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      建立重癥狼瘡性腎炎模型并探索其與足細胞蛋白nephrin、P-cadherin的相關性

      2022-04-17 08:37:30王晨林栩唐志明韋美理吳昱升王蓉
      右江醫(yī)學 2022年3期
      關鍵詞:狼瘡性腎炎

      王晨 林栩 唐志明 韋美理 吳昱升 王蓉

      【摘要】 目的 建立重癥MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)動物模型,并對模型成功與否進行驗證,進一步探索狼瘡性腎炎與足細胞蛋白nephrin、P-cadherin的相關性。

      方法 將實驗動物分為三組:空白組、模型組和脂多糖組??瞻捉M為雌性C57小鼠8只,模型組及脂多糖組為雌性MRL/lpr小鼠各8只,其中脂多糖組腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),空白組及模型組每周注射等量生理鹽水。20周后檢測小鼠尿蛋白,處死動物,收集各組小鼠腎組織。蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察小鼠腎臟組織。RT-qPCR和Western blot檢測腎組織中nephrin、P-cadherin的mRNA及蛋白表達。

      結果 與空白組相比,模型組小鼠尿蛋白升高,腎臟病理損傷嚴重;與模型組相比,LPS組小鼠尿蛋白升高,腎臟損傷進一步加重;此外腎組織中nephrin、P-cadherin表達水平在三組間逐步下降(P<0.01)。

      結論 用 LPS腹腔注射的 MRL/lpr小鼠可誘導加重狼瘡,且狼瘡性腎炎的嚴重程度與 nephrin及P-cadherin相關。

      【關鍵詞】 狼瘡性腎炎;細菌脂多糖;足細胞損傷;nephrin;P-cadherin

      中圖分類號:R692?? 文獻標志碼:A?? DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2022.03.001

      Establishment of a model of severe lupus nephritis and exploration of its correlation with podocyte proteins nephrin and P-cadherin

      WANG Chen, LIN Xu▲, TANG Zhiming, WEI Meili, WU Yusheng, WANG Rong

      (Nephrology Department of Affiliated Hospital, Guangxi Key Laboratory of Basic Medical Research Support for Immune Related Diseases,Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi, China)

      【Abstract】 Objective To establish the animal model of severe MRL/lpr mouse lupus nephritis (LN), and to verify the success of the model, so as to further explore correlation between LN and nephrin and P-cadherin of podocyte proteins.

      Methods Experimental animals were divided into three groups: blank group, model group and lipopolysaccharide group. There were 8 female C57 mice in the blank group, 8 female MRL/lpr mice in the model group and 8 female MRL/lpr mice in the? lipopolysaccharide group, the lipopolysaccharide group were injected intraperitoneally with lipopolysaccharide (LPS), while the blank group and the model group were injected with the same amount of normal saline every week. After 20 weeks, the urine proteins of mice were detected, the animals were killed, and the renal tissues of mice in each group were collected. And then, hematoxylin-eosin staining (HE) was used to observe the renal tissues of mice, and RT-qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expressions of nephrin and P-cadherin in renal tissues.

      Results Compared with the blank group, the urinary proteins in the model group increased and the pathological damage of kidney was serious; compared with the model group, the urinary proteins in the LPS group increased, and the renal injury was further aggravated. In addition, the expression levels of nephrin and P-cadherin in renal tissues decreased gradually among the three groups(P<0.01).

      Conclusion MRL/lpr mice injected intraperitoneally with LPS can induce and aggravate lupus, and the severity of lupus nephritis is related to nephrin and P-cadherin.

      【Key words】 LN; LPS; podocyte injury; nephrin; P-cadherin

      狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡整體發(fā)病率及死亡率高的主要危險因素,且維持臨床狼瘡患者的腎功能至關重要。狼瘡性腎炎臨床上以免疫抑制劑治療為主,缺乏特異性。有研究指出Ⅰ型狼瘡性腎炎及Ⅱ型狼瘡性腎炎不需特殊治療,Ⅲ型及Ⅳ型則需要免疫治療,而Ⅴ型及Ⅵ型的治療方案則仍然存在爭議。因此,針對不同類型的狼瘡開發(fā)個性化療法,進一步完善治療方案,改善狼瘡病人的生存質量非常必要。同時nephrin作為足細胞標志蛋白,其表達的變化反映足細胞損傷輕重程度,P-cadherin則參與足細胞上皮間質轉化影響腎小球硬化的進程。故本研究使用脂多糖(LPS)建立重癥狼瘡模型,探究狼瘡與足細胞損傷的相關性,為進一步探討其發(fā)病機制,建立狼瘡的治療框架提供理論支持。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物

