持松散聯(lián)系，在卵母細(xì)胞離開卵巢的過程中繼續(xù)支持卵母細(xì)胞[13]。此外，卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞的質(zhì)量在胚胎著床過程中也起著重要作用，研究表明卵丘細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子和前列腺素也可調(diào)節(jié)胚胎著床過程中的血管生成等過程[14]。

免疫微環(huán)境對卵母細(xì)胞發(fā)育質(zhì)量有著重要影響。正常女性卵子中的顆粒細(xì)胞表達(dá)MHC Ⅰ和Ⅱ類分子，而在自身免疫性卵巢衰竭患者中觀察到負(fù)責(zé)免疫反應(yīng)的激活MHC Ⅱ類抗原調(diào)節(jié)增加[15]。Rizzo等[4]在卵泡液中檢測到可溶型HLA-G(sHLA-G)的濃度高于其他人體體液，Borgatti等[16]也發(fā)現(xiàn)sHLA-G可能是優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志物。因此，卵泡液內(nèi)HLA-G分子的產(chǎn)生可能與抑制自身免疫反應(yīng)的機(jī)制相關(guān)，維持卵泡免疫微環(huán)境的細(xì)胞因子平衡狀態(tài)，影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而間接影響胚胎發(fā)育著床過程。而卵泡液中sHLA-G極可能來源于最接近卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。最新研究通過相對定量PCR和免疫印記技術(shù)證實(shí)了卵丘細(xì)胞中確實(shí)存在HLA-G的表達(dá)[17]，但對于HLA-G亞型的表達(dá)情況還未見相關(guān)研究報道。

本研究利用共聚焦免疫熒光技術(shù)和微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測卵丘細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中HLA-G分子的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了HLA-G各亞型在卵丘細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平差異。不同于傳統(tǒng)的相對熒光定量PCR(RT-PCR)法，數(shù)字PCR是無需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量檢測，具有更高的檢測靈敏度和數(shù)據(jù)精密度[18]，能更直觀精確地比較出HLA-G各亞型的表達(dá)量。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G3及HLA-G4表達(dá)水平顯著高于其他亞型，二者均為膜結(jié)合型，而各可溶型HLA-G表達(dá)普遍低于膜結(jié)合型HLA-G。因此HLA-G3和HLA-G4可能在卵丘細(xì)胞中發(fā)揮更為主要的作用。

絨毛和蛻膜HLA-G亞型的表達(dá)不盡相同。HLA-G3、HLA-G4和HLA-G7 mRNA在胎盤中很少存在，HLA-G5存在于整個胎盤中以及絨毛膜、蛻膜和母血中，可識別HLA-G2/-G6的抗體顯示，在胎盤絨毛遠(yuǎn)端的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、浸潤蛻膜的滋養(yǎng)層細(xì)胞和一些絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞可見其表達(dá)[19]。HLA-G1與β2-微球蛋白結(jié)合的HLA-G5和HLA-G2/G6僅存在于細(xì)胞滋養(yǎng)層柱的前緣和蛻膜中的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞[20]；HLA-G5在滋養(yǎng)層細(xì)胞亞群中普遍存在，可以作為游離重鏈由細(xì)胞滋養(yǎng)層前體干細(xì)胞和胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層產(chǎn)生，或與輕鏈β2-微球蛋白結(jié)合，由絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生[20]。

不同于母-胎界面，卵丘細(xì)胞表達(dá)的HLA-G亞型主要為HLA-G3和HLA-G4，其在卵丘細(xì)胞中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索。本實(shí)驗研究了HLA-G及其亞型在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)，為了解HLA-G在卵母細(xì)胞生殖發(fā)育中的作用提供了新的發(fā)現(xiàn)。