      8周齡 MRL/lpr 雌性小鼠(B6.MRL Faslpr/Nju)16只及C57BL/6雌性小鼠8只(SPF級,上海斯萊克公司)。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準。

      1.2 實驗試劑

      LPS(美國Sigma),尿蛋白試劑盒(南京建成),TRIzol Reagent(invitrogen),BeyoRTTMIIcDNA第一鏈合成試劑盒(D7168M),引物(上海生工),引物序列見表1。RIPA(強)、PMSF、BCA試劑盒(碧云天),P-cadherin抗體(13773-1-AP),nephrin抗體(ab216341),β-actin抗體(66009-1-lg)。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 小鼠模型制備

      將MRL/lpr小鼠隨機分成 2組, LPS組每周腹腔注射LPS(1 mg/kg),模型組及空白組腹腔每周注射生理鹽水。

      1.3.2 組織病理學分析造模

      12周后取小鼠腎臟,固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水、透明、封片,光學顯微鏡下觀察腎臟切片病理變化并拍照。

      1.3.3 腎功能檢測

      給藥最后一周用代謝籠收集小鼠尿液,尿蛋白試劑盒檢測尿蛋白。

      1.3.4 qRT-PCR檢測

      (1)TRIzol抽提RNA,測定A260/280及RNA 濃度,RNA純度均在1.8~2.0之間。(2)取2.5 μg總RNA反轉錄合成cDNA, 具體操作按照碧云天逆轉錄試劑盒說明書進行。(3)LightCycler96實時熒光定量PCR儀進行擴增。(4)數(shù)據(jù)處理:以GAPDH作為內參,檢測P-cadherin、nephrin的mRNA表達,以2-△△CT法計算兩者mRNA相對表達量。

      1.3.5 Western blot法檢測

      (1)提取蛋白質:收集處理好的各實驗組小鼠腎臟,加入裂解液及蛋白酶抑制劑30分鐘,12 000 g離心10分鐘后提取總蛋白。(2)BCA法測定蛋白濃度。(3)取蛋白加入上樣緩沖液煮沸10分鐘后,進行電泳、轉膜、封閉、一抗二抗孵育。稀釋比例為nephrin(1∶1000)、P-cadherin(1∶1000)、 GAPDH(1∶20 000)抗體,二抗(1∶6000)。(4)顯影:利用Image J軟件進行半定量分析。

      1.4 統(tǒng)計學方法

      統(tǒng)計圖表用 Graph Pad Prism 8.0繪制。用Excel 建立數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用(±s)表示,多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVE),兩兩比較選擇LSD-t分析法,檢驗水準:α=0.05,雙側檢驗。

      2 結? 果

      2.1 小鼠外形的觀察

      實驗期間每天觀察小鼠精神及身體狀態(tài),空白組小鼠進食正常,精神狀態(tài)好,體重持續(xù)增長。模型鼠體重前期正常增長,12周齡后體重不增反降,毛發(fā)有部分脫落,一些小鼠出現(xiàn)明顯的紅斑樣病變,LPS組出現(xiàn)如圖1所示頸部、腋下等全身多處淋巴結腫大。

      2.2 HE染色

      結果顯示:對照組小鼠腎臟結構清晰,未見增生和炎癥細胞浸潤。模型組出現(xiàn)輕度的腎小球系膜細胞增生,伴有少量淋巴細胞浸潤。LPS組鏡下觀則有腎小球細胞明顯增大,且有大量淋巴細胞浸潤。見圖2。

      2.3 尿蛋白水平

      尿蛋白檢測結果顯示,各組與空白組相比,尿蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。模型組小鼠尿蛋白與空白組相比有增長趨勢(P<0.001)。LPS組小鼠注射 LPS后,尿蛋白含量較模型組相比有明顯增長趨勢(P<0.001)。如下表2、圖3所示。

      2.4 RT-PCR檢測P-cadherin、nephrin的mRNA的表達

      各組與空白組相比,P-cadherin、nephrin的mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);與模型組比較,LPS組足細胞蛋白P-cadherin、nephrin明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖4。

      2.5 Western blot法檢測P-cadherin、nephrin蛋白的表達

      與空白組比較,其余兩組P-cadherin、nephrin蛋白表達均降低(P<0.0001),與模型組比較,LPS組P-cadherin、nephrin蛋白表達進一步降低(P<0.05)。各組蛋白電泳圖及柱狀分析圖見圖5。

      3 討? 論

      MRL/lpr小鼠是一種自發(fā)性狼瘡模型鼠,約20周齡可自發(fā)狼瘡性腎炎。其腎炎表現(xiàn)與人類相似,是較為常用的狼瘡模型。本研究采用自發(fā)性狼瘡小鼠MRL/lpr作為輕型模型組,LPS誘導 MRL/lpr 小鼠產(chǎn)生重型狼瘡性腎炎,并檢測三組間nephrin及P-cadherin的表達,探討LN是否發(fā)生足細胞損傷,且足細胞損傷是否與狼瘡病情的發(fā)展有相關性。

      MRL/lpr小鼠缺點是個體差異大,不能保證發(fā)病情況的同一性。LPS是革蘭陰性菌的外膜成分,其中脂A是最具生物活性的部分,是內毒素和主要毒力因子,起促進感染過程的核心作用。脂多糖組以LPS加快 MRL/lpr小鼠狼瘡發(fā)病進程,與不注射LPS的模型組小鼠相比腎臟病變更加統(tǒng)一,尿蛋白水平顯著升高,腎臟病理炎性改變明顯,狼瘡足細胞相關蛋白表達減少,且隨著狼瘡病情的加重可進一步下降。這表明足細胞損傷是狼瘡性腎炎發(fā)病機制之一,且與病情的發(fā)展密切相關;足細胞的損傷是LN進展的原因之一,可通過減少足細胞的損傷延緩狼瘡性腎炎的發(fā)展。

      足細胞是腎小球濾過屏障(glomerular filtration barrier,GFB)的基本成分,在其特殊分子和電荷特性中起著重要作用。足細胞的結構完整及功能正常對于腎臟維持正常的生理功能至關重要。腎小球疾病患者往往與足細胞損傷相關。足細胞損傷在狼瘡性腎炎前期的發(fā)病過程中就可能起到至關重要的作用。研究表明足細胞裂孔蛋白nephrin可以激活整合素β1,影響足細胞與細胞外基質的附著,從而使足細胞丟失和腎小球基底膜剝脫,最終導致慢性腎臟病。為了進一步探討狼瘡分子水平的發(fā)病機制,在建立輕重狼瘡模型的基礎上我們進一步將足細胞相關蛋白nephrin納入研究范疇,以期發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎進展的分子基礎。

      同時腎小球的硬化也是腎臟疾病需要關注的一大方向,延緩腎小球的硬化對于改變狼瘡病人的預后有著舉足輕重的作用。上皮間充質轉換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)即上皮細胞失去上皮細胞的特征,獲得間充質細胞的特征。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)P-cadherin是乳腺癌發(fā)生中一個重要的臨床預后因素和可能的治療靶點,可以作為EMT的標志物。Jagge/Notch等多種途徑信號通路可誘導糖尿病腎病中足細胞EMT發(fā)生。臨床研究證明Jagge/Notch在狼瘡病人足細胞中的表達可能是蛋白尿和腎小球硬化發(fā)展的共同(下游)途徑。足細胞屬于一種上皮細胞,在受外界損傷性刺激時會發(fā)生足細胞上皮間充質轉化。足細胞EMT發(fā)生后,nephrin、podocin、ZO-1表達下調,縫隙橫膈膜(slit diaphragm,SD)改變,肌動蛋白細胞骨架重新排列,2型EMT是從E-cadherin到N-cadherin的轉換,不同于2型EMT的是,足細胞EMT上皮樣表型標志蛋白P-cadherin會轉變?yōu)镹-cadherin,也是導致腎小球硬化的重要病理機制。本研究通過PCR和Western blot考察裂孔蛋白nephrin與跨膜蛋白P-cadherin的表達情況,進一步驗證狼瘡與足細胞損傷及腎小球硬化的相關性。

      本研究LN模型成功建立證明MRL/lpr小鼠模型具備面部紅斑等典型癥狀及淋巴結腫大、腎小球病變等臨床特征。且使用LPS誘導MRL/lpr小鼠建立LN模型在加重小鼠狼瘡病情同時可確保發(fā)病時機一致,減少狼瘡重癥造模過程中小鼠的意外死亡??梢詾長N發(fā)病機制及臨床治療研究提供良好的前期基礎,同時本研究將足細胞損傷及狼瘡性腎炎聯(lián)系起來,進一步探索發(fā)現(xiàn)足細胞相關蛋白nephrin及P-cadherin參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病機制,且與病情進展一致,可作為LN疾病進展的標志,為狼瘡性腎炎的治療提供了靶點,針對足細胞相關蛋白的治療可以應用于臨床狼瘡的治療,也可作為預后分析指標對臨床用藥起指示作用,為新的特異性藥物的研發(fā)提供了指導作用。

      參 考 文 獻

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      (收稿日期:2021-10-21 修回日期:2021-12-11)

      (編輯:梁明佩)

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